Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering och kvantifiering av Epstein-Barr-virus från P3HR1-cellinjen

Published: September 28, 2022 doi: 10.3791/64279
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

Summary

Detta protokoll tillåter isolering av Epstein-Barr-viruspartiklar från den mänskliga P3HR1-cellinjen vid inducering av den virala lytiska cykeln med phorbol 12-myristate 13-acetat. DNA extraheras därefter från viruspreparatet och utsätts för PCR i realtid för att kvantifiera den virala partikelkoncentrationen.

Abstract

Epstein-Barr-viruset (EBV), formellt betecknat som humant herpesvirus 4 (HHV-4), är det första isolerade humana tumörviruset. Nästan 90-95% av världens vuxna befolkning är smittad av EBV. Med de senaste framstegen inom molekylärbiologi och immunologi har tillämpningen av både in vitro - och in vivo-experimentella modeller gett djup och meningsfull inblick i patogenesen av EBV i många sjukdomar såväl som i EBV-associerad tumorigenes. Syftet med detta visualiserade experimentpapper är att ge en översikt över isoleringen av EBV-viruspartiklar från celler i P3HR1-cellinjen, följt av kvantifiering av viruspreparatet. P3HR1-celler, ursprungligen isolerade från ett humant Burkitt-lymfom, kan producera ett P3HR1-virus, vilket är en typ 2 EBV-stam. Den EBV-lytiska cykeln kan induceras i dessa P3HR1-celler genom behandling med phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA), vilket ger EBV-viruspartiklar.

Med hjälp av detta protokoll för isolering av EBV-partiklar odlas P3HR1-celler i 5 dagar vid 37 ° C och 5% CO2 i komplett RPMI-1640-medium innehållande 35 ng / ml PMA. Därefter centrifugeras odlingsmediet med en hastighet av 120 x g i 8 minuter för att pelletera cellerna. Den virushaltiga supernatanten samlas sedan upp och snurras ner med en hastighet av 16 000 x g i 90 minuter för att pelletera EBV-partiklarna. Viruspelleten återsuspenderas sedan i ett komplett RPMI-1640-medium. Detta följs av DNA-extraktion och kvantitativ realtids-PCR för att bedöma koncentrationen av EBV-partiklar i preparatet.

Introduction

Epstein-Barr-viruset (EBV) är det första humana tumörviruset som har isolerats1. EBV, formellt kallad Human herpesvirus 4 (HHV-4)2, är en del av underfamiljen gamma herpesvirus i herpesvirusfamiljen och är prototypen för släktet Lymphocryptovirus. Nästan 90-95% av världens vuxna befolkning är smittade av viruset3. I de flesta fall inträffar initial infektion inom de första 3 åren av livet och är asymptomatisk, men om infektion inträffar senare under tonåren kan det ge upphov till en sjukdom som kallas infektiös mononukleos4. EBV kan infektera vilande B-celler som inducerar dem att bli proliferativa B-lymfoblaster där viruset etablerar och upprätthåller ett latent infekterat tillstånd5. EBV kan återaktiveras när som helst och därmed leda till återkommande infektioner6.

Under de senaste 50 åren har sambandet mellan vissa virus och utvecklingen av mänskliga maligniteter blivit allt tydligare, och idag uppskattas att 15% till 20% av alla mänskliga cancerformer är relaterade till virusinfektioner7. Herpesvirus, inklusive EBV, är några av de bäst studerade exemplen på dessa typer av tumörvirus8. Faktum är att EBV kan orsaka många typer av mänskliga maligniteter, såsom Burkitt lymfom (BL), Hodgkin lymfom (HL), diffust storcelligt B-cellslymfom och lymfoproliferativa sjukdomar hos immunkomprometterade värdar 9,10. EBV har också visat sig vara associerat med utvecklingen av systemiska autoimmuna sjukdomar. Några exempel på dessa autoimmuna sjukdomar är reumatoid artrit (RA), polymyosit-dermatomyosit (PM-DM), systemisk lupus erythematosus (SLE), blandad bindvävssjukdom (MCTD) och Sjögrens syndrom (SS)11. EBV är också associerat med utvecklingen av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD)12.

Många av dessa sjukdomar kan studeras eller modelleras med hjälp av cellodling, möss eller andra organismer som är infekterade med EBV. Det är därför EBV-partiklar behövs för att infektera celler eller organismer, oavsett om de är in vitro- eller in vivo-modellerna 13,14,15,16, därav behovet av att utveckla en teknik som möjliggör isolering av viruspartiklar till en låg kostnad. Protokollet som beskrivs här ger riktlinjer för ett enkelt sätt att på ett tillförlitligt sätt isolera EBV-partiklar från en relativt tillgänglig cellinje och att kvantifiera partiklarna med hjälp av PCR i realtid, vilket är kostnadseffektivt och lättillgängligt för de flesta laboratorier. Detta i jämförelse med flera andra metoder som har beskrivits för att isolera EBV från olika cellinjer17,18,19,20.

P3HR-1 är en BL-cellinje som växer i suspension och är latent infekterad med en EBV typ 2-stam. Denna cellinje är en EBV-producent och kan induceras för att producera viruspartiklar. Målet med detta manuskript är att visa upp en metod som möjliggör isolering av EBV-partiklar från P3HR-1-cellinjen, följt av kvantifiering av virusstammen som senare kan användas för både in vitro och in vivo EBV-experimentella modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: EBV bör betraktas som ett potentiellt biofarligt material och bör därför hanteras under biosäkerhetsnivå 2-inneslutning eller högre. En labbrock samt handskar ska bäras. Om det finns risk för exponering för stänk bör ögonskydd också övervägas. Följande procedur bör utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp.

1. Räkna P3HR1-cellerna

  1. Centrifugering och återsuspenderande celler
    1. Överför cellsuspensionen från en 100 mm odlingsplatta (eller T-25-kolv) av en pågående P3HR1-cellodling vid 80% sammanflöde till ett 15 ml koniskt rör. Såningstätheten för P3HR-1-celler är 1 x 106 celler / ml. Håll i komplett RPMI-odlingsmedium (79% RPMI-odlingsmedium, 20% Fetal Bovine Serum, 1% Pen-Strep-antibiotikum) vid 37 ° C och 5% CO2 och passera var 3-4: e dag.
    2. Centrifugera i 8 min vid 120 x g. Efter centrifugering, kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 1 ml komplett RPMI-odlingsmedium och blanda väl (denna lösning kommer att kallas suspension A).
  2. Förbereda cellsuspensionen för räkning
    1. Bered en utspädd cellsuspension B genom att blanda 2 μl cellsuspension A med 8 μl odlingsmedium. Tillsätt 10 μl 0,4 % trypanblå till suspension B för att få suspension C. Blanda preparatet väl genom försiktig pipettering.
  3. Räkna celler med hjälp av en hemocytometer
    1. Placera en glasöverdragare på hemocytometern och ladda 10 μL suspension C. Placera hemocytometern under ett ljusmikroskop och räkna antalet celler som inte är färgade blå i var och en av de fyra kvadranterna i hemocytometerkammaren med hjälp av 40x mikroskopmålet (Figur 1).
    2. Trypan blå fläckar döda celler blå; Räkna inte dessa celler eller celler som vidrör någon av de övre, nedre, högra eller vänstra gränserna för varje hemocytometerkvadrant.
    3. Beräkna koncentrationen av celler per ml med följande formel:
      Equation 1
      OBS: Antalet räknade kvadranter är fyra och 10-4 ml är volymen på rutorna på hemocytometern. De fyra kvadranter som ska räknas är representerade i grönt i figur 1. Totalt antal celler som räknas i formeln är summan av antalet celler i kvadranterna 1, 2, 3 och 4. Celler som representeras i blått i figur 1 ska räknas, medan celler i rött inte ska räknas eftersom de vidrör kvadrantens övre, högra, nedre eller vänstra kant.

Figure 1
Figur 1: Cellräkning med hjälp av en hemocytometerkammare. Fyra kvadranter räknas med hjälp av ett ljusmikroskop; Dessa kvadranter är representerade i grönt. Totalt antal celler räknat i formeln som anges i steg 1.3.3 i protokollet som beskrivs här är summan av antalet celler i kvadranterna 1, 2, 3 och 4. Celler som anges i blått bör räknas, medan celler i rött inte ska räknas eftersom de rör vid kvadrantens övre, högsta, nedre eller vänstra kant Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Förbereda plattan för odling

  1. Placera en volym cellsuspension A i ett 15 ml koniskt rör. Vilken volym som krävs beror på cellantalet. Justera volymen så att antalet celler är ungefär 2,2 x 106 celler för en 100 mm odlingsplatta.
  2. Tillsätt 5 ml komplett odlingsmedium till röret och överför sedan rörets innehåll till en 100 mm odlingsplatta. Tillsätt 80 μl dimetylsulfoxid (DMSO) till odlingsplattan.
    OBS: DMSO är ljuskänsligt, därför bör det förvaras i en ljusbeständig behållare eller täckas med ett ogenomskinligt material som aluminiumfolie.
  3. Tillsätt 350 μl 1 mg/ml phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) till röret. Den slutliga koncentrationen av PMA bör vara 35 ng/ml och koncentrationen av DMSO bör vara 0,08 %.
    VARNING: PMA är giftigt, frätande och cancerframkallande, därför bör det hanteras med stor försiktighet. PMA är ljuskänsligt, därför bör det förvaras i en ljusbeständig behållare eller täckas med ett ogenomskinligt material som aluminiumfolie.
  4. Tillsätt 4,27 ml odlingsmedium så att den totala volymen är 10 ml. Blanda innehållet i röret genom att luta och överför sedan innehållet till en 100 mm odlingsplatta. Lämna plattan i en cellodlingsinkubator i 5 dagar vid 37 °C, 5%CO2.

3. Induktion och isolering av Epstein-Barr-viruspartiklar

  1. Efter 5 dagar i inkubatorn centrifugerar du innehållet i plattan vid 120 x g i 8 minuter för att pelletera cellerna. Samla den cellfria, virusinnehållande supernatanten och kassera cellpelleten.
  2. Centrifugera supernatanten vid 16 000 x g i 90 minuter vid 4 °C för att pelletera viruspartiklarna. Kassera supernatanten och återsuspendera viruspelleten i 5 ml odlingsmedium.
    OBS: Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan användas för att återsuspendera viruspelleten istället för odlingsmediet.
  3. Alikvotera virussuspensionen erhållen i 20 rör, var och en innehållande 250 μl av virussuspensionen. Förvara suspensionen vid -80 °C.

4. DNA-extraktion från viruspartiklar

VARNING: Extrem försiktighet bör iakttas vid hantering av fenol, eftersom det är giftigt och frätande och har förmågan att orsaka allvarliga brännskador. Fenol är ljuskänsligt och oxiderar vid kontakt med ljus eller luft. Förvara den i en ljusbeständig behållare eller alternativt täck fenolröret med ett ogenomskinligt material som aluminiumfolie.

  1. Separation av proteiner från DNA
    1. Tillsätt 500 μl TrisCl-mättad fenol till ett av 250 μl-rören. Tillsätt 100 μl vatten (för att öka volymen av vattenfasen) och virvelbrunnen för att erhålla en rosa emulsion. Centrifugera i 15 min vid 9650 x g.
  2. DNA-utfällning
    1. Samla supernatanten (transparent, vattenhaltig fas) och överför den till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
    2. Tillsätt motsvarande 1/10 av supernatantens volym kallt natriumacetat (3 M, pH 5,2) och blanda genom pipettering upp och ner. Tillsätt 1 μl 20 mg/ml glykogen och blanda genom pipettering.
      OBS: Detta steg är valfritt, men tillsatsen av glykogen förbättrar DNA-utfällningen och gör det lättare att visualisera DNA-pelleten.
    3. Tillsätt tre gånger supernatantens volym kall 100% etanol. Förvaras vid -80 °C över natten.
      OBS: Proceduren kan stoppas här för att återupptas vid ett senare tillfälle. Provet kan förvaras vid -80 °C i 1 timme, alternativt över natten. Lagring över natten förbättrar DNA-nederbörden och rekommenderas därför.
  3. Isolera viralt DNA
    1. Centrifugera följande dag vid 9650 x g i 15 minuter vid 4 °C och kassera supernatanten för att erhålla en DNA-pellet.
    2. Tvätta pelleten tre gånger med 1 ml kall 70% etanol, centrifugera vid 9650 x g i 15 min och kassera supernatanten.
    3. Lufttorka pelleten i ca 10 min. Återsuspendera pelleten i 10-50 μl nukleasfritt destillerat vatten (beroende på DNA-pelletens storlek).
    4. Förvara proverna vid -20 °C för senare bearbetning eller vid 4 °C över natten för att säkerställa maximal DNA-upplösning följt av förvaring vid -20 °C. Alternativt kan du fortsätta direkt med steg 5.

5. Kontrollera DNA-koncentration och renhet

  1. Efter rengöring av piedestalen på en mikrospektrofotometer med en känslig uppgiftstorkare, ladda 1 μL av DNA-preparatet.
  2. Observera koncentrationen av DNA i provet. Kontrollera absorbansförhållandena vid både Equation 2 och Equation 3. DNA absorberas vid 260 nm, proteiner vid 280 nm och organiska ämnen som fenol absorberas vid 230 nm. Ett förhållande på 1,8-2 anses vara tillräckligt för PCR i realtid.

6. Kvantifiering genom polymeraskedjereaktion i realtid

  1. Framställning av PCR-reaktionsblandningarna
    1. Placera 5 μL av en SYBR-grön PCR-blandning i realtid i 0,2 ml PCR-rör. Tillsätt till varje rör 1 μl 7,5 pmol/μL framåtprimer och 1 μl 7,5 pmol/μL omvänd primer. Framåtriktad primersekvens: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; omvänd primersekvens: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. Genen som förstärks för att bestämma EBV-genomkopieringsnumret är Epstein-Barr-virusets lilla RNA 2 (EBER-2) - gen.
    2. Tillsätt 2 μl nukleasfritt vatten och 1 μl viralt DNA från steg 4 till ett av rören. Den totala volymen av reaktionsblandningen är 10 μl.
      OBS: Beroende på koncentrationen av DNA i provet kan ett utspädningssteg behövas. Utspädningsfaktorn F bör noteras och kommer att integreras i formeln i steg 6.3.
    3. Förbered andra rör som kommer att användas som standarder med kända EBV-genomkopieringsnummer (1000, 2000, 5000, 10 000 och 54 000 exemplar).
  2. Kör PCR-blandningarna och börja med ett första aktiveringssteg vid 95 °C i 5 minuter, därefter 40 cykler vid 95 °C och 58 °C (glödgning) i 15 s respektive 30 s.
  3. Generera en qPCR-standardkurva genom att plotta Ct-värdena för standarderna mot loggen över antalet EBV-genomkopior per standardrör. Med hjälp av standardkurvdiagramekvationen härleds antalet EBV-genomkopior i PCR-röret som innehåller det inducerade virala DNA: t. Använd sedan följande formel för att beräkna koncentrationen av det inducerade viruspreparatet:
    Equation 4
    Där X är antalet EBV-genomkopior härledda från standardkurvan och F är utspädningsfaktorn som används för att ställa in det DNA som används per PCR-reaktion.

7. Kontroll av viruspartiklarnas biologiska aktivitet/smittsamhet

  1. Överför BC-3-celler från en 100 mm odlingsplatta vid 80% sammanflöde till ett 15 ml koniskt rör. Såningstätheten för P3HR-1-celler är 1 x 106 celler / ml. Håll i komplett RPMI-odlingsmedium (79% RPMI-odlingsmedium, 20% Fetal Bovine Serum, 1% Pen-Strep-antibiotikum) vid 37 ° C och 5% CO2 och passera var 3-4: e dag.
  2. Räkna BC-3-cellerna på samma sätt som P3HR-1-cellerna räknades genom att följa steg 1. Till en 96-brunnsplatta, tillsätt 105 BC-3-celler till varje brunn. Använd tre, sex, nio eller 12 brunnar för att säkerställa resultatens betydelse och minimera fel.
  3. Tillsätt en volym virusbuljong till varje brunn, beroende på koncentrationen av viruspreparatet som bestäms i steg 6.3. MOI kan variera, och optimering av detta protokoll kommer att avslöja den bästa MOI för infektion (ett MOI-intervall på 2-50 rekommenderas). Se till att den totala volymen av blandningen som finns i varje brunn är 250 μl.
    1. För att bestämma den erforderliga volymen bör koncentrationen av virusbeståndet vara känd och en MOI bör väljas. Till exempel, om MOI är 2, bör antalet tillsatta viruspartiklar vara dubbelt så många celler. Beräkna volymen V av det virusbestånd som krävs med formeln: Equation 5, där n är antalet viruspartiklar som behövs och C den kända koncentrationen av virusbeståndet
  4. Inkubera innehållet i 96-brunnsplattan i 5 dagar. Efter 5 dagar, överför innehållet i varje brunn till ett 1,5 ml rör.
  5. Centrifugera rören vid 120 x g i 8 minuter för att separera cellerna från det virusinnehållande odlingsmediet. Utsätt cellpellets såväl som supernatanterna för DNA-extraktion följt av PCR-kvantifiering i realtid för att kontrollera förekomsten av virala genom i varje fraktion, vilket bedömer smittsamheten hos viruspartiklarna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Målet med denna procedur är att isolera EBV-partiklar i en suspension med känd viral titer, som sedan kan användas för att modellera EBV-infektion. Därför är det av yttersta vikt att använda optimala koncentrationer av de olika reagenserna för att erhålla det högsta EBV-utbytet ur förfarandet.

En optimeringsstudie utfördes för att bestämma koncentrationerna av PMA och DMSO som skulle ge det högsta antalet EBV-partiklar (figur 2). En DMSO-koncentration på 0,8 % och en PMA-koncentration på 35 ng/μl var optimala och resulterade i höga EBV-koncentrationer. Koncentrationen av viruspartiklar erhållna från optimeringsprotokollet var 917 471 viruspartiklar/μl.

Figure 2
Figur 2: EBV DNA-kopior/ml erhållna vid induktion av P3HR-1-celler med phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA). P3HR-1-celler (105 celler) odlades ensamma eller inducerades med olika koncentrationer av PMA och DMSO med hjälp av protokollet som beskrivs här. Felstaplarna anger standardavvikelsen. En students t-test utfördes där PMA/PMA och DMSO-behandlade celler jämfördes med kontrollceller; * anger p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

För att detta protokoll ska anses vara effektivt bör steg 6 avslöja en rimlig koncentration av viruspartiklar, och steg 7 bör visa att dessa viruspartiklar verkligen är smittsamma. BC-3-cellinjen som används i steg 7 är EBV-negativ, så vid kvantifiering av EBV-genomkopieringsnumren i negativa kontroller (som inte utsattes för detta protokoll) bör inget EBV-DNA detekteras.

EBV-DNA bör emellertid detekteras i både cellerna och odlingsmediet i experimentbrunnarna (som utsattes för detta protokoll), av följande skäl: EBV som infekterar BC-3-celler kommer att replikeras inuti dessa celler, vilket står för det faktum att EBV-DNA kommer att detekteras i cellpelleten och vid replikation kommer BC-3-celler att kasta viruspartiklar till utsidan; således kommer EBV-DNA att detekteras i odlingsmediet supernatant (efter DNA-extraktion).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Produktionen av EBV-partiklar är nödvändig för att förstå biologin hos detta virus såväl som dess associerade sjukdomar. Här beskrev vi produktionen av dessa partiklar från P3HR-1-cellinjen. Denna cellinje är inte den enda EBV-producentlinjen; i själva verket har EBV-partiklar också isolerats från B95-8-celler21,22 samt Raji-cellinjen18,19. EBV-lytiska cykeln har inducerats i dessa celler med n-butyrat. Alternativt kan phorbolestrar såsom 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA), även känd som phorbol 12-myristate-13-acetat (PMA), användas. Sammantaget kan protokollet som beskrivs här användas med hjälp av dessa celler istället för P3HR-1-linjen. B95-8-linjen härleddes dock från en bomullstopptamarin (Saguinus oedipus) som för närvarande klassificeras som en kritiskt hotad primatart23; Därför säljs denna linje sällan av leverantörer med begränsningar för försäljning och frakt. En licens krävs också enligt konventionen om internationell handel med utrotningshotade arter av vilda djur och växter (CITES) för alla beställningar utanför Storbritannien. Medan Raji-cellinjen är kommersiellt tillgänglig, förekommer inte syntesen av replikativt viralt DNA och produktionen av viralt kapsidantigen (VCA) i dessa celler efter induktion av kemikalier24,25. Dessa kan emellertid lätt induceras genom komplementering efter superinfektion med EBV isolerad från P3HR-1-celler20.

På grund av frånvaron av en direkt plackanalys för uppräkning av EBV-partiklar26, förlitade vi oss på en polymeraskedjereaktion i realtid. Det finns andra kvantifieringsmetoder som kan fungera lika bra för vårt syfte, såsom immunofluorescens eller PCR som använder fluorescerande sonder som kan erbjuda förbättrad specificitet. Valet av PCR i realtid med hjälp av genomkopieringsstandarder baseras på det faktum att detta är lättillgängligt för de flesta laboratorier, mindre mödosamt, mindre tekniskt utmanande och mer kostnadseffektivt27. Därför skulle andra kvantifieringsmetoder kunna fungera lika bra och kan användas baserat på tillgänglighet och erfarenhet.

Ett av de mest kritiska stegen i protokollet som beskrivs här är plätering av celler i steg 2.1 och sådd med ett cellnummer inom det intervall som rekommenderas för plattans storlek. Ett lågt antal celler ger en låg koncentration av viruspartiklar, medan ett stort antal celler skulle tränga plattan, hämma tillväxten och replikationen av celler och därmed bromsa virusets lytiska cykel. Det är därför extrem försiktighet bör iakttas när man räknar cellerna i steg 1, beräknar den erforderliga volymen suspension A och slutligen pläterar cellerna i steg 2.

En begränsning av protokollet är antagandet att en kopia av EBV-genomet motsvarar en viruspartikel. Även om detta antagande är troligt, kan det inte detekteras med denna analys om sådana partiklar är defekta eller ofullständiga. Eftersom det inte finns några plackbildningsanalyser för EBV som det finns för många andra virus, är DNA-extraktion följt av PCR i realtid fortfarande en accepterad metod för att kvantifiera viruspreparatet. En annan begränsning är att viruset induceras från en kontinuerlig däggdjurscellinje som kan ackumulera mutationer vid många omgångar av passering. Sådana mutationer kan påverka själva viruset, vilket eventuellt kan leda till förändrade in vivo- eller ex vivo-egenskaper hos viruset. En potentiell lösning skulle vara att regelbundet sekvensera det cellulära och virala genomet. Alternativt kan celler kasseras efter några passager och odlingen kan startas om på nytt från ett flytande kvävelagrat cellprov med ett lågt antal tidigare passager. Det är också värt att notera att EBV-partiklarna erhållna från P3HR-1-cellinjen saknar EBNA2-antigenet, vilket vanligtvis uttrycks i B-lymfocyter som är latent infekterade med EBV, som en del av sex virala kärnproteiner totalt28. EBNA2-proteinet aktiverar promotorerna av gener som uttrycker proteiner associerade med typ III av EBV-latens. Nya studier har dock visat att EBNA2-bristfällig EBV kan bilda tumörer hos CBH-möss, och att P3HR-1-cellinjen därför förblir en användbar modell av EBV-positiva lymfom29. Å andra sidan kan EBV från P3HR-1-celler användas för att studera de roller som EBNA2 spelar medan man använder en EBNA2-positiv EBV som kontroll. Sammanfattningsvis har EBV erhållen från en kontinuerlig P3HR-1-cellinje ett betydande forskningsvärde; det kan användas för att studera biologi, smittsamhet, virulens, liksom många andra egenskaper hos EBV.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Finansiering för detta arbete stöddes av bidrag till ER från Asmar Research Fund, Libanesiska nationella rådet för vetenskaplig forskning (L-CNRS) och Medical Practice Plan (MPP) vid American University of Beirut.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL thin-walled PCR tubes Thermo Scientific AB0620 Should be autoclaved before use
0.2-10 µL Microvolume Filter Tips Corning 4807 Should be autoclaved before use
0.5-10 µL Pipette BrandTech 704770
10 mL Disposable Serological Pipette Corning 4488
1000 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-112-1000-Q
100-1000 µL Pipette Eppendorf 3123000063
100x20 mm Cuture Plates Sarstedt 83.1802
10-100 µL Pipette BrandTech 704774
15 mL Conical Tubes Corning 430791
200 µL Filtered Pipette Tips QSP TF-108-200-Q
20-200 µL Pipette Eppendorf 3123000055
50 mL Conical Tubes Corning 430828
CFX96 Real-Time C-1000 Thermal Cycler Bio-Rad 184-1000
DMSO Amresco 0231
DNase/RNase Free Water Zymo Research W1001-1
EBER Primers Macrogen N/A Custom Made Primers
EBV DNA Control (Standards) Vircell MBC065
Ethanol (Laboratory Reagent Grade) Fischer Chemical E/0600DF/17
Fetal Bovine Serum Sigma F9665
Fresco 21 MicroCentrifuge Thermo Scientific 10651805
Glycogen Solution Qiagen 158930
Hemocytometer BOECO BOE 01
Inverted Light Microscope Zeiss Axiovert 25
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5121
Microcentrifuge Tube Costar (Corning) 3621 Should be autoclaved before use
P3HR-1 Cell Line ATCC HTB-62
Penicillin-Streptomycin Solution Biowest L0022
Phenol VWR 20599.297
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139
Pipette Filler Thermo Scientific 9501
Precision Wipes Kimtech 7552
RPMI-1640 Culture Medium Sigma R7388
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030
Sodium Acetate Riedel-de Haën (Honeywell) 25022
Spectrophotomer DeNovix DS-11
Tris-HCl Sigma T-3253
Trypan Blue Solution Sigma T8154
Water Jacketed CO2 Incubator Thermo Scientific 4121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
  2. Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. Journal of Virology. 64 (9), 4084-4092 (1990).
  3. Chang, M. S., Kim, W. H. Epstein-Barr virus in human malignancy: a special reference to Epstein-Barr virus associated gastric carcinoma. Cancer Research and Treatment. 37 (5), 257-267 (2005).
  4. Manet, E. Encyclopedia of Cancer. Schwab, M. , Springer. Berlin Heidelberg. 1602-1607 (2017).
  5. Babcock, G. J., Decker, L. L., Volk, M., Thorley-Lawson, D. A. EBV persistence in memory B cells in vivo. Immunity. 9 (3), 395-404 (1998).
  6. Khan, G., Miyashita, E. M., Yang, B., Babcock, G. J., Thorley-Lawson, D. A. Is EBV persistence in vivo a model for B cell homeostasis. Immunity. 5 (2), 173-179 (1996).
  7. Jha, H. C., Banerjee, S., Robertson, E. S. The role of gammaherpesviruses in cancer pathogenesis. Pathogens. 5 (1), 18 (2016).
  8. El-Sharkawy, A., Al Zaidan, L., Malki, A. Epstein-Barr virus-associated malignancies: roles of viral oncoproteins in carcinogenesis. Frontiers in Oncology. 8, 265 (2018).
  9. Vereide, D., Sugden, B. Insights into the evolution of lymphomas induced by Epstein-Barr virus. Advances in Cancer Research. 108, 1-19 (2010).
  10. Vereide, D. T., Sugden, B. Lymphomas differ in their dependence on Epstein-Barr virus. Blood. 117 (6), 1977-1985 (2011).
  11. Houen, G., Trier, N. H. Epstein-Barr virus and systemic autoimmune diseases. Frontiers in Immunology. 11, 587380 (2020).
  12. Ortiz, A. N., et al. Impact of Epstein-Barr virus infection on inflammatory bowel disease (IBD) clinical outcomes. Revista Espanola de Enfermedades Digestivas. 114 (5), 259-265 (2021).
  13. Caplazi, P., et al. Mouse models of rheumatoid arthritis. Veterinary Pathology. 52 (5), 819-826 (2015).
  14. Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
  15. Warde, N. Experimental arthritis: EBV induces arthritis in mice. Nature Reviews Rheumatology. 7 (12), 683 (2011).
  16. Jog, N. R., James, J. A. Epstein Barr virus and autoimmune responses in systemic lupus erythematosus. Frontiers in Immunology. 11, 623944 (2020).
  17. Shimizu, N., Yoshiyama, H., Takada, K. Clonal propagation of Epstein-Barr virus (EBV) recombinants in EBV-negative Akata cells. Journal of Virology. 70 (10), 7260-7263 (1996).
  18. Hsu, C. H., et al. Induction of Epstein-Barr virus (EBV) reactivation in Raji cells by doxorubicin and cisplatin. Anticancer Research. 22, 4065-4071 (2002).
  19. Nutter, L. M., Grill, S. P., Li, J. S., Tan, R. S., Cheng, Y. C. Induction of virus enzymes by phorbol esters and n-butyrate in Epstein-Barr virus genome-carrying Raji cells. Cancer Research. 47 (16), 4407-4412 (1987).
  20. Fresen, K. O., Cho, M. S., zur Hausen, H. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  21. Glaser, R., Tarr, K. L., Dangel, A. W. The transforming prototype of Epstein-Barr virus (B95-8) is also a lytic virus. International Journal of Cancer. 44 (1), 95-100 (1989).
  22. Sairenji, T., et al. Inhibition of Epstein-Barr virus (EBV) release from P3HR-1 and B95-8 cell lines by monoclonal antibodies to EBV membrane antigen gp350/220. Journal of Virology. 62 (8), 2614-2621 (1988).
  23. Savage, A., et al. An assessment of the population of cotton-top tamarins (Saguinus oedipus) and their habitat in Colombia. PLoS one. 11 (12), 0168324 (2016).
  24. Kallin, B., Klein, G. Epstein-Barr virus carried by raji cells: a mutant in early functions. Intervirology. 19 (1), 47-51 (1983).
  25. Fresen, K. O., Cho, M. S., Hausen, H. Z. Recovery of transforming EBV from non-producer cells after superinfection with non-transforming P3HR-1 EBV. International Journal of Cancer. 22 (4), 378-383 (1978).
  26. Bounaadja, L., Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Evaluation of Epstein-Barr virus, human herpesvirus 6 (HHV-6), and HHV-8 antiviral drug susceptibilities by use of real-time-PCR-based assays. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1244-1246 (2013).
  27. Buelow, D., et al. Comparative evaluation of four real-time PCR methods for the quantitative detection of Epstein-Barr virus from whole blood specimens. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (4), 527-534 (2016).
  28. Wu, D. Y., Kalpana, G. V., Goff, S. P., Schubach, W. H. Epstein-Barr virus nuclear protein 2 (EBNA2) binds to a component of the human SNF-SWI complex, hSNF5/Ini1. Journal of Virology. 70 (9), 6020-6028 (1996).
  29. Li, C., et al. EBNA2-deleted Epstein-Barr virus (EBV) isolate, P3HR1, causes Hodgkin-like lymphomas and diffuse large B cell lymphomas with type II and Wp-restricted latency types in humanized mice. PLoS Pathogens. 16 (6), 1008590 (2020).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 187
Isolering och kvantifiering av Epstein-Barr-virus från P3HR1-cellinjen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S.,… More

Bitar, E. R., Shams Eddin, M. S., Rahal, E. A. Isolation and Quantification of Epstein-Barr Virus from the P3HR1 Cell Line. J. Vis. Exp. (187), e64279, doi:10.3791/64279 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter