Summary
本协议描述了为小鼠胸腺内注射建立的介入放射学程序，以避免开放手术的风险并提高盲经皮注射的准确性。
Abstract
小鼠模型中的胸腺内注射是研究胸腺和免疫功能（包括遗传和获得性T细胞疾病）的重要技术。这需要将试剂和/或细胞直接沉积到活小鼠胸腺中的方法。传统的胸腺内注射方法包括胸外科或微创经皮盲注，这两种方法都有明显的局限性。超高频超声成像装置使图像引导经皮注射在小鼠中成为可能，大大提高了经皮注射方法的注射精度，并使注射目标更小成为可能。然而，图像引导注射依赖于集成轨道系统的利用，这使得这是一个严格且耗时的过程。本文介绍了一种独特、安全、高效的小鼠经皮胸腺内注射方法，消除了对轨道系统注射的依赖。该技术依赖于使用高分辨率微超声单元对小鼠胸腺进行无创成像。使用徒手技术，放射科医生可以在超声指导下将针尖直接放入小鼠胸腺中。在成像前清洁和麻醉小鼠。对于擅长超声引导程序的经验丰富的放射科医生来说，所述技术的学习期很短，通常在一个会话内。该方法对小鼠的发病率和死亡率较低，并且比目前的经皮注射机械辅助技术快得多。它使研究者能够有效地对任何大小的胸腺（包括非常小的器官，如老年或免疫缺陷小鼠的胸腺）进行精确可靠的经皮注射，而对动物的压力最小。如果需要，该方法可以注射单个叶，并且由于该程序的省时性质，有助于大规模实验。
Introduction
胸腺在T细胞发育和免疫中起着至关重要的作用。T细胞缺乏症可由胸腺退化，遗传性疾病，感染和癌症治疗等因素引起，导致高死亡率和发病率1，2。小鼠模型在基础和转化免疫学研究中都是必不可少的，几十年来一直用于研究胸腺生物学和T细胞发育，以及为患有胸腺功能障碍和T细胞缺陷的患者开发治疗方法3，4，5。
胸腺研究的核心部分是心腺内注射生物材料，如小鼠模型6，7，8，9，10，11，12中的细胞，基因或蛋白质。传统的胸腺内注射方法使用开胸术，然后在直接可视化下进行胸腔内注射或通过“盲”经皮注射到纵隔。手术方法会显著增加气胸风险等。此外，该手术期间升高的压力会导致免疫抑制，从而可能损害免疫学数据13。经验丰富的研究人员经过一些实践，可以执行盲注射技术，但这种方法不太准确，因此将实验对象限制在胸腺大的年轻小鼠身上。
超声引导的使用已被引入，作为传统胸腺内注射方法的精确和微创替代方案14。但是，当使用集成轨道系统而不是徒手技术时，此过程非常耗时。使用进样支架进行进样需要借助各种附件（如探头支架和支架、X、Y 和 Z 定位系统）对换能器进行仔细的成像优化和定位，以及熟练操作显微操作控制和导轨系统扩展。这里介绍了一种简单的替代技术，即超声引导胸腺注射，由放射科医生使用徒手方法15进行，这是上述方法的快速和准确的微创替代方案。重要的是，目前的方法可以使用任何高分辨率超声成像系统执行，而无需注射安装和集成导轨系统。它对于需要注射大量小鼠11的研究，涉及注射两个胸腺叶的实验，或用于在老年，辐照或免疫功能低下的小鼠中准确注射小胸腺12特别有用。
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Protocol
所有程序均按照发现与创新中心的动物护理指南（IACUC协议290）进行。对于本研究，C57BL / 6小鼠（雌性，4-6周龄），C57BL / 6小鼠（雌性，6个月大），J：NU雌性小鼠，NOD scid γ（NSG）雌性小鼠和B6;分别以CAG-luc、-GFP小鼠为幼鼠模型、老年小鼠模型、无胸腺裸体模型、免疫缺陷模型和生物发光细胞源。小鼠是从商业来源获得的（见 材料表）。这个过程通常需要两个人（一个在进行注射时保持无菌，另一个处理小鼠）。
1. 动物制备
- 使用3%-4%异氟烷气体诱导小鼠麻醉，并使用通过鼻锥和精密校准蒸发器施用的1%-3%异氟烷气体维持麻醉（参见材料表）。
- 通过对后爪捏伤无反应来确认适当的麻醉深度/无意识。
- 通过涂抹一层薄薄的脱毛膏少于1分钟，从小鼠的前胸部区域去除皮毛。使用湿纸巾将奶油与松散的皮毛一起完全去除。
注意：涂抹过多的乳霜会导致胸部皮肤发炎。 - 一次将一只小鼠仰卧在小动物超声成像站的加热平台上（见 材料表），鼻锥就位（图1）。
- 在后肢和前肢用医用胶带将鼠标固定到载物台上（图1）。
- 在双眼涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
- 使用葡萄糖酸氯己定涂抹器对无毛皮的上胸皮肤进行消毒（见 材料表）。
2.超声机和无菌场的准备
- 激活可用的最高频率线性探针，通常是与被成像动物的大小具有最高空间分辨率的探针。通过点击启动屏幕后的相应按钮来激活探头。
注意：对于小鼠的这种应用，使用的探针专门设计用于小鼠和小鼠（参见 材料表）。 - 按照以下步骤优化成像和注射的超声设置。
- 通过调整屏幕右侧的垂直方向滑块，将视野深度调整为目标动物的适当大小（图2）。对于年轻小鼠，最大深度设置通常约为6-8毫米。
- 通过沿屏幕底部的水平条滑动按钮来调整灰度增益（图2）。目标是从比典型的“灰色”外观略暗的图像开始。
- 将焦点区域（屏幕右侧的蓝色箭头， 图2）调整到胸腺的预期水平。对于年轻小鼠，这将在4毫米左右的深度。
- 如果需要图像捕获，请测试存储图像和存储剪辑按钮的功能，以确保在整个过程中可以适当地保存图像。通过点击屏幕右下角的“保存剪辑”按钮或点击“冻结”按钮，然后点击“保存图像”（图2）来执行此操作。
- 将少量（~1 mL）超声凝胶直立在换能器表面（见 材料表）上，放在超声机支架上或助手手中。
- 在加热平台旁边准备一个小的无菌场。为此，最佳定位通常是在平台和超声机之间。
- 将这些物品倒入无菌区域：无菌探头盖，橡皮筋，无菌手套和无菌超声凝胶（见 材料表）。
- 设置无菌区域并放置物品后，戴上无菌手套。
- 小心地将无菌探头盖放在超声换能器上（以及最初放在探头上的凝胶上）。保持无菌，只接触无菌盖，别无他物。将无菌橡皮筋滑过无菌探头盖以将其固定到位。
注意：无论大小，气灶都会干扰超声成像。因此，必须在换能器和无菌探头盖之间以及探头盖顶部应用超声凝胶，以确保超声探头和动物之间的无空气界面。 - 将适量（2-3 mL）无菌超声凝胶滴在换能器上。
注意：用户现在已准备好对麻醉鼠标进行映像。
3. 胸腺成像和定位
- 在保持无菌的同时，将超声凝胶顶探头垂直放置在小鼠前胸壁的消毒部分进行初始成像。
- 花点时间查看超声图像并进一步优化。返回到步骤 2.2 并进行调整以获得类似于 图 3 的外观。
- 在横向平面上扫描鼠标的前胸部。为此，垂直握住换能器，并以画笔状或“扫荡”的动作将其从颈部上下移动到腹部。
注意：心脏将是胸部最容易识别的结构，因为它的快速运动和“腔室”外观。一旦心脏定位，这可以用作获取胸腺图像的参考点。 - 使心脏以视野为中心，将换能器稍微向颈部扫过。胸腺仅次于心脏，通常会遇到胸腺。
- 将胸腺可视化为双叶，锥体，低回声（屏幕上出现的“黑暗”或“黑色”）结构，该结构位于中线中心，主动脉前方和胸骨后部（图3A）。
- 记下上胸部两侧的两个圆形成对的黑色（即“低回声”）结构。
注意：这些是双侧腔静脉。主动脉是位于两个腔静脉之间的中线的类似曲线低回声结构。这些很容易通过它们的脉动运动来识别。
4. 胸腺注射
- 如果需要，在换能器上涂抹更多（2-3 mL）无菌超声凝胶。
注意：换能器上相对大量的无菌凝胶（与小鼠胸部的大小相比）将充当小鼠胸壁周围的“凝胶垫”。这将减少视野内空气产生的超声波伪影的数量。 - 使用超声探头，定位胸腺的最宽部分，这通常是理想的注射目标部位。预测所选位置的水平指针轨迹。
- 注意主要血管（SVC和主动脉）在该部位的位置。在注射过程中避免这些。
- 血管将是低回声、脉动结构，如步骤3.7所述。如果不确定，请使用彩色多普勒模式检查血管内的血流（图4A）。通过点击屏幕上 的颜色按钮激活 彩色多普勒模式。
- 如果预计其中一条主要血管（或心脏）将沿着预期的针头轨迹，请选择新的目标区域或找到不同的方法/轨迹。
- 一只手握住换能器，另一只手拿着30 G胰岛素针（见 材料表），注射10μL。
注意：注射液将根据实验设计而有所不同。本研究使用磷酸盐缓冲盐水、台盼蓝或D-荧光素（0.1 μg/ 10 μL）。 - 要开始注射过程，请横向移动换能器，使胸腺在超声视野中偏离中心。确保视野的另一侧主要由超声凝胶组成，没有其他内容。
- 将针尖放在换能器下方的凝胶中，慢慢移动针头，直到它靠近皮肤表面（图4B）。
- 在超声下连续成像针头的同时，将针头以经皮轨迹插入胸腺，远离血管。
- 使用“十字胸腺”水平轨迹将针尖放置在入口部位对侧的胸腺叶中。这解释了沿针道的潜在泄漏（图5A）。
- 一旦针尖进入胸腺的所需部分，在使用超声可视化的同时，从 30 G 注射器中快速注射内容物（例如 10 μL 台盼蓝或 D-荧光素，0.1 μg/10 μL）。
- 为了在针头插入和注射过程中稳定注射器，请将注射器夹在拇指和食指之间，并用食指控制注射器柱塞。
- 将所有内容物沉积后取出针头。
5. 动物注射后监测
- 将动物转移到空笼子中并观察，直到它恢复足够的意识以维持胸骨卧位。
注意：预计从麻醉中完全恢复将在 2 分钟内发生。 - 再监测动物 10 分钟是否有痛苦、呼吸困难或出血的迹象。
注意：预计不会有注射后疼痛，通常不需要注射后镇痛。 - 一旦完全康复并经过平静的注射后观察期，将注射的动物送回其他动物的陪伴下。
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Representative Results
该技术的成功实施依赖于要遵循的几个关键步骤。首先，必须确保胸腺本身的可靠识别。在年轻小鼠中，由于腺体的尺寸很大，这很简单（图3A）。在老年小鼠或免疫缺陷小鼠中，它可能更具挑战性;但是，使用现代超声设备仍然非常可行（图3B，C）。其次，设置针头轨迹至关重要，以便在针尖穿过胸壁层并进入胸腺的过程中连续可视化。成功的注射将使针头在前进时完全可视化。这可确保操作者确保针头没有穿过关键结构，例如心脏、主动脉或下腔静脉之一（图 4）。这也适用于注射本身。在注射过程中，针尖必须始终在其目标位置可视化，以便确认胸腺内沉积（图5）。
存在一些小陷阱，如果认识到这些陷阱，可以相对容易地减轻。当将鼠标固定在载物台和鼻锥上时，鼠标的胸部需要尽可能中立（即，没有明显的向左或向右旋转）。如果胸部旋转太多，针的正确“接近角”可能不容易实现。此外，如果鼠标固定得不够紧，它在尝试推进针头时可能会移动或滑动，从而扭曲解剖结构并使可视化变得困难。然而，通过适当的技术和制备，可以实现成功的胸腺内注射，具有一致性、可靠性和重现性。
注射完成后，有多种方法可以确认注射的胸腺内位置。本研究使用荧光素作为荧光素酶转基因小鼠的注射剂。然后可以在注射后立即通过生物发光成像评估这些，确认注射的正确位置而不会牺牲动物（图6A）。该技术还有一个额外的优点，即注射的荧光素标记的细胞可以在多个时间点成像，确保胸腺中活性的持久性。或者，可以将台盼蓝作为注射部位的视觉标志物注射，然后可以通过尸检16离体确认注射精度（图6B）。
图1：位于胸腺超声检查成像台上的麻醉小鼠。 将胸部脱毛的6周龄雌性C57BL / 6小鼠麻醉并转移到成像站。鼠标处于仰卧位置，伸出的腿用胶带固定。 请点击此处查看此图的大图。
图2：超声机设置。 超声波机器控制面板（触摸屏）的图像。优化成像设置的主要调整将是调整深度（红色箭头）、焦点区域（黄色圈出）和增益（红色星号）。 请点击此处查看此图的大图。
图3：免疫功能正常和免疫缺陷的年轻和老年小鼠胸腺的超声成像。 （A）免疫功能正常的年轻小鼠（C57BL / 6，雌性，4周龄，n = 5）。横超声视图显示胸腺的右叶和左叶（星号）。（B）免疫功能正常的老年小鼠（C57BL / 6，雌性，6个月大，n = 5）。胸腺（星号）较小，但保持其典型位置和金字塔形状。（C）免疫缺陷的年轻小鼠（NOD scid γ，雌性，4周龄，n = 5）。请注意，与正常的年轻小鼠相比，胸腺（星号）的尺寸要小得多。（D）无胸腺裸鼠（雌性，8周龄，n = 1）。胸腺组织完全不存在。值得注意的是，图像中间的深色（低回声）垂直线（星号）是胸骨的阴影伪影，没有真正的胸腺组织。 请点击此处查看此图的大图。
图4：准备注射 。 （A）前胸的彩色多普勒图像显示了胸腺与纵隔血管的关系。底部中心是主动脉弓（红色箭头），两侧的圆形血管是左右上腔静脉（黄色箭头）。流向成像探头的血液以红色编码，从换能器流出的血液以蓝色编码。（B）从左侧入路进入胸部之前放置针头。针尖（黄色箭头）必须与超声换能器对齐，尖端必须与胸腺中部齐平。 请点击此处查看此图的大图。
图5：注射技术 。 （A）针头放置用于注射免疫功能正常的年轻小鼠的右胸腺叶。针尖（黄色箭头）位于右叶的中央部分。（B）右叶的注射后图像，显示注射部位的暗（低回声）液体和小的明亮（回声）气泡（红色虚线）。黄色箭头表示针尖。（C）针头放置（针尖上的黄色箭头）用于注射免疫功能正常的年轻小鼠的左胸腺叶。（D）针头放置（黄色箭头）用于注射免疫功能正常的年轻小鼠的右叶。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：体内和离体内准确性验证 。 （A）将D-荧光素（0.1μg/ 10μL）注射到8周龄荧光素酶转基因小鼠的胸腺中，然后使用体内生物发光成像系统（n = 3）进行1秒的体内生物发光成像。颜色编码显示了总生物发光辐射度（光子·s−1·cm−2·球面度−1），如右侧颜色条所示。（B）将两只5周龄C57BL/6小鼠的胸腺注射台盼蓝，尸检证明注射精度（n = 3）。上图：台盼蓝染色原位注射胸腺的背表面。下图：注射左叶后台盼蓝染色胸腺的腹面。经塔克特等人许可转载1。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
超声引导徒手注射是一种高度准确的技术，以高效和无菌的方式将研究材料输送到胸腺。在注射部位对皮肤进行初始灭菌后，由于使用了无菌手套、无菌超声探头盖和无菌超声凝胶，因此在手术过程中保持无菌。与盲经皮入路10，17或依靠手术切口直接观察胸腺18，19（这是小鼠胸腺内注射的常用方法）相比，使用徒手超声引导结合了高度的安全性和快速性以及极高的手术精度。使用轨道平台14进行超声引导注射提供了类似的安全性和准确性水平，但是这种繁琐的方法通常从小鼠被麻醉并定位在成像平台上的那一刻起每次注射至少需要5分钟，相比之下，徒手技术使专家可以在每只小鼠15的大约20-30秒内完成注射。
丰富的经验和培训是在所有各种胸腺内注射方法（包括超声引导的徒手注射技术）中达到高熟练水平的先决条件。然而，具有超声引导程序临床经验的放射科医生可以在 1 小时的练习过程中精通小鼠的胸腺内注射。
徒手进样方法的灵活性允许研究者根据研究的具体实验需求，在一次进样中注射一个胸腺叶、两个胸腺叶，或在两次单独的进样中注射两个胸腺叶。值得注意的是，与研究材料相比，用安慰剂注射单个胸腺叶可以作为一种策略，通过使用安慰剂注射的叶作为内部对照来减少所需的研究对象数量。相比之下，集成导轨系统的刚性设置允许在每个注射周期注入一个胸腺叶。注射第二个叶需要卸下注射器支架附件，将其安装在鼠标的反面，并仔细调整显微操作控制，直到针头的轨迹正确，然后才能进行下一次注射。这些问题大大增加了麻醉暴露和完成实验所需的时间。
与盲目胸腺内注射程序相比，徒手超声胸腺内注射方法的一个独特优势是相对容易准确地注射小胸腺，例如老年小鼠（6个月或以上）的胸腺，其尺寸比年轻小鼠（4-10周龄）小得多。这一优势与易于放大相结合，使免疫学家能够在广泛的临床前小鼠模型中进行基于胸腺内注射的研究。
总之，这些观察结果提供了充足的证据，支持徒手技术用于针对单个胸腺叶的安全、快速和精确注射。因此，这种微创方法代表了胸腺研究的高效和准确的选择，促进了胸腺从大到极小的小鼠的大规模临床前研究。
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Disclosures
作者没有任何利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们要感谢Raymond H. Thornton在这项技术上的深刻而全面的早期工作。这项研究由美国国家癌症研究所（NCI 1R37CA250661-01A1），儿童白血病研究协会，哈肯萨克子午线医学院和HUMC基金会/解决儿童癌症资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aquasonic 100 Ultrasound Gel | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA) | 01-01 | Sterile Ultrasound Transmission Gel |
| B6;CAG-luc, -GFP mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 025854 | Bioluminescence cell source |
| BD Insulin Syringes with needle | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 328431 | Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G |
| C57BL/6 mouse - aged | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 6 months old; aged model |
| C57BL/6 mouse - young | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 000664 | age 4-6 weeks; young model |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, USA) | 260449 | chlorhexidine gluconate applicator |
| Curity Cotton Tipped Applicator | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | A5000-2 | Sterile, 6" |
| D-Luciferin | Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA) | LUCK-1G | |
| Isoflurane | Henry Schein (Melville, NY, USA) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, USA) | n/a | In vivo bioluminescence imaging system |
| J:NU mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 007850 | Athymic nude model |
| Kendall Hypoallergenic Paper Tape | Cardinal Health (Dublin, OH, USA) | 1914C | |
| Kimtech Surgical Nitrile Gloves | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA) | 56892 | Sterile Gloves |
| Nair Hair Remover Lotion | Church and Dwight (Trenton, NJ, USA) | n/a | Depilatory agent |
| NOD scid gamma (NSG) mouse | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) | 005557 | Immunodeficient model |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, USA) | 21-040-CV | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Eye ointment |
| Sheathes | Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA) | 10040 | Sterile Ultrasound Probe Covers |
| Sure-Seal Induction Chamber | Braintree Scientific (Braintree, MA, USA) | EZ-17 85 | Anesthesia induction chamber |
| Transducer MX550D | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz) |
| Trypan Blue, 0.4% solution in PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, USA) | 91691049 | |
| Vevo 3100 Imaging System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Ultrasound imaging system |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Version 3.2.7 for imaging and analysis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Tabletop isoflurane-based anesthesia unit |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada) | n/a | Procedural platform |
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