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Biology

Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64321
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 3, 4, 1
1School of Biochemistry and Cell Biology, University College Cork, 2Cancer Research@UCC, University College Cork, 3Centre for Microscopy, Characterisation and Analysis (CMCA), The University of Western Australia, 4Physics Department, Brookhaven National Laboratory

Summary

Este artículo describe el uso de un nuevo y rápido generador de imágenes ópticas para la obtención de imágenes macroscópicas de la vida útil de la fotoluminiscencia de muestras que emiten descomposición larga. Se describen los procedimientos de integración, adquisición de imágenes y análisis, junto con la preparación y caracterización de los materiales del sensor para la obtención de imágenes y la aplicación del generador de imágenes en el estudio de muestras biológicas.

Abstract

Este artículo presenta un nuevo generador de imágenes de vida útil de fotoluminiscencia diseñado para mapear la concentración de oxígeno molecular (O2) en diferentes muestras fosforescentes que van desde recubrimientos de estado sólido sensibles al O2 hasta muestras de tejido animal vivo teñidas con sondas solubles sensibles alO2. En particular, se utilizó la sonda de infrarrojo cercano basada en nanopartículas NanO2-IR, que es excitable con un diodo emisor de luz (LED) de 625 nm y emite a 760 nm. El sistema de imágenes se basa en la cámara Timepix3 (Tpx3Cam) y el adaptador optomecánico, que también alberga un intensificador de imagen. La microscopía de imágenes de por vida de fosforescencia (PLIM) deO2 se requiere comúnmente para varios estudios, pero las plataformas actuales tienen limitaciones en su precisión, flexibilidad general y facilidad de uso.

El sistema presentado aquí es un generador de imágenes rápido y altamente sensible, que se basa en un sensor óptico integrado y un módulo de chip de lectura, Tpx3Cam. Se ha demostrado que produce señales de fosforescencia de alta intensidad y valores estables de vida útil a partir de muestras de tejido intestinal teñido superficialmente o fragmentos teñidos intraluminalmente del intestino grueso y permite el mapeo detallado de los niveles deO2 tisular en aproximadamente 20 s o menos. También se presentan experimentos iniciales sobre la imagen de hipoxia en tumores injertados en animales inconscientes. También describimos cómo se puede reconfigurar el generador de imágenes para su uso con materiales sensibles alO2 basados en colorantes de porfirina Pt utilizando un LED de 390 nm para la excitación y un filtro de paso de banda de 650 nm para la emisión. En general, se encontró que el generador de imágenes PLIM produce mediciones cuantitativas precisas de los valores de vida útil para las sondas utilizadas y los respectivos mapas bidimensionales de la concentración deO2 . También es útil para la obtención de imágenes metabólicas de modelos de tejidos ex vivo y animales vivos.

Introduction

El O2 es uno de los parámetros ambientales clave para los sistemas vivos, y el conocimiento de la distribución delO2 y su dinámica es importante para muchos estudios biológicos 1,2,3. La evaluación de la oxigenación tisular por medio de sondas fosforescentes 4,5,6,7,8 y PLIM 9,10,11,12,13 están ganando popularidad en la investigación biológica y médica 3,9,14,15,16, 17,18,19. Esto se debe a que PLIM, a diferencia de las mediciones de intensidad de fluorescencia o fosforescencia, no se ve afectado por factores externos como la concentración de la sonda, el fotoblanqueo, la intensidad de excitación, la alineación óptica, la dispersión y la autofluorescencia.

Sin embargo, las plataformas actuales de O2 PLIM están limitadas por su sensibilidad, velocidad de adquisición de imágenes, precisión y usabilidad general. El conteo de fotones únicos correlacionados en el tiempo (TCSPC), combinado con un procedimiento de escaneo ráster, se utiliza con frecuencia en dispositivos PLIM y microscopía de imágenes de fluorescencia (FLIM)20,21,22. Sin embargo, dado que PLIM requiere un largo tiempo de permanencia en píxeles (en el rango de milisegundos), el tiempo de adquisición de imágenes es mucho más largo que el requerido para las aplicaciones FLIM20,22,23. Otras técnicas, como las cámaras CCD/CMOS cerradas, carecen de sensibilidad de fotón único y tienen bajas velocidades de cuadro20,24,25,26. Además, los sistemas PLIM existentes se utilizan principalmente en formato microscópico, mientras que los sistemas macroscópicos son menos comunes27.

El generador de imágenes macro PLIM28 basado en TCSPC se creó para superar muchas de estas limitaciones. El diseño del generador de imágenes se vio facilitado en gran medida por el uso de un nuevo adaptador optomecánico, Cricket, que tiene lo siguiente: i) dos adaptadores de montura C, que proporcionan un fácil acoplamiento del módulo de la cámara en la parte posterior y la lente del objetivo en la parte frontal; ii) una carcasa interna para un intensificador de imagen y una toma de corriente para este último en el lado exterior del Cricket; iii) un espacio interno detrás del adaptador frontal de montura C donde se puede alojar un filtro de emisión estándar de 25 mm delante del intensificador; y iv) una óptica de colisión de luz incorporada con reguladores de anillo, que permiten la alineación / enfoque óptico entre la lente y la cámara para producir imágenes nítidas en el chip de la cámara.

En el generador de imágenes ensamblado, el módulo de la cámara está acoplado a la parte posterior del adaptador Cricket, que también alberga un intensificador de imagen que consiste en un fotocátodo seguido de una placa de microcanal (MCP), un amplificador y un centelleador rápido, fósforo P47. Un filtro de emisión de 760 nm ± 50 nm está instalado dentro del Cricket, y una lente objetiva, NMV-50M11'', está conectada al adaptador frontal de montura C. Finalmente, la lente y la cámara están alineadas ópticamente con reguladores de anillo.

El papel del intensificador es detectar fotones entrantes y convertirlos en ráfagas rápidas de luz en el chip de la cámara, que se registran y utilizan para generar decaimientos de emisión e imágenes de por vida. El módulo de cámara comprende una matriz avanzada de sensores ópticos basados en TCSPC (256 píxeles x 256 píxeles) y un chip de lectura de nueva generación 29,30,31,32,33, que permiten el registro simultáneo de la hora de llegada (TOA) y el tiempo sobre umbral (TOT) de ráfagas de fotones en cada píxel del chip de imagen con una resolución de tiempo de 1,6 ns y una velocidad de lectura de 80 Mpixel/s.

En esta configuración, la cámara con el intensificador tiene sensibilidad de fotón único. Está basado en datos y se basa en el sistema de lectura rápida del detector de píxeles (SPIDR)34. La resolución espacial del generador de imágenes se caracterizó previamente con sensores fosforescentes planos deO2 y una máscara de placa de resolución. La función de respuesta del instrumento (IRF) se midió mediante la obtención de imágenes de un sensor fluorescente plano bajo la misma configuración que se utilizó para todas las demás mediciones. La vida útil del tinte de alrededor de 2,6 ns fue lo suficientemente corta como para ser utilizado para la medición IRF en modo PLIM. El generador de imágenes puede obtener imágenes de objetos de hasta 18 mm x 18 mm de tamaño con resoluciones espaciales y temporales de 39,4 μm y 30,6 ns (ancho completo a la mitad como máximo), respectivamente28.

Los siguientes protocolos describen el ensamblaje del macrogenerador de imágenes y su posterior uso para mapear la concentración de O2 en muestras biológicas teñidas con la sonda de O2 en el infrarrojo cercano previamente caracterizada,NanO2-IR 35. La sonda es una sonda de detección deO2 brillante, fotoestable y permeable a las células basada en colorante benzoporfirina (PtBP) de platino (II). Es excitable a 625 nm, emite a 760 nm y proporciona una respuesta óptica robusta al O2 en el rango fisiológico (0%-21% o 0-210 μM deO2). También se ha demostrado que el generador de imágenes caracteriza diferentes materiales de sensores basados en colorantes de porfirina Pt (II). En general, el generador de imágenes es compacto y flexible, similar a una cámara fotográfica común. En la configuración actual, el generador de imágenes es apropiado para diferentes aplicaciones PLIM de campo amplio. La sustitución del LED con una fuente láser rápida mejorará aún más el rendimiento del generador de imágenes y podría permitir aplicaciones FLIM de nanosegundos.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo autorizaciones emitidas por la Autoridad Reguladora de Productos Sanitarios (HPRA, Irlanda) de acuerdo con la Directiva del Consejo de las Comunidades Europeas (2010/63/UE) y fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal del University College Cork.

1. Preparación de la muestra

  1. Tinción con la sonda de muestras de tejido vivo ex vivo
    1. Para aplicaciones ex vivo , utilice muestras de tejido recién aisladas de ratones Balb/c hembra de 4 semanas de edad.
    2. El día del experimento, eutanasia a un ratón por decapitación y disecciona rápidamente fragmentos del colon (intestino grueso), de aproximadamente 10 mm de tamaño. Lavarlos inmediatamente con tampón PBS, colocar en medio DMEM suplementado con tampón Hepes de 10 mM (pH 7,2) e incubar a 37 °C36.
    3. Para la tinción superficial del lado serosal del intestino, transfiera las muestras de tejido vivo a una miniplaca, aplique 2 ml de DMEM completo que contenga 1 mg/ml de sonda NanO2-IR para cubrir las muestras de tejido e incube durante 30 min a 37 °C.
      NOTA: Las células en el tejido post-mortem permanecen vivas durante muchas horas en cultivo. NaNO2-IR muestra citotoxicidad menor, por lo que todos los experimentos se completaron dentro de las 4 h posteriores al aislamiento del tejido.
    4. Para la tinción intraluminal de tejido profundo ex vivo , transfiera las piezas del intestino a una placa de Petri seca y elimine cualquier exceso de DMEM con papel de filtro.
    5. Inyecte 1 μL de DMEM que contenga 1 mg/ml de NanO2-IR 35 en el lumen con una jeringa de Hamilton e incube las muestras durante15 minutos o hasta 4 h.
      NOTA: NaNO2-IR muestra efectos citotóxicos menores a largo plazo; Por lo tanto, todos los experimentos deben completarse dentro de las 4 h posteriores al aislamiento del tejido.
  2. Preparación de tejido tumoral teñido en animales vivos
    1. Para aplicaciones in vivo , pre-tiñir las células CT26 durante 18 h en un medio libre de suero que contiene la sonda NaNO2-IR a 0,05 mg/ml.
    2. Tomar un ratón, afeitar el área de inyección en el flanco derecho e inyectar con una jeringa 200 μL de una mezcla de 1 × 10 5 células no teñidas y 1 × 105 células preteñidas con NanO2-IR .
    3. Permitir que los tumores crezcan en los ratones, monitoreando el tamaño del tumor con un calibrador y el peso del animal periódicamente37. Los animales con tumores injertados se preparan para obtener imágenes en el séptimo día de crecimiento del tumor.
      NOTA: El volumen tumoral se calculó mediante la ecuación (1):
      V = (L × W 2)/2 (1)
      donde L es el diámetro del tumor, y W is el diámetro perpendicular al diámetro L.
    4. Sacrificar a los animales por dislocación cervical justo antes de la imagen.

2. Configuración de imágenes PLIM

  1. Tome el adaptador Cricket y retire su adaptador de montura C de la parte posterior para acceder a la carcasa del intensificador en el interior. Inserte el intensificador de imagen MCP-125 en este compartimento y vuelva a colocar el adaptador de montura C.
  2. Retire el adaptador de montura C frontal del Cricket, inserte el filtro de emisión de 760 nm ± 50 nm y fíjelo volviendo a colocar la montura C.
  3. Conecte el módulo de cámara Tpx3Cam a la parte posterior del módulo Cricket a través de su adaptador de montura C
  4. Conecte la lente a la parte frontal del módulo Cricket a través de su adaptador de montura C.
  5. Monte todo el conjunto de la cámara en la parte superior de la caja negra óptica, mirando hacia abajo hasta el escenario en el que se tomarán las imágenes (Figura 1).
  6. Monte el LED súper brillante de 624 nm en un poste conectado a una placa de pruebas dentro de la caja negra.
  7. Conecte el LED a una fuente de alimentación y a un generador de pulsos. Encienda el LED y enfóquelo para garantizar una excitación efectiva y uniforme de las muestras de imagen.
  8. Conecte la cámara a otro generador de pulsos y sincronice los pulsos enviados a la cámara y al LED38.
  9. Usando el cable especial y el enchufe de la unidad Cricket, conecte el intensificador a una fuente de alimentación estándar y ajuste la ganancia a 2.7 V.
  10. Utilizando las capacidades de enfoque de la lente y el adaptador Cricket, enfoque la óptica de la cámara en la etapa de muestra para generar imágenes claras de muestras con buen contraste y brillo.
  11. Para el uso de imágenes con colorantes de Pt-porfirina, reemplace el LED de 625 nm con un LED de 390 nm para excitación y reemplace el filtro de 760 nm ± 50 nm con un filtro de 650 nm ± 50 nm en el módulo Cricket.

3. Adquisición de imágenes

  1. Coloque la muestra delante de la lente de la cámara.
    NOTA: Utilice una etapa ajustable x-y-z como soporte de muestra para ajustar la posición de la muestra para un buen enfoque.
  2. Apague todas las luces de la habitación.
  3. Encienda el software Sophy para ajustar los parámetros operativos, como el enfoque y la alineación de muestras.
    NOTA: El software Sophy se proporciona junto con la cámara para configurar los parámetros de imagen y registrar los datos. Asegúrese de que el software esté conectado a la cámara comprobando el código de la cámara. Sin embargo, utilizamos un programa diferente para la adquisición de datos.
  4. En Módulos, seleccione fotogramas infinitos y establezca el modo de operación de píxeles en tiempo por encima del umbral.
  5. En Módulos, vaya a Vista previa y seleccione Módulo activo. Esto abre la ventana Medpix/Timpix Frames .
  6. En esta ventana, cambie la escala de color y gire la imagen a la orientación deseada.
  7. Encienda el intensificador e inicie la grabación.
    NOTA: Utilice la pantalla de grabación del software Sophy para confirmar visualmente la alineación y el enfoque de la muestra y para optimizar los parámetros de excitación LED para la grabación.
  8. Detenga la grabación y cierre el software Sophy.
  9. Vaya a la terminal y use el software diseñado a medida para adquirir los datos sin procesar en formato binario y postprocesarlos (https://github.com/svihra/TimePix3).
    1. En el terminal, ejecute los siguientes comandos para registrar los datos:
      Documento CD/SPIDR/trunk/Release/
       ls
      ./Tpx3daq - i 1 - b 50 - m - s {Nombre del archivo} - t {tiempo de adquisición}
      NOTA: Al escribir "ls", compruebe la lista de archivos en el directorio actual; confirme que se ve Tpx3daq.
    2. Espere hasta que se graben todos los fotogramas.
    3. Para procesar los datos, ejecute los siguientes comandos en el terminal:
      cd Documents/DataProcessing/Timepix3/Timepix3/
      raíz
      . L dataprocess.cpp++
      .x DRGUI. C
    4. Espere a que se abra una ventana RRGui . Seleccione todas las variables a la izquierda y Todos los datos, Archivo único y Centroide a la derecha.
    5. Seleccione el archivo para procesar y ejecute el reductor de datos.
      NOTA: Todos los archivos procesados aparecerán en la misma carpeta que el archivo sin procesar.

4. Análisis de datos

  1. Analice los datos postprocesados con un programa dedicado escrito en lenguaje C que escribirá los datos en un archivo de imagen .ics (https://github.com/lmhirvonen/timepix3cam).
  2. Abra los archivos de imagen .ics utilizando el software Time Resolved Imaging disponible gratuitamente (consulte Tabla de materiales). Utilice dos funciones exponenciales para adaptarse a las desintegraciones de la fosforescencia.
  3. Abra los archivos de imagen .ics ajustados con el software de análisis de imágenes disponible (consulte la Tabla de materiales).
  4. Usando tablas de búsqueda, genere imágenes de vida útil de fosforescencia y codifique en escala de pseudocolor (por ejemplo, color azul para vidas cortas y rojo para vidas largas). Utilice la función Medir para calcular los valores medios de vida útil de toda la imagen o de regiones de interés (ROI) específicas.
  5. Convertir los valores de vida útil en la concentración de oxígeno utilizando la ecuación obtenida de la instalación de la calibración deO2 de la sonda36.
    NOTA: La ecuación (2) se utilizó para este trabajo:
    O 2 [μM] = −86,16 + 770,35 × e−0,049 × LT (2)

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Representative Results

Para aplicaciones de imágenes ex vivo , se tiñeron fragmentos de tejidos intestinales mediante la aplicación tópica de la sonda NanO2-IR en el lado serosal del tejido. Para una tinción más profunda, se inyectó 1 μL de la sonda en el lumen. En este último caso, la pared intestinal de 0,2-0,25 mm de espesor protegía la sonda de la cámara. Los dos procesos de tinción se muestran en la Figura 2A.

La intensidad resultante y las imágenes PLIM se presentan en la Figura 2B-G. Los colores reflejan claramente la diferencia en los valores de vida útil y, por lo tanto, la diferencia en la oxigenación de los lados serosal y mucoso del tejido. La Figura 2C y la Figura 2D se refieren a conjuntos similares de tejidos que fueron teñidos tópicamente (Figura 2C) e intraluminalmente (Figura 2D). Como era de esperar, los tejidos mostraron patrones PLIM similares. Sin embargo, la tinción intraluminal del lado mucoso del tejido (Figura 2D) mostró valores de vida más altos, reflejando una menor oxigenación en la superficie interna del intestino, en comparación con la tinción tópica del lado serosal (Figura 2C), que mostró menores vidas. Esto refleja una mayor oxigenación en la superficie externa del intestino.

Para examinar la estabilidad de las señales de por vida y la actividad respiratoria del intestino, se realizó un análisis PLIM de lapso de tiempo en las muestras teñidas intraluminalmente durante 2 h (Figura 2D-G). Se observó un aumento en los valores de vida entre 15 min (54,4 μs ± 0,9 μs) y 2 h (61,1 μs ± 0,8 μs) de la incubación, lo que refleja una reducción en los niveles deO2 en la parte luminal del intestino. Además, los niveles bajos deO2 después de 2 h de incubación demuestran que la respiración tisular continuó durante todo el período de disección, preparación, tinción, incubación y pasos de imagen. Además, el cambio en la forma del lumen observado en la Figura 2D-G puede atribuirse a la distribución de la sonda inyectada en el lumen, lo que significa que la señal LT refleja el área donde se encuentra la sonda.

Para evaluar el rendimiento futuro del generador de imágenes in vivo, se llevó a cabo un estudio inicial sobre la imagen de hipoxia en tumores subcutáneos injertados cultivados en ratones inmediatamente después del sacrificio (Figura 3). En este caso, los ratones Balb / c se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho con 200 μL de una mezcla de células CT26, que no se tiñeron o se tiñeron con una sonda NanO2-IR de 0,05 mg / ml. PLIM se realizó en el séptimo día del crecimiento del tumor, y los ratones fueron sacrificados justo antes de la imagen (es decir, post-mortem). Las imágenes de las áreas tumorales en los ratones en el séptimo día de crecimiento se muestran en la Figura 3A, B.

Las imágenes de intensidad (izquierda) y PLIM (derecha) para las áreas tumorales en los ratones en el séptimo día de crecimiento tumoral (Figura 3B) demuestran el rendimiento y la sensibilidad tanto del generador de imágenes como de la sonda en tales experimentos (no se muestran datos estadísticos más detallados). Los animales fueron fotografiados durante 20 s cada uno. Los flancos izquierdos de los ratones fueron afeitados y fotografiados como un espacio en blanco. No produjeron señales PLIM. En contraste, las regiones con el tumor y la sonda produjeron señales estables de por vida de ~ 50 μs. El objetivo de este experimento fue evaluar la usabilidad del generador de imágenes para estudios in vivo con animales vivos y modelos de enfermedades humanas. Si bien esta parte mostró resultados cualitativos preliminares, se está preparando un documento correspondiente, que proporciona una evaluación cuantitativa más exhaustiva.

A continuación, el generador de imágenes también se demostró en las imágenes PLIM de materiales sensoriales basados en colorantes de porfirina Pt (II). La estructura química del colorante Pt-octaetilporfina (PtOEP) y los detalles técnicos de la preparación de los materiales del sensor correspondientes se describen en otra parte 6,39. Los recubrimientos del sensor de estado sólido fosforescente a base de poliestireno PtOEP depositados en una película de poliéster transparente (Mylar) como pequeñas manchas se obtuvieron imágenes sumergiendo la película en tampón PBS (estado oxigenado saturado de aire) o en PBS que contiene glucosa y glucosa oxidasa, lo que proporciona una condición completamente desoxigenada. Las señales de vida obtenidas en las condiciones oxigenadas (25,6 μs ± 0,5 μs) y desoxigenadas (65,7 μs ± 1,5 μs) coincidieron con los resultados reportados anteriormente6. Las imágenes de intensidad y PLIM de los sensores oxigenados y desoxigenados se dan en la Figura 4A, B.

Figure 1
Figura 1: Configuración experimental del generador de imágenes38. Reproducido con permiso de Sen et al.38. Derechos de autor: The Optical Society. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: O2 PLIM de las muestras de intestino de ratón teñidas tópica e intraluminalmente. (A) Ilustración de los dos métodos de tinción utilizando (B) intensidad de fosforescencia y (C) imágenes PLIM del intestino teñido tópicamente con la sonda NanO2-IR. (D-G) PLIM timelapse del intestino teñido intraluminalmente a los 15 min, 30 min, 1 h y 2 h después de la tinción. Las imágenes PLIM se presentan en una escala de pseudocolor: el color azul corresponde a una vida útil más baja y el color rojo corresponde a valores de vida útil más altos. Barras de escala = 5 mm. Abreviatura: PLIM = microscopía de imágenes de fosforescencia de por vida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: O2 PLIM de tumores injertados en los flancos derechos de los ratones . (A) Ilustración gráfica del desarrollo tumoral en animales vivos. Imágenes de intensidad de fosforescencia (izquierda) y PLIM (derecha) de áreas tumorales en el séptimo día (B) de crecimiento tumoral. La imagen PLIM se presenta en una escala de pseudocolor: el color azul corresponde a una vida útil más baja y el color rojo corresponde a valores de vida útil más altos. Barra de escala = 5 mm. Abreviatura: PLIM = microscopía de imágenes de fosforescencia de por vida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Intensidad de fosforescencia del punto sensor basado en PtOEP. Imágenes de intensidad de fosforescencia (izquierda) y PLIM (derecha) del punto sensor PtOEP en los estados (A) oxigenado y (B) desoxigenado. Las imágenes PLIM se presentan en una escala de pseudocolor: el azul corresponde a una vida útil más baja y el color rojo corresponde a valores de vida útil más altos. Abreviaturas: PLIM = microscopía de imágenes de fosforescencia de por vida; PtOEP = octaetilporfirina de platino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los protocolos anteriores ofrecen una descripción detallada del montaje del nuevo generador de imágenes y su funcionamiento en el modo FLIM/PLIM de microsegundos. La cámara Tpx3Cam de nueva generación basada en TCSPC, acoplada por medio del adaptador optomecánico Cricket con el intensificador de imagen, el filtro de emisión y la lente macro, produce un módulo óptico estable, compacto y flexible que es fácil de operar. Se demostró que el generador de imágenes funciona bien con una variedad de muestras diferentes y tareas analíticas, que incluyeron la caracterización de materiales fosforescentes e imágenes de tejido vivoO2 . La sonda soluble permeable a las células basada en Pt(II)-benzoporfirina de infrarrojo cercano NanO2-IR y los sensores de estado sólido basados en porfirina de Pt(II)-emisores de rojo se utilizaron en los experimentos de imagen. Estos sensores se han utilizado con éxito para la detección de fosforescencia apagada deO2 debido a su gran cambio de Stokes, larga vida útil de la emisión, alta sensibilidad, respuesta rápida y buena estabilidad fotoquímica.

Estas diferentes sondas sensibles alO2 y recubrimientos de estado sólido, cuando se probaron en el macrogenerador de imágenes, produjeron resultados que están de acuerdo con los datos publicados anteriormente40. Los materiales demostraron una buena uniformidad, contraste y respuestas de por vida a las condiciones ambientales cambiantes, particularmente en términos de temperatura y estado de oxigenación. La comparación de estos resultados con los producidos en el microscopio confocal TCSPC-PLIM muestra que el nuevo generador de imágenes es preciso, tiene lecturas de vida útil de mejor calidad y adquiere imágenes PLIM con alta velocidad y sensibilidad28,38,40.

El generador de imágenes también demostró un rendimiento prometedor con muestras biológicas teñidas fosforescentemente de diferentes tipos. Por lo tanto, se produjeron mapas detallados de concentración deO2 para las muestras que contenían suspensiones de células respiratorias teñidas, tejido animal postmortem vivo, órganos enteros y tumores injertados. El generador de imágenes ha proporcionado mediciones de valores de vida útil desde la superficie e incluso a profundidades de hasta 0,5 mm dentro del tejido28,36,38.

Dado que los valores de vida útil de la fosforescencia están fuertemente influenciados por la temperatura41, es necesario implementar un control estricto de la temperatura de las muestras fotografiadas, por ejemplo, utilizando una etapa de muestra calentada y / o una cámara de incubadora. Al usar la excitación UV, es importante elegir cuidadosamente los soportes de muestra, ya que muchos materiales poseen autofluorescencia en esta región espectral, lo que afecta el verdadero valor de vida útil de la muestra. Todas las imágenes PLIM en este estudio se realizaron a una potencia LED de 4 V y un ancho de pulso de 50 ns para un tiempo de integración de 20 s; sin embargo, estos parámetros se pueden ajustar según sea necesario. Se graban aproximadamente 104.500 fotogramas durante los 20 s de tiempo de adquisición de imágenes. Por último, es importante realizar las mediciones en una cámara oscura para evitar interferencias de luz ambiental.

Por lo tanto, el generador de imágenes PLIM puede realizar mediciones rápidas y cuantitativas de la vida útil con objetos macroscópicos de tamaño significativo. Si bien el escaneo láser PLIM-TCSPS es posible, sería demasiado lento debido a los largos tiempos de permanencia requeridos para los colorantes sensibles al oxígeno. Este generador de imágenes, sin embargo, es rápido y puede grabar todos los píxeles simultáneamente. Además, las mediciones basadas en la intensidad pueden verse influenciadas por la concentración de colorante fluorescente / fosforescente, una intensidad inestable de LED o láser, el fotoblanqueo, la alineación de los componentes ópticos y la dispersión de las muestras. Por el contrario, el generador de imágenes macro basado en TCSPC es esencialmente independiente de estos factores. Por lo tanto, puede realizar mediciones precisas y sin calibración deO2. Las desventajas de la cámara incluyen su procesamiento de datos relativamente complejo y grandes tamaños de datos (~ 2 Gb).

En el futuro, el generador de imágenes también se puede utilizar no solo para mapear las concentraciones deO2 , sino también otros parámetros químicos y bioquímicos de las muestras probadas, como el pH y la dinámica de la glucosa, utilizando las sondas o sensores correspondientes. Esto lo convierte en una herramienta útil para estudios fisiológicos con diversos modelos de tejidos y enfermedades. El generador de imágenes también se puede actualizar para funcionar en el modo FLIM de nanosegundos. Sin embargo, esto requiere el reemplazo de los LED actuales con una fuente de excitación más rápida (por ejemplo, un láser ps). El funcionamiento del sistema en el modo dual PLIM/FLIM también es principalmente posible.

En conjunto, el generador de imágenes demuestra simplicidad y versatilidad, junto con una buena funcionalidad y rendimiento operativo en aplicaciones TCSPC-PLIM de campo amplio. Los generadores de imágenes de campo amplio disponibles comercialmente realizan principalmente imágenes basadas en la intensidad, en las que las intensidades fosforescentes pueden verse influenciadas por factores como el fotoblanqueo, la geometría de medición, la dispersión de las muestras, etc. El generador de imágenes actual se basa en imágenes de por vida, lo que hace que las mediciones sean bastante más cuantitativas que cualitativas. Además, la integración de la cámara óptica Tpx3Cam con el adaptador Cricket y el intensificador de imagen proporciona sensibilidad de fotón único, simplicidad, flexibilidad y robustez de las mediciones. A diferencia de otros sistemas, se puede llevar al sitio de los experimentos y girar 360 ° según los requisitos de la muestra y la tarea de medición. Con su objetivo actual, que es fácil de cambiar por otro objetivo, el generador de imágenes puede medir muestras de hasta 18 mm x 18 mm de tamaño en cuestión de segundos y con una alta resolución espacial de 256 píxeles x 256 píxeles. Este documento describe los procedimientos paso a paso sobre cómo preparar muestras para pruebas y utilizar el generador de imágenes en las diferentes aplicaciones PLIM.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Acknowledgments

Se agradece el apoyo financiero para este trabajo de la Science Foundation Ireland, las subvenciones SFI/12/RC/2276_P2, SFI/17/RC-PhD/3484 y 18/SP/3522, y Breakthrough Cancer Research (Precision Oncology Ireland).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
627 nm LED Parts Express Can be replaced with different LED based on the excitation wavelength of the sensor. Used 390 nm LED for Pt-porphyrin dyes.
760 ± 50 nm emission filter Edmund Optics 84-788 Can be replaced with different filter based on the emission wavelength of the sensor. Used 650 ± 50 nm bandpass filter for Pt-porphyrin dyes.
Balb/c mice Envigo, UK Balb/c
Black box Thorlabs XE25C9/M
Cricket Adapter Photonis Cricket-2
CT26 cells  ATCC CT26.WT https://www.atcc.org/products/crl-2638
DMEM Sigma-Aldrich D0697 Other media can also be used
ImageJ Software ImageJ Free Image analysis software. Can be downloaded from: https://imagej.nih.gov/ij/index.html
MCP-125 image intensifier with P47 phosphor screen Photonis PP0360EF
Mini dishes Sarstedt 83.3900.300 35 mm diameter 
Mylar plastic film, 75 micron  RS Ireland 785-0795 Othe plastic substrates can also be used
NanO2-IR home-made n/a The probe can be synthesised according to the published method 'Tsytsarev V, Arakawa H, Borisov S, Pumbo E, Erzurumlu RS, Papkovsky DB. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. J Neurosci Methods. 2013 Jun 15;216(2):146-51. doi: 10.1016/j.jneumeth.2013.04.005. Epub 2013 Apr 25. PMID: 23624034; PMCID: PMC3719178.' or provided by our lab. 
NMV-50M11” 50 mm lens Navitar Other lenses compatibel with C-mount adators can be used
Optical breadboard Thorlabs MB1836
Petri Dishes Sarstedt 82.1472.001 92 mm diameter
Power Supply Tenma 72-10495
Pulse Generator Tenma TGP110
Sophy Amsterdam Scientific Instruments n/z Provided by ASI together with the Tpx3Cam
Tpx3Cam Amsterdam Scientific Instruments TPXCAM
Tri2 Software University of Oxford n/a Free Time Resolved Imaging software, can be downloaded from: https://users.ox.ac.uk/~atdgroup/index.shtml
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References

  1. Papkovsky, D. B., Dmitriev, R. I. Imaging of oxygen and hypoxia in cell and tissue samples. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (16), 2963-2980 (2018).
  2. Carreau, A., El Hafny-Rahbi, B., Matejuk, A., Grillon, C., Kieda, C. Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 15 (6), 1239-1253 (2011).
  3. Yoshihara, T., Hirakawa, Y., Hosaka, M., Nangaku, M., Tobita, S. Oxygen imaging of living cells and tissues using luminescent molecular probes. Journal of Photochemistry and Photobiology C: Photochemistry Reviews. 30, 71-95 (2017).
  4. Papkovsky, B. Phosphorescence based oxygen sensors essential tools for cell biology and life science research. 17th International Meeting on Chemical Sensors - IMCS. , 71-72 (2018).
  5. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  6. O'Donovan, C., Hynes, J., Yashunski, D., Papkovsky, D. B. Phosphorescent oxygen-sensitive materials for biological applications. Journal of Materials Chemistry. 15, 2946-2951 (2005).
  7. Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Optical probes and techniques for O 2 measurement in live cells and tissue. Cellular and Molecular Life Sciences. 69 (12), 2025-2039 (2012).
  8. Papkovsky, D. B., Zhdanov, A. V. Phosphorescence based oxygen sensors and probes for biomedical research. Advanced Environmental, Chemical, and Biological Sensing Technologies XIV. 10215, 102150 (2017).
  9. Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. Imaging of phosphorescence: A novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue. Science. 241 (4873), 1649-1651 (1988).
  10. Hogan, M. C. Phosphorescence quenching method for measurement of intracellular PO 2 in isolated skeletal muscle fibers. Journal of Applied Physiology. 86 (2), 720-724 (1999).
  11. Apreleva, S. V., Wilson, D. F., Vinogradov, S. A. Tomographic imaging of oxygen by phosphorescence lifetime. Applied Optics. 45 (33), 8547-8559 (2006).
  12. Becker, W., Shcheslavskiy, V., Rück, A. Simultaneous phosphorescence and fluorescence lifetime imaging by multi-dimensional TCSPC and multi-pulse excitation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 19-30 (2017).
  13. Wolfbeis, O. S. Luminescent sensing and imaging of oxygen: Fierce competition to the Clark electrode. BioEssays. 37 (8), 921-928 (2015).
  14. Dmitriev, R. I., Zhdanov, A. V., Nolan, Y. M., Papkovsky, D. B. Imaging of neurosphere oxygenation with phosphorescent probes. Biomaterials. 34 (37), 9307-9317 (2013).
  15. Shcheslavskiy, V. I., Neubauer, A., Bukowiecki, R., Dinter, F., Becker, W. Combined fluorescence and phosphorescence lifetime imaging. Applied Physics Letters. 108, 091111 (2016).
  16. Babilas, P., et al. In vivo phosphorescence imaging of pO2 using planar oxygen sensors. Microcirculation. 12 (6), 477-487 (2005).
  17. Babilas, P., et al. Transcutaneous pO2 imaging during tourniquet-induced forearm ischemia using planar optical oxygen sensors. Skin Research and Technology. 14 (3), 304-311 (2008).
  18. Golub, A. S., Pittman, R. N. PO2 measurements in the microcirculation using phosphorescence quenching microscopy at high magnification. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (6), 2905-2916 (2008).
  19. Zhdanov, A. V., Golubeva, A. V., Okkelman, I. A., Cryan, J. F., Papkovsky, D. B. Imaging of oxygen gradients in giant umbrella cells: An ex vivo PLIM study. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 309 (7), 501-509 (2015).
  20. Becker, W. Fluorescence lifetime imaging - Techniques and applications. Journal of Microscopy. 247 (2), 119-136 (2012).
  21. Jenkins, J., Dmitriev, R. I., Papkovsky, D. B. Imaging cell and tissue O 2 by TCSPC-PLIM. Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Applications. Becker, W. , Springer. Cham, Switzerland. 225-247 (2015).
  22. Becker, W. Advanced TCSPC-FLIM techniques. Multiphoton Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging: Applications in Biology and Medicine. König, K. , De Gruyter. Berlin, Germany. 23-52 (2018).
  23. Wei, L., Yan, W., Ho, D. Recent advances in fluorescence lifetime analytical microsystems: Contact optics and CMOS time-resolved electronics. Sensors. 17 (12), 2800 (2017).
  24. Hirvonen, L. M., Suhling, K. Wide-field TCSPC: Methods and applications. Measurement Science and Technology. 28, 012003 (2017).
  25. Hirvonen, L. M., Festy, F., Suhling, K. Wide-field time-correlated single-photon counting (TCSPC) lifetime microscopy with microsecond time resolution. Optics Letters. 39 (19), 5602 (2014).
  26. Sparks, H., et al. Characterisation of new gated optical image intensifiers for fluorescence lifetime imaging. Review of Scientific Instruments. 88 (1), 013707 (2017).
  27. Chelushkin, P. S., Tunik, S. P. Progress in Photon Science: Emerging New Directions. 115, Springer. Cham, Switzerland. (2017).
  28. Sen, R., et al. A new macro-imager based on Tpx3Cam optical camera for PLIM applications. Proceedings of SPIE. , 113591 (2020).
  29. Fisher-Levine, M., Nomerotski, A. TimepixCam: A fast optical imager with time-stamping. Journal of Instrumentation. 11, (2016).
  30. Nomerotski, A. Imaging and time stamping of photons with nanosecond resolution in Timepix based optical cameras. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 937. 937, 26-30 (2019).
  31. Poikela, T., et al. Timepix3: A 65K channel hybrid pixel readout chip with simultaneous ToA/ToT and sparse readout. Journal of Instrumentation. 9, 05013 (2014).
  32. Nomerotski, A., et al. Characterization of TimepixCam, a fast imager for the time-stamping of optical photons. Journal of Instrumentation. 12, 01017 (2017).
  33. Hirvonen, L. M., Fisher-Levine, M., Suhling, K., Nomerotski, A. Photon counting phosphorescence lifetime imaging with TimepixCam. Review of Scientific Instruments. 88, 013104 (2017).
  34. Visser, J., et al. SPIDR: A read-out system for Medipix3 & Timepix3. Journal of Instrumentation. 10, 12028 (2015).
  35. Tsytsarev, V., et al. In vivo imaging of brain metabolism activity using a phosphorescent oxygen-sensitive probe. Journal of Neuroscience Methods. 216 (2), 146-151 (2013).
  36. Sen, R., et al. Mapping O2 concentration in ex-vivo tissue samples on a fast PLIM macro-imager. Scientific Reports. 10, 19006 (2020).
  37. Kersemans, V., Cornelissen, B., Allen, P. D., Beech, J. S., Smart, S. C. Subcutaneous tumor volume measurement in the awake, manually restrained mouse using MRI. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 37 (6), 1499-1504 (2013).
  38. Sen, R., et al. New luminescence lifetime macro-imager based on a Tpx3Cam optical camera. Biomedical Optics Express. 11 (1), 77-88 (2020).
  39. Papkovsky, D. B., et al. Phosphorescent polymer films for optical oxygen sensors. Biosensors and Bioelectronics. 7 (3), 199-206 (1992).
  40. Sen, R., et al. Characterization of planar phosphorescence based oxygen sensors on a TCSPC-PLIM macro-imager. Sensors and Actuators, B: Chemical. 321, 128459 (2020).
  41. Lakowicz, J. R., Szmacinski, H., Nowaczyk, K., Berndt, K. W., Johnson, M. Fluorescence lifetime imaging. Analytical Biochemistry. 202 (2), 316-330 (1992).

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Biología Número 194
Macro Imager de vida útil de fluorescencia para aplicaciones biomédicas
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Sen, R., Zhdanov, A. V., Devoy, C., Tangney, M., Hirvonen, L. M., Nomerotski, A., Papkovsky, D. B. Fluorescence Lifetime Macro Imager for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (194), e64321, doi:10.3791/64321 (2023).

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