Summary
体外培養は、生菌の存在を直接検出する方法です。このプロトコルは、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体、再発熱ボレリア種、およびボレリア・ミヤモトイのものを含む、多様なボレリア・スピロヘータの培養方法について説明しています。これらの種は潔癖で成長が遅いですが、培養することができます。
Abstract
ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループの3つの種グループで構成され、B.ブルグドルフェリセンスラト(s.l.)としても知られ、最近ボレリエラ、再発熱(RF)グループボレリア、およびスピロヘータの3番目の爬虫類関連グループに再分類されました。体液または組織からの病原体の培養が複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供するため、培養ベースの方法は、研究と臨床作業の両方で細菌感染の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています。ボレリアとボレリエラ・スピロヘータは潔癖で成長が遅いため、一般的に臨床目的で培養されていません。 しかし、研究には文化が必要です。このプロトコルは、B. afzelii、B. americana、B. andersonii、B. bavariensis、B. bissettii/bissettiae、B. burgdorferi sensu stricto(s.s)、B. californiensis、B. carolinensis、B. chilensis、B. finlandensis、B. garinii、B. japonica、B. kurtenbachii、B. lanei、 B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, B. miyamotoi.LBおよびRFスピロヘータを成長させるための基本的な培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実にサポートするバーバー・ストーナー・ケリー(BSK-IIまたはBSK-H)培地です。接種材料中で初期スピロヘータ数が低いダニまたは宿主由来のサンプルから新たに単離されたボレリア分離株を増殖させることができるように、修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地が好ましい。この培地は、B. miyamotoiの増殖もサポートします。RFスピロヘータの栽培の成功は、成分の品質にも大きく依存します。
Introduction
ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループ、再発熱(RF)グループ、および爬虫類に限定されているように見えるあまり特徴のないグループの3つの主要なクレードを含むスピロヘータ細菌の属です。ボレリア分類学は、他のほとんどの分類群1,2,3,4,5,6,7と同様に、ゲノムとプロテオームの比較を可能にする分子方法論の出現により流動的である。LBグループ(ライム病グループとも呼ばれます)は、伝統的に、その最も特徴的なメンバーであるボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクトにちなんでボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラトと呼ばれています。この論文では、現在最も広く使用されている用語であるLB、RF、および爬虫類関連グループを使用し、LBおよびRFグループの培養プロトコルについて説明します。
スピロヘタ科のメンバーに期待されるように、ボレリアは、典型的には長さ20〜30μm、幅0.2〜0.3μmの独特の長くて細いらせん形状を採用することができる。しかし、ボレリア細胞は非常に多形性であり、それらの複雑な細胞および遺伝子構造の結果として、培養およびin vivoの両方で他の多くの形状を採用することができます1,8。そのスピロヘータ形態では、平面正弦波形態は、内膜と外膜の間のペリプラズム空間で回転する軸方向の鞭毛藻に起因します。この構造は、細胞が宿主組織と相互作用することを可能にするタンパク質を含む外膜を有する、細胞を高度に運動させることを可能にする9,10。外膜タンパク質の発現は厳密に調節されており、宿主組織への浸潤だけでなく、宿主免疫系との相互作用にも影響を及ぼす11。この複雑な遺伝子発現により、ボレリア細胞は脊椎動物宿主と無脊椎動物ベクターの非常に異なる環境の間を行き来することができます。ボレリアのゲノムは原核生物の間では珍しく、環状染色体ではなく線状染色体で構成されています。直鎖染色体に加えて、ボレリア種は7〜21個のプラスミドを含み、いくつかは線状およびいくつかは環状である。プラスミドは宿主の適応と病原性に必要な遺伝子の大部分を保持しており、プロファージに由来する環状プラスミドは、スピロヘータ細胞間の水平遺伝子流動の大部分を担っていると考えられています12,13。宿主適応における役割と一致して、ライムボレリア症群の一部、おそらく多くまたはすべてのメンバーは、培養においてプラスミドを失う14。B. burgdorferiの最も研究されている「実験室適応」株であるB31は、この種の野生分離株に見られる9つのプラスミドのうち7つだけを持っています15。同様に、B. gariniiは培養16でプラスミドを失います。いくつかの研究では、RF種とB. miyamotoiが培養時にプラスミドを保持することが示されています14,17が、最近の研究では、長期間のin vitro培養でプラスミドと感染力が変化していることが示されています18。
培養ベースの方法は、研究と臨床研究の両方において、細菌感染症の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています14,17。体液または組織からの病原体の培養は、複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供します14,17。このプロトコルは、LBグループ、RFボレリアおよびB.miyamotoiのスピロヘータをうまく培養するために必要な方法論とレシピを示しています。ボレリア・スピロヘータを増殖させるための基本的な培地は、汚染された原核生物の増殖を減少させるための抗生物質の有無にかかわらず、バーバー・ストーナー・ケリー培地(BSK-IIまたは市販のBSK-H)である。この培地は、もともとRFボレリア19をサポートするために使用されていた培地から適応され、Stoenner20によってさらに変更され、次にBarbour21によって修正されました。それ以来、多くの改変が開発されており、それぞれが細菌生理機能に影響を及ぼし、成長、感染力、および病原性に影響を与える可能性があります22。この培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実に支持し、ダニ、哺乳類、および臨床サンプルからスピロヘータを単離するために使用されています23。より最近開発されたバリエーションである修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地は、培養物の播種に利用可能なサンプル中に存在するスピロヘータの数が少ない場合に、環境サンプルから新しいボレリア分離株を単離する際に、より良い単離成功、形態、および運動性を提供できます23,24。すべての場合において、栽培の成功は、新たに調製された培地と適切な成分の使用に大きく依存しています。すべての市販の原料が高品質の培地を生産するわけではありません。接種培養物は、少量の残留周囲酸素の存在下で、従来の32〜34°Cのインキュベーター内で振とうすることなく便利にインキュベートすることができる。ボレリア・スピロヘータは嫌気性菌ですが、自然界では酸素と二酸化炭素の濃度の変動にさらされ、遺伝子発現の変化に応答します26,27,28,29。したがって、遺伝子発現、成長、およびその他の代謝研究は、酸素制御インキュベーターまたは嫌気性チャンバーを使用して酸素および二酸化炭素レベルを制御する必要があります。培養では、培養物は毎週、またはより頻繁に、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡のいずれかでスピロヘータの存在についてチェックされます。培養塗抹標本は、銀染色、免疫組織化学、または蛍光タグ付き株29、30のいずれかで染色することができる。PCRとそれに続くDNAシーケンシングは、ボレリア種を検出し、遺伝的に同定または確認するための高感度で特異的な方法です30、31、32、33。
BSK-IIには多くのマイナーなバリエーションが存在し、一部は市販されています。セクション1でここで説明されているプロトコルは、Barbour (1984)21から適応されています。液体MKP培地は、より最近開発された培地であり、セクション2に記載されている。これは、以前に報告されたプロトコル33,34に従って調製され、BSK培地と同様に、基本培地の調製および完全培地の調製の2つの工程からなる。ボレリア培養培地は、セクション3に記載されているように、抗生物質の有無にかかわらず調製できます。抗生物質は、セクション4で説明されているように、臨床サンプルまたは環境サンプルを接種するときに導入される汚染細菌を減らすように機能します。純粋なボレリアsp.培養物を接種する場合、抗生物質は必要ないかもしれません。ボレリアの長期株を作ることはしばしば重要であり、そのためのプロトコルはセクション5で説明されています。セクション6では、これらの培地を使用して、臨床サンプルまたは環境サンプルから純粋なボレリアセンスラトクローンを単離する方法について説明します。可能なアプローチはいくつかあります36。以下は効果的であることが判明したものです。このプロトコルで使用されるプレーティング媒体は、BSK-IIメッキ培地37およびMKP培地34の改変です(ウサギ血清を10%38に増加)。
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Protocol
ヒト被験者から得られたサンプルを含むすべての研究は、関連する大学および/または医療施設の治験審査委員会によって承認され、サンプルが収集される前に参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。動物から得られたサンプルを含むすべての研究は、施設動物倫理委員会のガイドラインの下で承認され、実施されました。必要に応じて、環境サンプリングの承認が得られています。
注:文化の成功は、食材の品質に大きく依存しています。市販のBSK培地が利用可能であり、実験室に適応した純粋な B.ブルグドルフェリ および高用量の接種材料を使用して培養物を播種できる関連種の増殖を強力にサポートします。一次生物学的材料からの菌株の単離物の場合、新たに調製された培地が好ましく、しばしば必要である。
ボレリア sp.は既知または疑われる病原体であり、スクリーニングされていないヒトまたは動物の組織もバイオハザードになる可能性があります。感染の可能性のある物質の取り扱いには、治験責任医師の安全のために個人用保護具と滅菌技術が必要です。さらに、培地は非常に栄養が豊富であるため、培養物は簡単に汚染されます。この作業にはバイオセーフティレベル2の封じ込めが一般的に必要であり、 Borrelia sp.またはサンプルを使用したすべての作業は生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。
1. BSK-II培地の作り方
- 完全なBSK-II培地の調製
- 表1に示すように 1 Lの培地を調製して試薬を得た。
注:BSAの純度(または純度の欠如)は、最適な成長にとって重要です。特にBSA純度はメーカーとロットで異なります。成功している製品と成功していない製品のリストについては、 表2 を参照してください。異なるベンダーからいくつかのサンプルを入手し、最適な成長のためにそれらをテストし、次に最良のロットを大量に購入することは、この問題を軽減し、優れた培地を作成するための効果的な戦略です。 - BSAをビーカーに溶かして水を入れて沸騰させることから始めますが、これには少なくとも30分かかります。
- すべての乾燥化学物質を加えて溶かします。次に、CMRL を追加します。
- 必要に応じて、BSK-II培地のpHを1 M NaOHで7.6に調整します。
- ウサギ血清をBSK-II培地に6%〜10%の濃度で加える。BSK-II培地をフィルター滅菌(孔径0.22μm)します。血清の必要量は ボレリア 種によって異なります。RF種と菌株、および ボレリア・ブルグドルフェリ ・センス・ラトには6%〜7%を使用してください。成長が強くない場合は、さらに1%〜2%の滅菌ウサギ血清を培地に加えます。
- BSK-II培地のストックを100 mLまたは400 mLのアリコートで凍結します。
- RF株の場合、ゼラチンが必要です。100 mLの7%滅菌ゼラチン(少し温めて溶液に入れます)を400 mL BSK-II培地に加えます。BSK-IIをゼラチンとともに37°Cで温め、ゼラチンを溶かしてから培養液に接種します。
注:培地は、フィルター滅菌およびウサギ血清およびゼラチン(RFスピロヘータ用)の添加前、またはフィルター滅菌および血清(およびゼラチン)添加後に凍結(-20°C)することができます。培地は長時間凍結しても安定です。冷蔵庫で保存する場合は、1ヶ月以内に培地を使用してください。RF種は、通常1週齢以下の新鮮な培地で最もよく成長します。凍結していない場合は、培地の品質に濁りがないか目視検査します。汚染されている、沈殿する成分、またはその他の疑わしいと思われる培地を廃棄します。 - 抗生物質を培地に添加する場合は、作りたての培地または以前に凍結したアリコートに追加します。後者はより柔軟なアプローチです。Oliver et al.39に記載されている抗生物質濃度を使用してください。
- 培地のチューブを解凍しながら、精密天びんを使用して、抗生物質を滅菌(オートクレーブ)1.7 mLチューブまたは滅菌15 mLコニカルチューブに計量します。25 mgのアムホテリシンBを10 mLのDMSOに、20 mgのホスホマイシンを1 mLのオートクレーブ蒸留水に、50 mgのリファンピシンを1 mLのDMSOに溶解します。
- フィルターは抗生物質を滅菌し(0.2μmシリンジフィルター)、適切なサイズの新しいチューブに移します。
- 抗生物質を培地の1:1000の比率で希釈して、最終濃度に到達します。500 mLのBSKに対して、0.5 mLのアムホテリシンBストック溶液(DMSO溶液2.5 mg/mL)、0.5 mLのホスホマイシンストック溶液(滅菌H2O溶液20 mg/mL)、および0.5 mLのリファンピシン(米国:リファンピン)ストック溶液(50 mg/mLのDMSO溶液)を加えます。
- 抗生物質を添加した培地またはアリコートを使用し、-20°Cで凍結します。
- 表1に示すように 1 Lの培地を調製して試薬を得た。
| 成分 | 量 (/L) |
| BSAフラクションV | 50グラム |
| CMRL-1066 (10倍速) | 100ミリリットル |
| ネオペプトン | 5グラム |
| ヘペス | 6グラム |
| クエン酸三ナトリウム二水和物 | 0.7 グラム |
| グルコース | 5グラム |
| TC酵母ート | 2グラム |
| ピルビン酸(Na塩) | 0.8グラム |
| N-アセチル-D-グルコースアミン | 0.4グラム |
| 炭酸水素ナトリウム | 2.2 グラム |
| 水(高純度) | 900ミリリットル |
表1:BSK-II培地1Lの組成。
| 源 | 相応 |
| Serva GmbH, ハイデルベルク, ドイツ | はい |
| プロリアントバイオロジカルズ、ブーンIA、米国 | はい |
| Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, アメリカ合衆国 | いいえ |
表2:BSAの供給源とBSK-II培地への適合性。
2. MKPの作成手順
- 基本培地の調製
- 以下の 表3 に記載されているすべての粉末成分を、ddH2O(約750 mL)の最終容量の3/4に注意深く計量して溶解し、完全に溶解するまで攪拌します(~1時間かかります)。
- 完全に溶解した後、NaOHでpHを7.6に、容量を1000mLに調整し、ろ過(0.22μmフィルター)で滅菌します。
注:塩基性培地は、-20°Cで最大3か月間保存できます。
- MKP完全培地の調製
- 表4に記載されているすべての成分を滅菌方法で混合します。オートクレーブ滅菌でゼラチンを滅菌し、無菌で取り扱ってください。滅菌生物学的安全キャビネットで作業し、滅菌ろ過された血清を使用してください。
- MKPを50 mLチューブに分注します。少量のアリコート1個を33°Cで数日間入れ、暗視野顕微鏡で汚染がないかどうかを確認します。
注意: MKP完全培地を+ 4°Cで1か月以内に保ち、凍結しないでください。完全な培地は、0.22μmフィルターを使用したろ過によってさらに滅菌できます。
| 成分 | 量 (/L) |
| CMRL-1066 (グルタミンなしで10回) | 100 mL (液体の場合)/9.7 g/L (粉末の場合) |
| ネオペプトン | 3グラム |
| ヘペス | 6グラム |
| クエン酸 | 0.7 グラム |
| グルコース | 3グラム |
| ピルビン酸 | 0.8グラム |
| N-アセチルグルコースアミン | 0.4グラム |
| 炭酸水素ナトリウム | 2グラム |
表3:1Lの塩基性MKP(変性ケリー・ペッテンコーファー)培地の組成。
| 成分 | 使用量(mL) |
| 基本メディア | 500 |
| 7%ゼラチン(H2O中)(オートクレーブしたてだが熱くない) | 100 |
| ウサギ血清 | 36 |
| 35% BSA | 17.5 |
表4:MKP(修飾ケリー・ペッテンコーファー)完全培地の組成。
3.抗生物質の有無にかかわらず 、ボレリアの文化
- 生物学的安全キャビネット内の無菌作業条件下ですべての実験ステップを実行します。表面とすべての材料を70%エタノールで消毒し、すぐに生物学的安全キャビネットに移します。作業開始前に、生物学的安全キャビネット内のすべての非生物学的材料を5分間UV滅菌します。
- 可能な限り新鮮な培地を使用してください。
- 培養を開始するには、培地(33°C〜37°C)をインキュベーター内で事前に温めます。必要に応じて振とうします。
メモ: 培地の容量によっては、この手順に数時間かかる場合があります。 - グリセロールまたは類似のストックから解凍した ボレリア 培養液を、液体になったらすぐに、-80°Cで保存し、室温(RT)で解凍した~1 mLを、事前に温めたBSK培地5-15 mLに加えます。スクリューキャップ付きの市販のガラスまたはプラスチックバイアルを使用して、培養液を少量(5〜15 mLのBSK)に接種します。チューブをほぼいっぱいにして、微嫌気性または嫌気性雰囲気を作ります。チューブをしっかりと閉じます。この方法で培養すれば、CO2 は不要である。
- RF種(および B. persica)を撹拌または撹拌せずにインキュベーター内で37°Cで増殖させる。 B. burgdorferi sensu lato種を33-34°Cで育てる。
- 位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡を使用して、200倍から400倍の倍率で ボレリア 培養の成長を監視します(図3)。細胞を均一に分布させるには、培養液を血清学的ピペットで混合するか、3 mLトランスファーピペットでさらに混合しながらピペッティングします。
注: ボレリア は高倍率(200X〜400X)で最も目立ちますが、血球計算盤200倍の倍率で最もよく数えられます40. ボレリア の動きと形態は、これらの細菌の存在を示しています。 - 細菌の増殖を定量化するには、血球計算盤の両側の面積をカウントする16フィールドのグリッドパターンでいくつかの(10)個々の小さな正方形を数え、平均します。小さな正方形あたりの平均細胞数に、mLあたりの細胞数を決定するために使用する血球計算盤に適した変換係数を掛けます。
- 1〜2日間隔で細菌の増殖を監視します。 ボレリア の指数関数的増殖は生存率と細胞密度に依存し、34°Cで1週間以上かかる場合があります。 血球計算盤にロードする前に、1.7 mLチューブ内の培地で指数相培養を1:2または1:4の比率で希釈します。細胞数を決定する際には、希釈係数を適切に考慮してください。使用後、表面と血球計算盤に希釈漂白剤(10%)および/または70%エタノールをスプレーします。.
注: ボレリア は、細胞濃度が1〜5 x 107 細胞/ mLの場合、指数関数的に成長します。この範囲内であれば、細胞はよく成長する。 - 長時間の培養は栄養素を枯渇させ、培地のpHを変化させるため、継代培養が必要です。生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で、培養容量の1/10を新しいチューブに移し、新しい培地(前の継代を成長させるために使用したのと同じ培地の新鮮なアリコート)で満たします。1:10希釈が最適です。培養量を変更する場合は、それに応じて接種量を調整し、インキュベーションを継続します。継代数は、培地が変化するたびに増加します。
- DNAの抽出またはボレリア細胞の単離のために、指数相ボレリアを4000 x gで10分間遠心分離して、細菌をペレット化します。上清を適切なバイオハザード廃棄物に廃棄する。市販のDNA抽出キットでペレット化した細菌を処理するか、目的の実験に適した培地に細菌を再懸濁します。
- 各操作の最後に、機器に応じて、すべての機器をエタノールとUV放射で滅菌します。余分な培養液を含む廃液を廃液ボトルに回収し、最終濃度10%になるまで漂白剤を加えます。廃棄する前に、このボトルを-80°Cに置いてください。あるいは、オートクレーブにより漂白剤やアルコールを含まない廃液や培養液を殺菌する。
4. ボレリア 培養物の長期保存
- ボレリア培養物のグリセロールストックの調製
- 指数関数的段階培養の~1.8 mLアリコート、細胞濃度~107-10 8 細胞/mLを取り、滅菌グリセロールを最終濃度10%(濃度5%-20%の仕事)まで加えます。
- 2 mLスクリューキャップ極低温バイアルに入れます。-80°Cで保存してください。
- 冷凍庫に各菌株の少なくとも10本のチューブを入れた在庫を維持します。
- 永久貯蔵用のグリセロールストックを製造するための代替貯蔵レシピ
- ボレリア培養物の2/3をブルセラブロス中の15%グリセロールの1/3と混合します。滅菌濾過したddH 2Oの100mLに溶解した2.8gのブルセラブロスを使用する(0.22μm)。
- サンプルのグリセロールストックを-70°Cから-80°Cに保ちます。
5.環境または臨床源からのスピロヘータの分離
注意: 人間、動物、または環境源から材料を分離する場合は、必要に応じて、研究倫理、動物の世話、または生態学的認証を取得する必要があります。
- ハードダニからの ボレリア の栽培
- 成人の女性、男性、および/または幼虫ダニを収集します。
- すべてのダニサンプルを70%エタノールに2分間浸し、生物学的安全キャビネットで風乾して表面滅菌します。滅菌メスで個別にいくつかの部分に解剖します。抗生物質を添加した1.5 mLの培地を含む2 mLチューブに小片を入れます。
- 培養液を34°Cでインキュベートし、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡でスピロヘータを最初の2週間は週2回、その後は6週間(RFスピロヘータの場合はより頻繁に)チェックします。5 mLの同じ培地で継代培養陽性サンプル。
注:汚染された培養物は、0.2 μmフィルターを使用したろ過によってある程度精製できます。汚染を完全に解決するには、抗生物質が必要になる場合があります。
- 血液サンプルからの ボレリア の培養
注意: 血液サンプルは、材料の出所に応じて、資格のある医療、獣医、または研究の専門家が採取する必要があります。RTで24時間未満はサンプル間で経過する必要があります
取り外してラボに到着します。- 10 mLの血液を取得し、酸性クエン酸デキストロース(ACD;「イエロートップ」)を抗凝固剤として使用します。室温で放置してください。採血から接種まで24時間以内が推奨されます。
- 血液を抗凝固剤で200〜400 x g で10分間遠心分離して、血球から血漿を分離します。
- チューブから血漿を静かに取り出し、1 mLの血漿を5 mLの予熱されたMKP完全培地に接種します。MKPは抗生物質を補給することができます。ボレリアの成長が気付くまで(RF ボレリアの場合が多い)、最大9週間かかることがあるまで、毎日の目視検査と毎週の暗視野または位相差顕微鏡で培養物を33°Cでインキュベートします。
注意: 接種量が多いまたは小さい場合は、接種剤と培地の比率を1:5に維持してください。全血ではなく血清または血漿を使用してください。
- 皮膚生検からの ボレリア の栽培
- 皮膚生検(理想的には3 mm x 3 mm x 3 mmの立方体、つまり70%エタノールと過酸化水素)を表面滅菌します。生検サンプルを生理食塩水に入れます。
注意: 生検サンプルは、材料の出所に応じて、資格のある医療、獣医、または研究の専門家が採取する必要があります。RTで24時間未満は、サンプルを取り出してからラボに到着するまでに経過する必要があります。 - 生理食塩水に浸しながら、滅菌ガラスペトリ皿に滅菌かみそりの刃を使用してサンプルを2〜6個の小さな断片にさいの目に切る。皮膚生検を保存したすべてのサンプルと~1 mLの生理食塩水を、抗生物質を添加した5 mLの予熱培地に移し、33°Cでインキュベートします。
- 汚染細菌の異常増殖の場合は、上記のステップ1.1.10のように抗生物質を追加するか、スルファメトキサゾール(23.75 mg;最終濃度5 mg / mL)+トリメトプリム(1.25 mg; 0.25 mg / mL)またはバクトリム(最小阻害濃度>128 μg / mL)、アミカシン2錠(2 x 30 μg、最終濃度12 μg / mL)、 ホスフォマイシンの2錠(2 x 200 μg、最終濃度80 μg / mL)。.
注:すべての場合において、培養が試みられているボレリア種の抗生物質の最小阻害濃度を下回るようにしてください41,42,43。 - 培養物が ボレ リアに対して陽性である場合は、さらに3〜4日間、または ボレリア の量が40倍の対物レンズを使用して顕微鏡フィールドで10+スピロヘータに達するまで培養物を保持します。永久保存用のグリセロールストックを作成します。
- 皮膚生検(理想的には3 mm x 3 mm x 3 mmの立方体、つまり70%エタノールと過酸化水素)を表面滅菌します。生検サンプルを生理食塩水に入れます。
6. 固体培地培養による液体培養物からのB. burgdorferi sensu lato spirochetesおよびB. miyamotoiのモノクローナル集団の単離
- プレートを作るには、300 mLの1.5X MKP完全培地(ゼラチンなし)を温めます。また、200mLの1.7%アガロース(脱イオン水中でオートクレーブ滅菌、RTで保存、使用前にマイクロ波処理)を55°Cに温めた。 両方の液体を混ぜます。
- この混合物15mLを16枚の深部シャーレのそれぞれにピペットで入れ、底寒天オセレイヤーを作製した。
- 残りの培地を水浴中で55°Cに保持する。
注: ボレリア は上部のアガロース層に混合されます。 - まず、血球計算盤を使用して ボレリア 培養密度を定量し、液体培地で目的の密度に希釈します。
注意: プレートあたり500、200、100、および50のスピロヘータがうまく機能します。 - 底板が固まったら、残りのアガロース混合物10 mLを適切な数のスピロヘータを含む15 mLチューブに加えます。
- ラベルの付いたペトリ皿の底のアガロースに懸濁液を注ぎます。
注意: ボレリア ・スピロヘータは高温に敏感であるため、細菌が55°Cに長時間さらされないように注意する必要があります。培地中の菌体に加えたらすぐにトップ寒天を注ぎます。 - プレートが完全に固まったら、ペトリ皿を閉じ、2.5%CO2中で34〜35°Cで逆さまに置きます。
注:手順が成功した場合、コロニーはメッキの1週間後に現れます。 - 個々のコロニーをスクリーニングして拡張するには、プレートから単一のコロニーを選択し、滅菌2 mL培養チューブ内の1.5 mLの修飾液体MKPまたは他の適切な培地に入れます。
- 培養液を34°Cでインキュベートし、暗視野顕微鏡または位相顕微鏡でスピロヘータを調べます。上記のように作られた分析またはストックのためにこれらの培養物を使用してください。
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Representative Results
ボレリア 培地BSKおよびMKP、およびバリアントは、順次調製および滅菌する必要がある成分を含む豊富な培地です。正しく調製されると、BSK培地は赤橙色で透明になります(図1)。加温後も持続する濁度と沈殿は、問題のある成分、中程度の生産、または汚染を示しています。そのような培地は捨てるのが一番です。ゼラチンをBSKおよびMKPに添加すると、冷蔵すると培地はゼラチン状になります。温めると、わずかに粘性はありますが、液体になります。
純粋な ボレリア 培養物の成長は培地の濁度を変えません。しかしながら、細菌培養物、 ボレリア、ならびに汚染物質の増殖は、pH指示薬の結果として中程度の色を変化させるであろう。他の細菌による異常増殖は、濁りと凝集した物質を生成します(図2)。
培養の成長は、位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡によってモニターすることができる(図3 および 図4)。指数関数的段階の ボレリア 細胞は、典型的には細くてねじれており、ある程度運動性である。培養物が定常期に入るにつれて、丸い体がますます明らかになります(図5)。臨床的または環境的分離株には、多くの場合、複数の ボレリア 株および/または種が含まれています。純粋なクローンを単離するには、液体培養物を播種してモノクローナルコロニーを単離することができます(図6)。場合によっては、コロニー分離の複数回のラウンドが必要になる場合があります。
図1:BSKおよびMKP培地。 (A) ボレリア・ブルグドルフェリの純粋な培養物を用いたBSK(抗生物質を含む)。 B. burgdorferi 培地の有無にかかわらず、目に見える濁りがなく、オレンジ - 琥珀色です(色は成分によってわずかに異なります)。(b)MKP培地、未接種、融解。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:競合細菌の異常増殖を伴う汚染されたBSKおよびMKP培地。 培地は変色し、濁り、時間の経過とともに競合する細菌が死滅し、チューブの底に沈殿します。(A)生い茂ったBSKチューブ。(B)汚染細菌が沈殿した古いBSKチューブ。(C)MKPチューブ(左)と培養なし(中央)および汚染培養物(右)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: ボレリア の成長を監視するための血球計算盤の使用。 ボレリア・ブルグドルフェリ 株B31(矢印で示されたサブセット)を血球計算盤(小さなグリッドの1行は矢印で示す)で200倍の位相コントラストで見た。この倍率とプロセスにより、培養物のモニタリングと細胞密度の推定が可能になります。スケールバーは10μmです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ボレリア・ブルグドルフェリの暗視野画像。 ボレリア・ブルグドルフェリ株SCW-53の暗視野画像、MKP培地(400倍倍)での培養の5〜7日後の指数関数的段階での高密度での画像。スケールバーは20μmです。この株は、米国サウスカロライナ州で収集されたハードダニIxodes affinisから分離されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:古い文化におけるボレリア。 ボレリア細胞が古い培養で静止期に入るにつれて、丸い体型がスピロヘータ型に取って代わることがますます見られます。これらは休眠形態または死細胞であり得る。左パネル、ディタレステイン;中央パネル、免疫組織化学染色;右パネル、犬の尿を接種したボレリア培養物の蛍光in situハイブリダイゼーション(起源に基づいてB.ブルグドルフェリと推定されるが、種と株は分子的に特定されなかった)。図5のデータの収集は、Mrt. Allison University Animal Care Committee、承認番号16-1によって承認された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト・コンプレックス・スピロヘータ。ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体スピロヘータのコロニーは、純粋なクローン集団を単離するために固体培地上で増殖した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
細菌の実験室培養は研究の出発点です。培養能力によってもたらされる大きな利点は、梅毒の病因であるスピロヘータであるトレポネーマパリダムを培養するために、ごく最近成功に至った1世紀以上にわたる闘争によって例示されます44。ボレリア・スピロヘータも培養に挑戦的であるが、培養は可能である23、24、34、44、45、46、47、48、49である。
ボレリア細胞は潔癖であり、それぞれの種および株、さらには分離は、遺伝的にも、それらが単離された宿主への適応を通じても異なる51、52、53、54、55である。培地を作るとき、適切な成分の使用は、ボレリア文化の活力、あるいは培養の実行可能性さえも大きな違いをもたらします。新たに調製され、高度に濃縮され、適切に保存された培地の使用は、細菌の増殖を促進するために不可欠であり、細菌の増殖のための確立された要件です。ボレリアにとって、良好な成長には嫌気性または微好気性の状態を維持する必要があります。これは、チューブを上部まで充填することによって最も簡単に達成できるため、チューブ内に空気がほとんどまたはまったく残らず、攪拌せずに培養物を成長させることができます。酸素および二酸化炭素のより厳密な制御は、遺伝子発現および関連研究のために必要とされるかもしれない26、27、28、29、30。細菌培養培地への抗生物質の添加は直感に反するように思われるかもしれません。ボレリア培地での低用量の抗生物質の使用は、急速に成長する細菌の増殖を妨げることです。培養物に純粋なボレリア分離物を接種する場合、抗生物質の添加は必要ありません。ただし、臨床サンプルまたは環境サンプルを接種する際に競合する細菌からの異常増殖を防ぐために、抗生物質の追加の使用は不可欠です。BSK培地には、3%〜7%のゼラチンを補給することもできます。これはRFボレリア種21の成長に必要です。ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト種の成長のためのBSKまたはMKPの使用は、分離株の供給源に依存する。どちらの培地も確立された培養物の増殖を支持するが、MKPは、臨床的または環境的分離株で起こるような、ボレリア細胞の数の少ない新しい培養物を播種すると、より優れた性能を発揮することが見出されている23,24。この培地はまた、B. miyamotoi56、57、58の培養を可能にする。 結局のところ、潔癖な微生物を育てる科学には芸術の要素がありますが、それは注意と粘り強さで可能です。
ボレリアの文化は、生物医学研究の進歩の根底にあります。ボレリアの培養により、多くのボレリア種の全ゲノムとプロテオームの決定が可能になり、研究者はこれらのスピロヘータの進化と生物学を解明し始めることができました54,58,59。同様に、ボレリアの純粋培養物へのアクセスは、宿主免疫系との相互作用を含む、哺乳類宿主および節足動物ベクター61、62、63、64、65とのボレリアの多くの複雑な相互作用の理解を可能にし11、65、伝達のメカニズムを推測することを可能にする29、66、そして、培養可能な、したがって必然的に生きている細胞を細胞破片から区別するための重要な調査ツールを提供し、病因のメカニズムと効果的な治療レジメンを解明する上で重要な区別8,67,68,69,70,71。in vitroボレリア培養は、スピロヘータが検出に十分に豊富になるまでに数週間かかることがありますが、臨床診断アプリケーション、ボレリア生物学の基本的な理解、ゲノミクス、宿主と病原体の相互作用、およびその他の多くのアプリケーションは、純粋なボレリアを分離する能力に依存してきました。環境分離株からの培養、および生化学的および遺伝子分析のための十分な材料を生産するために培養を通じてそれらの分離株を増幅すること。迅速な診断と治療をサポートするために、感染症への迅速な対応に対する社会的推進力があります。しかし、このニーズの他の要素は、病気を適切かつ首尾よく治療および予防するための強固な基盤に必要な生物医学的および生物学的研究です。挑戦的ですが、ボレリア・スピロヘータのin vitro培養は可能であり、これらのニーズをサポートすることができます。
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Disclosures
利益相反は宣言されていません。
Acknowledgments
この作業は、カナダ自然科学工学研究評議会とカナダライム病財団(ABおよびVL)、スウェーデン研究評議会(SB、M-LF、IN)、TAČR GAMA 2プロジェクト-「生物学センターCASでのアプリケーションポテンシャル検証2.0のサポート」(TP01010022)(MGおよびNR)、およびチェコ共和国保健省NV19-05-00191(MGおよびNR)からの助成金によって部分的にサポートされました。図4の画像についてはS. Vranjes(2021、Rudenkoラボ)に、図5の画像についてはJ. Thomas-Ebbett(2021、ロイドラボ)に感謝します。この分野に貢献したすべての研究者に感謝し、スペースの制限のために引用できなかった研究者に謝罪します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 mL tubes | VWR | 87003-294 | Standard item - any supplier will do |
| 0.2 µm Sterile syringe filter | VWR | 28145-501 | Standard item - any supplier will do |
| 10 µL barrier pipette tip | Neptune | BT10XLS3 | Standard item - any supplier will do |
| 10 mL Serological pipettes | Celltreat | 229011B | Standard item - any supplier will do |
| 1000 µL barrier pipette tip | Neptune | BT1000.96 | Standard item - any supplier will do |
| 15 mL tube | Celltreat | 188261 | Standard item - any supplier will do |
| 20 µL barrier pipette tip | Neptune | BT20 | Standard item - any supplier will do |
| 20 mL Sterile syringe | BD | 309661 | Standard item - any supplier will do |
| 200 µL barrier pipette tip | Neptune | BT200 | Standard item - any supplier will do |
| 25 mL Screw Cap Culture Tubes | Fisher Scientific | 14-933C | Standard item - any supplier will do |
| 25 mL Serological pipettes | Celltreat | 229025B | Standard item - any supplier will do |
| 3 mL Sterile syringe | BD | 309657 | Standard item - any supplier will do |
| 35% BSA | Sigma | A-7409 | Source is important - see note |
| 5 mL Serological pipettes | Celltreat | 229006B | Standard item - any supplier will do |
| 50 mL tube | Celltreat | 229421 | Standard item - any supplier will do |
| 6.5 ml MKP glass tubes | Schott | Schott Nr. 26 135 115 | Standard item - any supplier will do |
| Amikacine | Sigma | PHR1654 | Standard item - any supplier will do |
| Amphotericin B | Sigma | A9528-100MG | Standard item - any supplier will do |
| Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazole | Sigma | PHR1126-1G | Standard item - any supplier will do |
| BBL Brucella broth | BD | 211088 | Standard item - any supplier will do |
| Biosafety Cabinet | Labconco | 302419100 | Standard item - any supplier will do |
| Blood collection tubes (yellow top - ACD) | Fisher Scientific | BD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD) | Standard item - any supplier will do |
| BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum] | Darlynn biologicals | BB83-500 | Standard item - any supplier will do |
| centrifuge | Eppendorf | model 5430 | Standard item - any supplier will do |
| Citric acid TrisodiumSaltDihydrate | Sigma | C-8532 100 g | Standard item - any supplier will do |
| CMRL | Gibco BRL | 21540 500 mL | Standard item - any supplier will do |
| CMRL-1066 | Gibco | 21-510-018 | Standard item - any supplier will do |
| Cryogenic Tubes (Nalgene) | Fisher Scientific | 5000-0020 | Standard item - any supplier will do |
| Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mm | Sigma | P7741 | Standard item - any supplier will do |
| Digital Incubator | VWR | model 1545 | Standard item - any supplier will do |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | Standard item - any supplier will do |
| Filters for filter sterilization | Millipore 0.22μm GPExpressPLUS Membrane | SCGPU05RE | Standard item - any supplier will do |
| Gelatin | Difco BD | 214340 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Glass Culture Tubes | Fisher Scientific | 99449-20 | Standard item - any supplier will do |
| Glucose | Sigma | G-7021 1 kg | Standard item - any supplier will do |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Standard item - any supplier will do |
| Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge ) | Labwissen | Model 3220 | Standard item - any supplier will do |
| HEPES | Sigma | H-3784 100 g | Standard item - any supplier will do |
| N-acetylglucoseamine | Sigma | A-3286 25 g | Standard item - any supplier will do |
| Neopeptone | Difco BD | 211681 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Neubauer Hematocytometer | Sigma | Z359629 | Standard item - any supplier will do |
| Phase contrast microscope | Leitz | Standard item - any supplier will do | |
| Phosphomycin | Sigma | P5396-1G | Standard item - any supplier will do |
| Phosphomycine | Sigma | P5396 | Standard item - any supplier will do |
| Pipetboy | Integra | Standard item - any supplier will do | |
| Precision Standard Balance | OHAUS | model TS200S | Standard item - any supplier will do |
| Pyruvic acid (Na salt) | Sigma | P-8574 25 g | Standard item - any supplier will do |
| Rabbit Serum | Gibco | 16-120-032 | Source is important |
| Rabbit Serum | Sigma | R-4505 100 mL | Source is important |
| Rifampicin | Sigma | R3501-1G | Standard item - any supplier will do |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S-5761 500 g | Standard item - any supplier will do |
| Sufametaxazole | Sigma | PHR1126 | Standard item - any supplier will do |
| TC Yeastolate | Difco BD | 255752 100 g | Standard item - any supplier will do |
| Transfer Pipettes | VWR | 470225-044 | Standard item - any supplier will do |
| Trimethoprim | Sigma | PHR1056 | Standard item - any supplier will do |
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