Summary
Att erhålla sterilisering är avgörande för trakeal vävnadstransplantation. Här presenterar vi ett steriliseringsprotokoll med lågdos gammabestrålning som tolereras fullt ut av organ.
Abstract
En av de viktigaste aspekterna för att säkerställa att en transplantation utvecklas korrekt är mediets sterilitet. Decellulariserad trakealtransplantation innebär att man implanterar ett organ som ursprungligen var i kontakt med miljön och därmed inte är sterilt från början. Medan decellulariseringsprotokollet (genom tvättmedelsexponering [2% natriumdodecylsulfat], kontinuerlig omrörning och osmotiska chocker) utförs i linje med aseptiska åtgärder, ger det inte sterilisering. Därför är en av de största utmaningarna att säkerställa sterilitet före implantation in vivo . Även om det finns etablerade gammastrålningssteriliseringsprotokoll för oorganiska material, finns det inga sådana åtgärder för organiska material. Dessutom kan de protokoll som finns för oorganiska material inte tillämpas på organiska material, eftersom den fastställda stråldosen (25 kGy) helt skulle förstöra implantatet. Denna uppsats studerar effekten av en eskalerad stråldos i en decellulariserad kaninluftstrupe. Vi bibehöll dosintervallet (kGy) och testade eskalerade doser tills vi hittade den minsta dos vid vilken sterilisering uppnås. Efter att ha bestämt dosen studerade vi effekterna av den på orgeln, både histologiskt och biomekaniskt. Vi bestämde att medan 0,5 kGy inte uppnådde sterilitet, gjorde doser på både 1 kGy och 2 kGy det, med 1 kGy, därför den minsta dos som krävs för att uppnå sterilisering. Mikroskopiska studier visade inga relevanta förändringar jämfört med icke-steriliserade organ. Axiala biomekaniska egenskaper förändrades inte alls, och endast en liten minskning av kraften per längdenhet som organet radiellt kan tolerera observerades. Vi kan därför dra slutsatsen att 1 kGy uppnår fullständig sterilisering av decellulariserade kaninluftstrupen med minimala, om några, effekter på organet.
Introduction
Sterilisering av ett implantat är en grundläggande förutsättning för dess livskraft; Faktum är att proteser som har visat sig vara framgångsrika är de som implanteras i sterila områden (blodkärl, hjärta, ben, etc.) 1. Luftstrupen har två ytor: en yta som är i kontakt med den yttre miljön, som därför inte är steril, och en yta mot mediastinum, som är steril. Därför är det inte ett sterilt organ från det ögonblick som luftstrupen extraheras. Trots att den efterföljande decellulariseringsprocessen utförs under maximala sterila förhållanden är det inte ett steriliseringssteg2. Implantationen av främmande material i sig medför en risk för infektion på grund av den antibakteriella mikromiljön som den producerar3och en upp till 0,014% risk för sjukdomsöverföring från givaren till mottagaren, även om materialet har steriliserats4. För att säkerställa korrekt vaskularisering av luftstrupen, i nästan alla experimentella transplantationsprotokoll, genomgår den först heterotopiskt implantat 5,6,7 till ett sterilt område (muskel, fascia, omentum, subkutant, etc.); Detta beror på att implantering av ett icke-sterilt element i detta medium skulle leda till infektion i området3.
Det finns en rad möjliga strategier för att få ett sterilt implantat. Användning av superkritisk CO2har uppnått terminal sterilisering 8,9. Andra metoder, såsom ultraviolett strålning eller behandling med ämnen som perättiksyra, etanol, syreperoxid och elektrolyserat vatten, har uppnått olika framgångsgrader vid sterilisering, nästan alltid beroende på deras doser, men de har visat sig påverka implantatens biomekaniska egenskaper. Faktum är att vissa ämnen, såsom etylenoxid, väsentligt kan förändra strukturen hos den implanterade matrisen och kan till och med orsaka oönskade immunogena effekter. Av denna anledning kan många av dessa strategier inte tillämpas på biologiska modeller 2,10,11,12,13.
Den mest studerade och accepterade steriliseringsstrategin är den som fastställts av ISO 11737-1: 2006-standarden för sterilisering av medicintekniska produkter implanterade i människor, med en gammastrålningsdos på 25 kGy. Denna förordning fokuserar emellertid endast på sterilisering av inerta, icke-biologiska element14,15. Dessutom är strålbehandlingsdoserna vid radikal behandling av karcinom tre storleksordningar lägre än de som används för att sterilisera medicintekniska produkter1. Med detta i åtanke kan vi dra slutsatsen att nämnda dos inte bara skulle döda mikrobioten utan också förstöra och radikalt förändra implantatets biologiska struktur. Det finns också en möjlighet att det skulle generera kvarvarande lipider vid nedbrytning, vilket potentiellt kan vara cytotoxiskt och påskynda den enzymatiska nedbrytningen av ställningen 13,14,15,16,17, även vid användning av doser så låga som 1,9 kGy och med skador som är direkt proportionella mot den mottagna strålningsdosen 17.
Således är syftet med detta dokument att försöka identifiera stråldosen som gör det möjligt att erhålla ett sterilt implantat med minimala skadliga effekter orsakade av bestrålning 2,18,19. Strategin vi följde involverade bestrålning av decellulariserade och bestrålade luftstrupar vid olika eskalerade doser inom ett intervall av kilograys (0,5, 1, 2, 3 kGy, etc.) tills vi uppnådde en negativ kultur. Ytterligare tester utfördes för de doser som uppnådde negativa kulturer för att bekräfta sterilisering. Efter bestämning av minimidosen för att erhålla sterilisering kontrollerades bestrålningens strukturella och biomekaniska inverkan på luftstrupen. Alla mätvärden jämfördes med kontrollens inhemska kaninluftstrupar. Steriliseringen av konstruktionen testades sedan in vivo genom att implantera luftstruparna i Nya Zeelands vita kaniner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Det europeiska direktivet 20170/63 / EU för vård och användning av försöksdjur följdes och studieprotokollet godkändes av etikkommittén vid universitetet i Valencia (lag 86/609 / EEG och 214/1997 och kod 2018 / VSC / PEA / 0122 typ 2 från regeringen i Valencia, Spanien).
1. Trakeal decellularisering
OBS: Decellulariseringsmetoden har rapporterats på annan plats20.
- Avliva donatorhanar vuxna Nya Zeeland vita kaniner (Oryctolagus cuniculus) som väger 3,5-4,1 kg med 133 mg/kg pentobarbitalnatrium, med en injektion på 200 mg/ml genom den marginella öronvenen.
- Samtidigt som du säkerställer aseptiska förhållanden, utför en central längsgående cervikotomi, dissekera livmoderhalsmusklerna och närma dig luftstrupen. Dissekera organet omkrets och längsgående. Slutligen transekt under den första ringen och strax ovanför carina.
- Dela luftstrupen i 2 cm bitar med en skalpell. Ta bort den omgivande bindväven och inre slemhinnan 6 medsax.
- Sänk ner proverna i 12 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innehållande 2% natriumdodecylsulfat (SDS), 5% penicillin-streptomycin och 5% amfotericin B.
- Utsätt luftstrupen för konstant omrörning med en magnetomrörare vid 400 rpm i 5 veckor vid rumstemperatur. Byt ut decellulariseringslösningen varje vecka efter en 2 h osmotisk chock, genom nedsänkning av luftstrupen i destillerat vatten.
- Kryogenera proverna med en 12 ml blandning av 80% fetalt bovint serum (FBS) och 20% dimetylsulfoxid (DMSO) i en frysbehållare vid -80 °C.
- När luftstrupen ska användas (efter 13-15 dagar), tina dem i ett vattenbad vid 37 °C och tvätta dem genom att sänka ner dem i PBS när upptiningen är klar.
2. Sterilisering
- Bestrålning
- Placera partier om fyra trakealstycken på vardera 2 cm i en 20 ml metakrylat i T25-odlingskolv fylld med PBS tills en total volym på 30 ml uppnås. Var noga med att förhindra att bubblor bildas, vilket kan orsaka energidiffusion i luft-vätskegränssnittet.
- Utför bestrålning med hjälp av en linjäraccelerator, med fotoner med en nominell energi på 10 MV utplattningsfilterfria strålar. Applicera en dosrat på 2 400 monitorenheter per minut vid isocentret och placera luftstruparna på ett avstånd av källytan på 100 cm som ska bestrålas, med ett skärpedjup på 2,5 cm för ett strålfält på 10 cm x 10 cm så att hela behållaren täcks så att det motsvarar en dos på 24 Gy/min.
- Eskalera doserna med varje fyrdelad sats; fyra stycken kommer att utsättas för 0,5 kGy, fyra till 1 kGy, fyra till 2 kG, etc., tills sterilisering uppnås.
- Kultur
- För in bitarna i 30 ml av Dulbeccos modifierade Eagle's medium (DMEM) med inaktiverad 10% FBS utan antibiotika eller antimykotika.
- Odla dem i en vanlig vävnadsinkubator vid 37 °C och 5%CO2 i 2 veckor och inspektera dem var 24: e timme.
OBS: Kontamineringsparametrarna är förändringar i odlingsmediets pH och följaktligen förändringar i mediets färg och grumlighet. Tracheas skördades från bakteriefria hardjur, som inte var sjuka och därför förväntades sakna anaeroba bakterier i luftstrupen.
3. Histologisk analys
OBS: Färga bitarna med hematoxylin och eosin21, Massons trikrom och orcein22.
- DAPI-färgning
- Bestäm vävnadens livskraft med DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol). Denna blåflorescerande fläck binder starkt till adenin- och tyminrika regioner i DNA-sekvenser och gör det därför möjligt att se DNA via fluorescensmikroskopi.
- Bädda in vävnadsproverna i optimal skärtemperatur (OCT).
- Skär proverna med en kryostat.
- Tvätta provet som skall färgas tre gånger i destillerat vatten för att avlägsna OCT. Placera i monteringsmedium som innehåller en 30 nM DAPI-lösning.
- Visualisera fluorescens med hjälp av fluorescensmikroskopi.
- Analys av DNA-innehåll
- Skär segment av luftstrupen som mäter ca 3 mm långa med en skalpell.
- Inkubera i 2 timmar i proteinas K (materialtabell).
- Extrahera DNA med ett DNA-extraktionskit, enligt tillverkarens instruktioner.
- Med hjälp av spektrofotometri bestäm koncentrationen av DNA genom att mäta absorbansen vid 260/280 med hjälp av en spektrofotometer.
- Mät storleken på de extraherade DNA-proverna med kapillärkromatografi med en bioanalysator.
4. Biomekanisk studie
OBS: Trakealbeständighet mot längsgående och tvärgående krafter mäts genom axiella drag- och radiella kompressionstester23.
- Trakeal mätning
- Mät trakeallängd, väggtjocklek och ytterdiameter med en Vernier-bromsok.
- Beräkna medelvärdena från tre slumpmässiga mätningar av var och en av variablerna.
- I de radiella kompressionstesterna beräknas anteroposterior diameter genom att detektera den punkt där plattan kommer i kontakt med provet.
- Utför alla tester vid rumstemperatur.
- Dragprov
- Utför dragprov på en UTM-förskjutningskontroll (Traction Desktop Universal Testing Machine), utrustad med en belastning på 100 N (0,1 N kraftupplösning, 0,001 mm position och 0,1 s). Testmaskinen är utrustad med kraft- och positionssensorer och är ansluten till en dator med programvara speciellt utformad av tillverkaren23.
- Spela in data var 0,4: e sekund och exportera till ett kalkylblad.
- Konstruera dragkäftar anpassade till kaninluftens genomsnittliga kaliber från rena monolager, giftfria kristallpolyvinylklorid (PVC) ihåliga rör med en ytterdiameter på 1 cm och en väggtjocklek på 1,5 mm.
- Dela ledningarna i 3 cm långa segment.
- Borra 12 förformade hål för terminoterminalsuturen, 2 mm från käftarnas kant och åtskilda med ett avstånd på 2,5 mm, för att förhindra förspänning på grund av suturerna.
- Fäst PVC-glasrören på kaninluftstrupen genom terminoterminal anastomos med en kontinuerlig sutur genom alternativa förformade hål (var 5 mm), 2 mm från luftrörets kant och med en 6-0 nylonmonofilamentsutur.
- Sträck alla bitar med en förskjutningshastighet på 5,0 mm / min.
- Anteckna variablerna maximal spänning (σ max, i N/mm2) och töjning (εmax, utan enheter), tillsammans med lagrad energi per enhet luftstrupsvolym (W/Vol, i mJ/mm) och Youngs modul (E, i MPa).
- Radiella kompressionstester
- Utför radiella kompressionstester på ett komprimeringsskrivbord UTM, utrustad med en 15 N belastningscell (kraftupplösning 0,001 N, position 0,001 mm och tid 0,1 s) för att erhålla kraftdata (N), position (mm) och tid (er). Spela in data och exportera till kalkylblad med 0,5 s intervall.
- Placera luftstruparna med membranområdet vilande på den nedre plattan. Plattan stiger gradvis upp mot topplattan med en konstant hastighet av 5 mm/min.
- Beräkna varje enhet per längdenhet av provet (f i N / mm), styvhet (R i Mpa·mm) och energin per ytenhet (W / S i mJ / mm2) som behövs för att helt täppa till luftstrupen.
5. Kirurgisk teknik
OBS: Den kirurgiska tekniken har rapporterats allmänt på andra håll20.
- Placera en steril intraluminal PVC-stent, storlek 14 Fr (som gör att den kan glida fritt utan att komprimera väggarna), med en marginal på 3-4 mm i varje ände.
- Fäst stenten med en enda 6-0 nylonmonofilamentsöm genom det första broskets interkartilaginösa utrymme.
- Fortsätt att bedöva kaninerna.
- Premedicinera försökspersonerna (3,65-4,05 kg hankaniner) med intramuskulära analgetika (35 mg/kg ketamin) med ett lugnande medel, muskelavslappnande och smärtstillande medel (2,5 mg/kg xylazin).
- Raka snittzonen ut ur operationszonen och rengör operationsområdet för att ta bort håret.
- Administrera analgetika plus antibiotikaprofylax: 0,05 mg/kg intramuskulärt buprenorfin och 10 mg/kg enrofloxacin.
- Sätt en venös kateter i den marginella öronvenen hos varje kanin.
- Induktionsanestesi med en intravenös bolus av propofol om 10 mg/kg.
- Övervaka djurets vitala tecken med hjälp av ett elektrokardiogram med tre ledningar, pulsoximetri och icke-invasiv tryckmätning. Var 30: e minut, applicera fysiologiskt serum på ögonen för att förhindra torrhet under anestesi.
- Verifiera bedövningsplanet med tåklämningsmetoden.
- Behåll anestesi med inhalerad isofluran vid 1,5% -2% av den minsta alveolära koncentrationen utan att förlora spontan ventilation och ge termiskt stöd till kaninen med en värmedyna.
- Desinficera snittzonen flera gånger i en cirkulär rörelse med en jodbaserad skrubba. Under aseptiska förhållanden hela tiden och med sterilt material, gör ett längsgående 3 cm centralt bröstsnitt och skörda bilaterala pedikerade flikar bestående av bröstfascia och en muskulär komponent.
- Vik luftstrupen med klaffen i fyra kaniner, en på varje hemithorax (alltså totalt åtta luftstrupar).
- När operationen är klar, vänd bedövningen genom att avbryta isofluranadministreringen.
- Postoperativ period
- Håll djuren i operationssalen tills de har återhämtat sig helt från anestesi. När de har återhämtat sig helt, återvänd dem till sin miljö med andra kaniner.
- Behandla kaninerna med antibiotika (0,5 ml/kg 2,5 % enrofloxacin) och smärtstillande medel (5 mg/ml meloxikam; 0,05 ml/kg metacam) var 24:e timme i 5:e dag.
- Lämna implantaten på plats under önskad tid.
- Före avlivning premedicinerar kaninerna med intramuskulära analgetika (35 mg/kg ketamin) och ett lugnande medel, muskelavslappnande och smärtstillande medel (2,5 mg/kg xylazin). Avliva sedan kaninerna med 133 mg/kg pentobarbitalnatrium med en injektion på 200 mg/ml genom den marginella öronvenen och skörda luftstrupen.
- Utför biomekaniska och histologiska tester på luftstrupen.
6. Statistisk analys
- Justera alla modeller med Bayesiansk metod på R-programvara, version 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019).
- Analysera studievariablerna, förutom f och R, med hjälp av flera linjära regressionsmodeller.
- För f - och R-variablerna , tillämpa blandade linjära regressionsmodeller. I dessa modeller, förutom de variabler av intresse som är relaterade till behandling och tillstånd för varje luftstrupe, introducera procentandelen ocklusion som en monotonisk effekt och en oberoende term per luftstrupe som en slumpmässig faktor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularisering
DAPI-färgning visar frånvaron av DNA, och inga DNA-värden högre än 50 ng detekterades i någon av luftstruparna någon genom elektrofores, med alla fragment mindre än 200 bp20.
Mikrobiell kultur
Två av de åtta bitarna som utsattes för 0,5 kGy visade färgförändring på mindre än 1 vecka. Ingen av bitarna som bestrålades vid 1 kGy och 2 kGy visade någon färgförändring (figur 1).
Histologisk analys
Inga förändringar i kollagen- eller elastiska fiberfördelningsmönster detekterades i något av de analyserade proverna (figur 2).
Bestämning av stråldosen
Med tanke på de ovan beskrivna resultaten, som visade att bestrålning vid 0,5 kGy inte säkerställde sterilisering av provet, medan doser på 1 kGy och 2 kGy gjorde det, fastställde vi den minsta möjliga bestrålningsdosen för att uppnå sterilisering av vävnaden som 1 kGy. Därför testade vi den biomekaniska effekten av denna dos på luftstrupen 2,17,23.
Biomekanisk studie
Axiella dragprov
De data som erhållits vid dragprovning på bestrålade luftstrupar visas i tabell 1. Figur 3 visar motsvarande spännings-töjningskurvor och brytpunkter.
Således orsakar exponering av trakealstycken för gammabestrålning för steriliseringsändamål, trots att de detekterade värdena ökar något, inte signifikanta effekter på organens axiella biomekaniska egenskaper. Därför är både σmax som luftstrupen tål (0,05 MPa; CI [-0,046, 0,144] MPa), liksom εmax (0,096 CI [-0,096, 0,281]), (0,022 MPa; CI [-0,23, 0,274] MPa) och W / Vol (från 0,044 mJ / mm3; CI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), ökar mycket svagt i detta urval, men är inte i något fall tillämpliga på populationsuppskattningen.
Radiella kompressionstester
Kompressionstesterna som utförts på både de inhemska luftstruparna (kontrollerna) och på de decellulariserade, kryokonserverade och bestrålade luftstruparna visas i tabell 2. Motsvarande diagram kan ses i figur 4.
Gammabestrålning orsakar endast en minimal men signifikant minskning av radiella biomekaniska egenskaper i den variabla kraften per längdenhet, som varierar med -0,017 N / mm; CI [-0,042, -0,004] N/mm, medan de minimala variationerna detekteras i W/Vol (0,044 mJ/mm3; CI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), R (-0,018 MPa · mm; CI [-0,145, 0,083] MPa · mm) och W/S (-0,081 mJ/mm2; CI [-0,95, 0,74] mJ/mm2) är inte i något fall tillämpliga på populationsuppskattningen (figur 5).
Implantat
Makroskopisk undersökning
Inget av djuren visade inflammatoriska eller infektiösa symtom under den postoperativa perioden; Deras diet återinfördes som planerat och antibiotika och smärtstillande medel avbröts på dag fem. Vid eutanasi observerades integration av luftstrupen och klaffen makroskopiskt, utan synliga tecken på inflammation.
Histologisk undersökning
Den histologiska undersökningen visade att klaffen bildade högorganiserad bindväv - nära kopplad till trakealringarna, vilket visar kontinuitet mellan dem och vävnaden - i form av perichondrium hos den inhemska luftstrupen. Brosket var intakt och visade inga tecken på nekros. Dessutom observerades närvaron av makrofager och några isolerade jätteceller som bildade ark. Förutom den knappa närvaron av eosinofiler observerades vanlig postoperativ mild akut inflammatorisk cellularitet (figur 6). Begynnande kärlnybildning observerades också runt luftstrupen.
Biomekanisk utvärdering
Efter att ha implanterats i lagomorfen förblev luftrörets egenskaper oförändrade, förutom kraften per längdenhet, som återhämtade egenskaperna hos den ursprungliga luftstrupen endast 2 veckor efter transplantationen (0,006 N / mm, CI [-0,026, 0,04] N / mm) (figur 7).
Figur 1: Bestrålade luftstrupar i DMEM utan antibiotika eller antimykotika. Färgen på de två proverna till vänster (0,5 kGy) har förändrats, vilket indikerar en förändring i pH, och är ett indirekt tecken på bakterietillväxt. Det finns också ökad grumlighet i det första provet till vänster. De två exemplaren till höger (1 kGy) visar ingen färgförändring. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Tracheas decellulariseras och bestrålas i olika doser. Varje rad motsvarar en annan färgning och varje kolumn till olika steriliseringsdosering. 1) Hematoxylin-eosin. Panoramautsikt över brosk, slemhinna, submucosa och serosa. 2) Massons trikroma fläck. Trakeal submucosa. 3) Hematoxylin-eosin. Detaljerad bild av trakealbrosket. a) Icke-bestrålade luftstrupar (kontroll). b) Tracheas bestrålade vid 0,5 kGy. c) Tracheas bestrålade vid 1 kGy. d) Tracheas bestrålade vid 2 kGy. Frånvaron av objektiva histologiska förändringar med avseende på stråldosen observeras. Förkortning: N = inhemska luftstrupen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Spännings-töjningskurvor för decellulariserade och bestrålade luftstrupar. Brytpunkten är markerad med orange. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kurvor för procentuell ocklusion motsvarande traktionsprovning i decellulariserade och bestrålade luftstrupar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Biomekanisk reaktion på bestrålning. a) Diagram över marginaleffekterna på den variabla kraften per längdenhet, i förhållande till den procentuella ocklusionen av bestrålningsinteraktionen. b) Diagram över marginaleffekter på den variabla kraften per längdenhet, i enlighet med procentandelen ocklusion av bestrålningsinteraktionen. (C) Partiellt beroendediagram för modellen för lagrad energi per ytenhet för bestrålningsvariabeln. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Vy över implanterad luftstrupe vid 2 veckor . (A) Massons trikromfärgning. Neoformad bindväv i den trakeala yttre ytan organiserad i koncentriska skikt av fibrer och celler observeras. b) Hematoxylin-eosin. Panoramautsikt över perfekt bevarat brosk. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Diagram över marginaleffekterna av interaktionen mellan kraft per längdenhet och procent av ocklusion och kontroll (inhemska) luftstrupar jämfört med luftstrupsimplantat vid 2 veckor. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Dragprovning av bestrålade luftstrupar. Kontroller är inhemska kaninluftstrupar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Kompressionsprovning av bestrålade, decellulariserade luftstrupar. Kontroller är inhemska kaninluftstrupar. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera steriliseringsstrategier som finns. Superkritisk CO2tränger helt in i vävnader, surgör mediet och dekonstruerar det cellulära fosfolipid-dubbelskiktet med enkel eliminering genom tryckavlastning av implantatet 8,14,25. Ultraviolett strålning har också använts, och dess effektivitet i gnagare luftstrupen har publicerats, även om det bara finns ett fåtal rapporter i litteraturen10. Andra metoder som används inkluderar applicering av ämnen såsom perättiksyra, etanol, syreperoxid eller elektrolyserat vatten, som har gett oregelbundna resultat och visat sig kraftigt påverka vävnad11,12. I motsats till de ovan nämnda strategierna har gammabestrålning inte bara visat sig vara helt effektiv när det gäller sterilisering, men har också studerats grundligt och rikligt, både med avseende på dess dos och steriliserande effekter. Faktum är att det har studerats så mycket att det finns en ISO-standard för användning av gammastrålning vid sterilisering, där dosen för sterilisering av inert material som ska implanteras hos människor fastställs vid 25 kGy13,14,15.
Å andra sidan, förutom steriliserande material, har bestrålning också visat sig orsaka säkerhetseffekter som en begränsning av tekniken. Dessa inkluderar förstörelse och förändring av matriser genom denaturering av proteinmolekyler, inklusive kollagen, och generering av kvarvarande molekyler, som till och med kan bli giftiga. Denna nedbrytning av organstrukturen påverkar följaktligen både dess biologiska och biomekaniska egenskaper, med de skadliga effekterna av bestrålning som är direkt proportionella mot dess dos och observeras vid relativt låga doser 13,14,15,16,17. Här var målet därför dubbelt: å ena sidan att erhålla en steril konstruktion för att säkerställa ett livskraftigt implantat och å andra sidan att bevara matrisens biologiska och biomekaniska egenskaper, eftersom implantatet skulle vara meningslöst om inte båda bibehölls26. Således var utmaningen att välja en strategi som möjliggjorde en balans mellan framgångsrik sterilisering och bevarande av vävnadsstruktur.
Häri fastställdes 1 kGy som minimidos för sterilisering. Histologisk undersökning visade att denna bestrålningsdos inte har någon inverkan på vävnaden. Vidare bestämde biomekanisk karakterisering av de bestrålade luftstruparna att användningen av bestrålning absolut inte gör någon skillnad för dragparametrarna. Det fanns en liten men statistiskt signifikant minskning av kraften per längdenhet som luftstrupen kunde tolerera i de radiella kompressionstesterna, men detta påverkar inte dess andra radiella egenskaper.
Även om det finns några artiklar som diskuterar omöjligheten av sterilisering och förstörelsen orsakad av doser så låga som 1,5 kGy 19, är de allra flesta i linje med de presenterade uppgifterna 2,18,19. På detta sätt observerar författarna att sterilisering av ben vid doser av10, 15, 20 och 25 kGy uppnår fullständig sterilisering, men i utbyte mot en minskning av cellinkubationskapaciteten och en ökning av kollagennedbrytningsprodukter vid doser högre än 15 kGy18. En dos på 1,5 kGy fick inte sterilisering i decellulariserade hjärtklaffar, men orsakade skador på provernas mekaniska egenskaper både in vivo och in vitro; Under tiden uppnådde en dos på 3 kGy sterilisering, men orsakade destruktion och fibros19. När det gäller luftstrupen jämförde Johnson et al. effekterna av sterilisering vid ISO-dosen 25 kGy med en dos på 5 kGy. Båda doserna erhöll terminal sterilisering, med dosen 5 kGy något som förändrade provets struktur något och dosen på 25 kGy fullständigt förstörde luftstrupen2.
Dessutom bekräftas effektiv sterilisering tack vare frånvaro av infektiösa händelser när det gäller implantatet efter 2 veckor, med sterilisering som tolereras fullt ut av organen. Dessutom var strukturen helt bevarad, utan nekros eller denaturering av orgeln. Vidare observerades som ett ytterligare fynd att den mindre förändringen i biomekaniska egenskaper - till den kraft som luftstrupen kan tolerera per längdenhet - återvände till värdena för en inhemsk luftstrupe endast 2 veckor efter implantation; Därför kan denna effekt bortses från enligt den slutliga hanteringen av konstruktionen.
Därför presenterar detta dokument möjligheten att erhålla helt sterila organ vid mycket lägre doser än den rekommenderade dosen på 25 kGy; Förslaget felsöker steriliseringen av Nya Zeelands kaninluftstrupar med en dos på 1 kGy. Denna dos säkerställer att de histologiska, ultrastrukturella och biomekaniska egenskaperna hos dessa organ bibehålls och visar perfekt tolerans mot implantationen. En begränsning av studien är att den endast utförs på steriliserade kaninluftstrupar, som i allmänhet kräver en lägre dos på grund av att den är mindre i storlek; Man kan emellertid dra slutsatsen att de alltför höga siffrorna som fastställs i ISO-standarden för inerta implantat inte är nödvändiga för sterilisering av decellulariserade luftstrupar, vilket är en stor prestation på grund av den kraftigt reducerade skadan på vävnaden. Dessutom, i framtida studier, beroende på djuret, och därmed på storleken på luftstrupen, kan dessa doser justeras till mycket lägre doser som följaktligen är mer respektfulla för organets struktur och funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta papper stöddes av 2018 Spanish Society of Thoracic Surgery Grant to National Multicentric Study [nummer 180101 tilldelas Néstor J.Martínez-Hernández] och PI16-01315 [tilldelas Manuel Mata-Roig] av Instituto de Salud Carlos III. CIBERER finansieras av VI National R&D &I Plan 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Program, CIBER Actions och Instituto de Salud Carlos III, med stöd från Europeiska regionala utvecklingsfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B.
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
