Summary
Trakea doku nakli için sterilizasyonun sağlanması şarttır. Burada, organlar tarafından tamamen tolere edilen düşük doz gama ışınlaması kullanan bir sterilizasyon protokolü sunuyoruz.
Abstract
Bir naklin doğru şekilde gelişmesini sağlamanın ana kilit yönlerinden biri, ortamın sterilitesidir. Desellülarize trakea transplantasyonu, başlangıçta çevre ile temas halinde olan ve böylece başlangıçtan itibaren steril olmayan bir organın implante edilmesini içerir. Desellülarizasyon protokolü (deterjan sunumu [% 2 sodyum dodesil sülfat], sürekli karıştırma ve ozmotik şoklar yoluyla) aseptik önlemlere uygun olarak gerçekleştirilirken, sterilizasyon sağlamaz. Bu nedenle, ana zorluklardan biri, in vivo implantasyondan önce sterilitenin sağlanmasıdır. İnorganik malzemeler için belirlenmiş gama radyasyonu sterilizasyon protokolleri olmasına rağmen, organik malzemeler için böyle bir önlem yoktur. Ek olarak, inorganik malzemeler için yürürlükte olan protokoller organik malzemelere uygulanamaz, çünkü belirlenen radyasyon dozu (25 kGy) implantı tamamen tahrip eder. Bu makale, desellülarize bir tavşan trakeasında artmış bir radyasyon dozunun etkisini incelemektedir. Doz aralığını (kGy) koruduk ve sterilizasyonun sağlandığı minimum dozu bulana kadar yükseltilmiş dozları test ettik. Dozu belirledikten sonra, hem histolojik hem de biyomekanik olarak organ üzerindeki etkilerini inceledik. 0.5 kGy'nin kısırlığa ulaşmamasına rağmen, hem 1 kGy hem de 2 kGy'lik dozların, 1 kGy ile sterilizasyon elde etmek için gerekli minimum doz olduğunu belirledik. Mikroskobik çalışmalar, sterilize edilmemiş organlara kıyasla ilgili bir değişiklik göstermedi. Eksenel biyomekanik özellikler hiç değişmedi ve organın radyal olarak tolere edebileceği birim uzunluk başına kuvvette sadece hafif bir azalma gözlendi. Bu nedenle, 1 kGy'nin, hücre dışı hale getirilmiş tavşan trakeasının organ üzerinde minimum düzeyde bir etkiye sahip olarak tam sterilizasyonunu sağladığı sonucuna varabiliriz.
Introduction
Bir implantın sterilizasyonu, yaşayabilirliği için temel bir gerekliliktir; Aslında başarılı olduğu kanıtlanmış protezler steril bölgelere (kan damarları, kalp, kemik vb.) implante edilen protezlerdir. 1. Trakeanın iki yüzeyi vardır: dış ortamla temas halinde olan, bu nedenle steril olmayan bir yüzey ve steril olan mediastene doğru bir yüzey. Bu nedenle, trakea çıkarıldığı andan itibaren steril bir organ değildir. Daha sonraki hücre desellülarizasyon işleminin maksimum steril koşullarda gerçekleştirilmesine rağmen, sterilizasyon adımı2 değildir. Yabancı maddenin kendi içine implantasyonu, ürettiği probakteriyel mikro çevre nedeniyle enfeksiyon riski taşır3ve materyal sterilize edilmiş olsa bile, donörden alıcıya% 0.014'e kadar hastalık bulaşma riski taşır4. Trakeanın doğru vaskülarizasyonunu sağlamak için, hemen hemen tüm deneysel nakil protokollerinde, önce steril bir alana (kas, fasya, omentum, deri altı, vb.) heterotopik implant 5,6,7 uygulanır; Bunun nedeni, steril olmayan bir elementin bu ortama implante edilmesinin, 3. alanın enfeksiyonuna yol açmasıdır.
Steril bir implant elde etmek için bir dizi olası strateji vardır. Süperkritik CO2kullanımı, terminal sterilizasyonu 8,9'u sağlamıştır. Ultraviyole radyasyon veya perasetik asit, etanol, oksijen peroksit ve elektrolize su gibi maddelerle tedavi gibi diğer yöntemler, sterilizasyonda, neredeyse her zaman dozajlarına bağlı olarak farklı başarı oranları elde etmişlerdir, ancak implantların biyomekanik özelliklerini etkiledikleri gösterilmiştir. Gerçekten de, etilen oksit gibi bazı maddeler, implante edilen matrisin yapısını önemli ölçüde değiştirebilir ve hatta istenmeyen immünojenik etkilere neden olabilir. Bu nedenle, bu stratejilerin birçoğu biyolojik modellere uygulanamaz 2,10,11,12,13.
En çok çalışılan ve kabul gören sterilizasyon stratejisi, insanlara implante edilen tıbbi cihazların sterilizasyonu için ISO 11737-1: 2006 standardı tarafından 25 kGy'lik bir gama radyasyon dozu ile oluşturulan stratejidir. Bununla birlikte, bu düzenleme sadece inert, biyolojik olmayan elementlerin sterilizasyonuna odaklanmaktadır14,15. Ek olarak, karsinomun radikal tedavisinde radyoterapi dozları, tıbbi cihazları sterilize etmek için kullanılanlardan üç kat daha düşüktür1. Bunu akılda tutarak, söz konusu dozun sadece mikrobiyotayı öldürmekle kalmayıp aynı zamanda implantın biyolojik yapısını tahrip edeceği ve radikal bir şekilde değiştireceği sonucuna varabiliriz. Ayrıca, 1.9 kGy kadar düşük dozlar kullanıldığında ve17 alınan radyasyon dozuyla doğru orantılı hasar olsa bile, potansiyel olarak sitotoksik olabilen ve iskele 13,14,15,16,17'nin enzimatik bozunmasını hızlandırabilen bozunma üzerine artık lipitler üretme olasılığı da vardır.
Bu nedenle, bu makalenin amacı, ışınlamanın neden olduğu minimum zararlı etkiyle steril bir implantın elde edilmesini sağlayan radyasyon dozunu tanımlamaya çalışmaktır 2,18,19. İzlediğimiz strateji, negatif bir kültür elde edene kadar bir dizi kilogray (0.5, 1, 2, 3 kGy, vb.) içinde farklı dozlarda desellülarize edilmiş ve ışınlanmış trakeaların ışınlanmasını içeriyordu. Sterilizasyonu doğrulamak için negatif kültürlere ulaşan dozlar için ek testler yapılmıştır. Sterilizasyon elde etmek için minimum doz belirlendikten sonra, ışınlamanın trakea üzerindeki yapısal ve biyomekanik etkisi kontrol edildi. Tüm metrikler kontrol yerli tavşan trakeası ile karşılaştırıldı. Yapının sterilizasyonu daha sonra trakeaları Yeni Zelanda beyaz tavşanlarına implante ederek in vivo olarak test edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için 20170/63/EU sayılı Avrupa direktifine uyulmuş ve çalışma protokolü Valencia Üniversitesi Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (Yasa 86/609/EEC ve 214/1997 ve Kod 2018/VSC/PEA/0122 Tip 2 Valencia, İspanya).
1. Trakeal desellülarizasyon
NOT: Hücre sökümsüzleştirme yöntemi başka bir yerde bildirilmiştir20.
- Ötenazi donör erkek yetişkin Yeni Zelanda beyaz tavşanları (Oryctolagus cuniculus), marjinal kulak damarından 200 mg / mL enjeksiyon kullanılarak, 133 mg / kg pentobarbital sodyum ile 3.5-4.1 kg ağırlığındadır.
- Aseptik koşulları sağlarken, merkezi uzunlamasına servikotomi yapın, servikal kasları diseke edin ve trakeaya yaklaşın. Organı çevresel ve boyuna olarak diseke edin. Son olarak, ilk halkanın altında ve karinanın hemen üstünde transekt yapın.
- Bir neşterle, trakeaları 2 cm'lik parçalara ayırın. Makasla, çevredeki bağ dokusunu ve iç mukoza tabakasınıçıkarın 6.
- Numuneleri% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS),% 5 penisilin-streptomisin ve% 5 amfoterisin B içeren 12 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisine daldırın.
- Trakeaları oda sıcaklığında 5 hafta boyunca 400 rpm'de manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırmaya maruz bırakın. Desellülarizasyon çözeltisini, trakeanın damıtılmış suya daldırılması yoluyla, 2 saatlik bir ozmotik şoktan sonra haftalık olarak değiştirin.
- -80 ° C'de bir dondurma kabında% 80 fetal sığır serumu (FBS) ve% 20 dimetil sülfoksit (DMSO) 12 mL'lik bir karışım kullanarak numuneleri kriyojenize edin.
- Trakealar kullanılacaksa (13-15 gün sonra), 37 ° C'de bir su banyosunda çözün ve çözülme tamamlandıktan sonra PBS'ye batırarak yıkayın.
2. Sterilizasyon
- Işınlama
- PBS ile doldurulmuş T25 kültür şişesine her biri 2 cm büyüklüğünde dört trakea parçasından oluşan partileri, toplam 30 mL hacme ulaşana kadar 20 mL'lik bir metakrilat içine yerleştirin. Hava-sıvı arayüzünde enerji difüzyonuna neden olabilecek kabarcıkların oluşmasını önlemeye dikkat edin.
- 10 MV düzleştirici filtresiz ışınların nominal enerjisine sahip fotonlarla doğrusal bir hızlandırıcı kullanarak ışınlama yapın. İzomerkezde dakikada 2.400 monitör ünitesi doz hızı uygulayın, trakeaları ışınlanacak 100 cm'lik bir kaynak-yüzey mesafesine, 10 cm x 10 cm'lik bir radyasyon alanı için 2,5 cm'lik bir alan derinliğine yerleştirin, böylece tüm kabı kaplayacak şekilde - 24 Gy / dak'lık bir doza karşılık gelir.
- Her dört parçalı parti ile dozları yükseltin; sterilizasyona ulaşılana kadar dört parça 0,5 kGy, dört ila 1 kGy, dört ila 2 kG, vb.
- Kültür
- Parçaları, antibiyotik veya antifungaller olmadan inaktive edilmiş% 10 FBS ile Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium'unun (DMEM) 30 mL'sine yerleştirin.
- Onları 2 hafta boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de standart bir doku inkübatöründe kültürleyin ve her 24 saatte bir kontrol edin.
NOT: Kontaminasyon parametreleri, kültür ortamının pH'ındaki değişiklikler ve buna bağlı olarak ortamın rengindeki ve bulanıklığındaki değişikliklerdir. Trakealar, hasta olmayan ve bu nedenle trakealarında anaerobik bakterilerden yoksun olması beklenen mikropsuz lagomorflardan toplandı.
3. Histolojik analiz
NOT: Hematoksilin ve eozin21, Masson'un trikromu ve orcein22 kullanarak parçaları lekeleyin.
- DAPI boyama
- DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol) kullanarak doku canlılığını belirleyin. Bu mavi-floresan leke, DNA dizilerindeki adenin ve timin bakımından zengin bölgelere güçlü bir şekilde bağlanır ve bu nedenle DNA'nın floresan mikroskobu ile görüntülenmesine izin verir.
- Doku numunelerini optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiğine gömün.
- Numuneleri bir kriyostat kullanarak kesin.
- OCT'yi çıkarmak için boyanacak numuneyi damıtılmış suda üç kez yıkayın. 30 nM DAPI çözeltisi içeren montaj ortamına yerleştirin.
- Floresan mikroskobu kullanarak floresanı görselleştirin.
- DNA içerik analizi
- Bir neşter kullanarak yaklaşık 3 mm uzunluğundaki trakea segmentlerini kesin.
- Proteinaz K'da 2 saat inkübe edin (Malzeme Tablosu).
- Üreticinin talimatlarını izleyerek DNA'yı bir DNA ekstraksiyon kiti ile çıkarın.
- Spektrofotometri sayesinde, bir spektrofotometre kullanarak 260/280'de absorbansı ölçerek DNA konsantrasyonunu belirleyin.
- Bir biyoanalizör ile kılcal kromatografi kullanarak ekstrakte edilen DNA örneklerinin boyutunu ölçün.
4. Biyomekanik çalışma
NOT: Uzunlamasına ve enine kuvvetlere karşı trakeal direnç, eksenel çekme ve radyal sıkıştırma testleri ile ölçülür23.
- Trakea ölçümü
- Bir Vernier kaliperi kullanarak trakea uzunluğunu, duvar kalınlığını ve dış çapı ölçün.
- Değişkenlerin her birinin üç rastgele ölçümünden ortalama değerleri hesaplayın.
- Radyal sıkıştırma testlerinde, plakanın numune ile temas ettiği noktayı tespit ederek anteroposterior çapı hesaplayın.
- Tüm testleri oda sıcaklığında gerçekleştirin.
- Çekme testleri
- 100 N yük (0,1 N kuvvet çözünürlüğü, 0,001 mm konum ve 0,1 sn) ile donatılmış bir çekiş masaüstü üniversal test cihazı (UTM) deplasman kontrolünde çekme testleri gerçekleştirin. Test makinesi kuvvet ve konum sensörleri ile donatılmıştır ve üretici23 tarafından özel olarak tasarlanmış yazılıma sahip bir bilgisayara bağlanır.
- Verileri her 0,4 saniyede bir kaydedin ve bir elektronik tabloya aktarın.
- Dış çapı 1 cm ve duvar kalınlığı 1,5 mm olan saf tek katmanlı, toksik olmayan kristal polivinil klorür (PVC) içi boş tüplerden tavşan trakealarının ortalama kalibresine uyarlanmış çekme çeneleri oluşturun.
- Bölümler 3 cm uzunluğunda bölümlere ayrılır.
- Dikişlerden kaynaklanan sapmayı önlemek için termino-terminal sütür için, çenelerin kenarından 2 mm uzakta ve 2,5 mm'lik bir mesafe ile ayrılmış 12 önceden oluşturulmuş delik açın.
- PVC cam tüpleri, termino-terminal anastomoz ile tavşan trakeasına, alternatif önceden oluşturulmuş deliklerden (her 5 mm'de bir), trakeanın kenarından 2 mm uzakta ve 6-0 naylon monofilament sütürle sürekli bir sütür ile tutturun.
- Tüm parçaları 5,0 mm/dak deplasman hızında gerin.
- Maksimum gerilim (σ maksimum, N/mm2 cinsinden) ve gerinim (εmaksimum, birim olmadan) değişkenlerini, trakea hacmi birimi başına depolanan enerji (W/Vol, mJ/mm cinsinden) ve Young modülü (E, MPa cinsinden) ile birlikte kaydedin.
- Radyal basma testleri
- Kuvvet verileri (N), konum (mm) ve zaman (lar) elde etmek için 15 N yük hücresi (kuvvet çözünürlüğü 0,001 N, konum 0,001 mm ve zaman 0,1 s) ile donatılmış bir sıkıştırma masaüstü UTM'sinde radyal sıkıştırma testleri gerçekleştirin. Verileri kaydedin ve 0,5 s aralıklarla elektronik tabloya aktarın.
- Trakeaları membranöz alan alt plakaya dayanacak şekilde yerleştirin. Plaka kademeli olarak üst plakaya doğru 5 mm/dak sabit bir hızla yükselir.
- Trakeayı tamamen tıkamak için gereken numunenin uzunluk birimi başına her birimi (N / mm cinsinden f), sertliği (Mpa · mm'de R) ve yüzey alanı birimi başına enerjiyi (mJ /mm2'de W / S) hesaplayın.
5. Cerrahi teknik
NOT: Cerrahi teknik20 başka yerde yaygın olarak bildirilmiştir.
- Her iki ucunda 3-4 mm'lik bir kenar boşluğu olan 14 Fr boyutunda (duvarları sıkıştırmadan serbestçe kaymasını sağlayan) steril bir intraluminal PVC stent yerleştirin.
- Stenti, ilk kıkırdağın kıkırdak boşluğundan tek bir 6-0 naylon monofilament dikişle sabitleyin.
- Tavşanları uyuşturmaya devam edin.
- Deneklere (3.65-4.05 kg erkek Yeni Zelanda beyaz tavşanları) kas içi analjeziklerle (35 mg / kg ketamin) yatıştırıcı, kas gevşetici ve analjezik (2.5 mg / kg ksilazin) ile ön ilaç verin.
- Kesi bölgesini ameliyat bölgesinden tıraş edin ve saçları çıkarmak için cerrahi bölgeyi temizleyin.
- Analjezikler artı antibiyotik profilaksisi uygulayın: 0.05 mg / kg kas içi buprenorfin ve 10 mg / kg enrofloksasin.
- Her tavşanın marjinal kulak damarına bir venöz kateter koyun.
- İntravenöz 10 mg/kg bolus propofol ile indüksiyon anestezisi.
- Üç uçlu elektrokardiyogram, nabız oksimetresi ve invaziv olmayan basınç ölçümü kullanarak hayvanın hayati belirtilerini izleyin. Her 30 dakikada bir, anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlere fizyolojik serum uygulayın.
- Ayak parmağı çimdikleme yöntemini kullanarak anestezik düzlemi doğrulayın.
- Spontan ventilasyonu kaybetmeden minimum alveoler konsantrasyonun% 1.5 -% 2'sinde inhale izofluran ile anesteziyi sürdürün ve tavşana bir ısıtma yastığı ile termal destek sağlayın.
- Kesi bölgesini iyot bazlı bir ovma ile dairesel bir hareketle birkaç kez dezenfekte edin. Her zaman aseptik koşullar altında ve steril malzeme ile, uzunlamasına 3 cm'lik merkezi torasik insizyon yapın ve pektoral fasyadan ve kaslı bir bileşenden oluşan bilateral pediküllü flepleri toplayın.
- Trakeaları fleple birlikte dört tavşanda, her hemitoraksta bir tane olmak üzere sarın (böylece toplam sekiz trakea).
- Ameliyat tamamlandığında, izofluran uygulamasını keserek anesteziyi tersine çevirin.
- Ameliyat sonrası dönem
- Hayvanları anesteziden tamamen iyileşene kadar ameliyathanede tutun. Tamamen iyileştiklerinde, onları diğer tavşanlarla birlikte çevrelerine geri getirin.
- Tavşanlara 5 gün boyunca her 24 saatte bir antibiyotik (0.5 mL / kg% 2.5 enrofloksasin) ve analjezikler (5 mg / mL meloksikam; 0.05 mL / kg metacam) uygulayın.
- İmplantları istediğiniz süre boyunca yerinde bırakın.
- Ötanaziden önce, tavşanlara kas içi analjezikler (35 mg / kg ketamin) ve yatıştırıcı, kas gevşetici ve analjezik (2.5 mg / kg ksilazin) ile ön ilaç verin. Daha sonra marjinal kulak damarından 200 mg / mL enjeksiyon kullanarak tavşanları 133 mg / kg pentobarbital sodyum ile ötenazi yapın ve trakeaları toplayın.
- Trakealarda biyomekanik ve histolojik testler yapın.
6. İstatistiksel analiz
- Tüm modelleri R yazılımı, Sürüm 3.5.3 R Core (R Foundation for Statistical Computing. 2019) üzerindeki Bayes yöntemiyle ayarlayın.
- Birden fazla doğrusal regresyon modeli kullanarak f ve R dışındaki etüt değişkenlerini analiz edin.
- f ve R değişkenleri için karışık doğrusal regresyon modelleri uygulayın. Bu modellerde, her trakeanın tedavisi ve durumu ile ilgili ilgi değişkenlerine ek olarak, tıkanıklık yüzdesini monotonik bir etki olarak ve trakea başına bağımsız bir terimi rastgele bir faktör olarak tanıtmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hücre Giderimciliği
DAPI boyaması, DNA'nın yokluğunu gösterir ve trakeaların hiçbirinde elektroforez ile 50 ng'den yüksek DNA değerleri tespit edilmemiştir, tüm fragmanlar 200 bp20'den küçüktür.
Mikrobiyal kültür
0.5 kGy'ye maruz bırakılan sekiz parçadan ikisi, 1 haftadan kısa sürede renk değişikliği gösterdi. 1 kGy ve 2 kGy'de ışınlanan parçaların hiçbirinde renk değişikliği görülmedi (Şekil 1).
Histolojik analiz
Analiz edilen örneklerin hiçbirinde kollajen veya elastik lif dağılım paterninde herhangi bir değişiklik tespit edilmemiştir (Şekil 2).
Radyasyon dozunun belirlenmesi
Yukarıda açıklanan sonuçlar göz önüne alındığında, 0.5 kGy'de ışınlamanın numunenin sterilizasyonunu sağlamadığını, oysa 1 kGy ve 2 kGy'lik dozların yaptığını gösterdik, dokunun sterilizasyonunu sağlamak için mümkün olan minimum ışınlama dozunu 1 kGy olarak belirledik. Bu nedenle, bu dozun trakeas 2,17,23 üzerindeki biyomekanik etkisini test ettik.
Biyomekanik çalışma
Eksenel çekme testleri
Işınlanmış trakealar üzerindeki çekme testinde elde edilen veriler Tablo 1'de gösterilmiştir. Şekil 3 , karşılık gelen gerilim-gerinim eğrilerini ve kırılma noktalarını göstermektedir.
Bu nedenle, trakea parçalarının sterilizasyon amacıyla gama ışınlamasına tabi tutulması, tespit edilen değerleri biraz arttırmasına rağmen, organların eksenel biyomekanik özellikleri üzerinde önemli etkilere neden olmaz. Bu nedenle, trakeaların tolere edebileceği maksimum σ (0.05 MPa; CI [-0.046, 0.144] MPa) ve εmaksimum (0.096 CI [-0.096, 0.281]), (0.022 MPa; CI [-0.23, 0.274] MPa) ve W / Vol (0.044 mJ /mm3'ten itibaren; CI [-0.018, 0.106] mJ/mm3), bu örnekte çok az artmıştır, ancak hiçbir durumda popülasyon tahmini için geçerli değildir.
Radyal basma testleri
Hem doğal trakealarda (kontroller) hem de desellülarize, kriyoprezerve edilmiş ve ışınlanmış trakealarda yapılan kompresyon testleri Tablo 2'de gösterilmiştir. İlgili grafikler Şekil 4'te görülebilir.
Gama ışınlaması, -0.017 N / mm ile değişen uzunluk birimi başına değişken kuvvette radyal biyomekanik özelliklerde sadece minimal fakat önemli bir azalmaya neden olur; CI [-0.042, -0.004] N/mm, W/Vol (0.044 mJ/mm3; CI [-0,018, 0,106] mJ/mm3), R (-0,018 MPa · mm; CI [-0,145, 0,083] MPa · mm) ve W/S (-0,081 mJ/mm2; CI [-0.95, 0.74] mJ/mm2), hiçbir durumda popülasyon tahminine uygulanamaz (Şekil 5).
Implant
Makroskopik inceleme
Hayvanların hiçbiri postoperatif dönemde enflamatuar veya enfeksiyöz semptomlar göstermedi; Diyetleri planlandığı gibi eski haline getirildi ve beşinci günde antibiyotik ve analjezikler askıya alındı. Ötanazi üzerine, trakea ve flebin entegrasyonu makroskopik olarak gözlendi, gözle görülür bir inflamasyon belirtisi yoktu.
Histolojik inceleme
Histolojik inceleme, flebin yüksek oranda organize bağ dokusu oluşturduğunu gösterdi - trakea halkalarına yakından bağlı, bunlar ve doku arasında süreklilik gösteren - doğal trakeanın perikondriyumu şeklinde. Kıkırdak sağlamdı ve nekroz belirtisi göstermedi. Ek olarak, makrofajların ve tabakaları oluşturan bazı izole dev hücrelerin varlığı gözlenmiştir. Eozinofillerin kıt varlığı dışında, cerrahi sonrası olağan hafif akut inflamatuar hücresellik gözlendi (Şekil 6). Trakea çevresinde yeni başlayan neovaskülarizasyon da gözlendi.
Biyomekanik değerlendirme
Lagomorfa implante edildikten sonra, trakeanın özellikleri, transplantasyondan sadece 2 hafta sonra doğal trakeanın özelliklerini geri kazandıran birim uzunluk başına kuvvet dışında değişmeden kalmıştır (0.006 N / mm, CI [-0.026, 0.04] N / mm) (Şekil 7).
Şekil 1: DMEM'de antibiyotik veya antifungal içermeyen ışınlanmış trakealar. Soldaki iki örneğin rengi (0.5 kGy) değişmiştir, bu da pH'ta bir değişiklik olduğunu gösterir ve bakteriyel büyümenin dolaylı bir işaretidir. Soldaki ilk örnekte de bulanıklık artmıştır. Sağdaki iki örnek (1 kGy) renk değişikliği göstermez. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Trakeas desellülarize edilmiş ve farklı dozlarda ışınlanmıştır. Her sıra farklı bir boyamaya ve her sütun farklı sterilizasyon dozajına karşılık gelir. 1) Hematoksilin-eozin. Kıkırdak, mukoza, submukoza ve serozanın panoramik görünümü. 2) Masson'un trikrom lekesi. Trakeal submukoza. 3) Hematoksilin-eozin. Trakeal kıkırdağın ayrıntılı görünümü. (A) Işınlanmamış trakealar (kontrol). (B) Trakealar 0,5 kGy'de ışınlanır. (C) 1 kGy'de ışınlanan trakealar. (D) 2 kGy'de ışınlanan trakealar. Radyasyon dozuna göre objektif histolojik değişikliklerin yokluğu gözlenir. Kısaltma: N = doğal trakea. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hücreden arındırılmış ve ışınlanmış trakealar için gerilme-gerinim eğrileri. Kırılma noktası turuncu renkle işaretlenmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hücresizleştirilmiş ve ışınlanmış trakealardaki traksiyon testlerine karşılık gelen tıkanıklık yüzdesi için eğriler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Işınlamaya biyomekanik yanıt. (A) Işınlama etkileşiminin tıkanma yüzdesine göre, birim uzunluk başına değişken kuvvet üzerindeki marjinal etkilerin grafiği. (B) Işınlama etkileşiminin tıkanma yüzdesine göre, birim uzunluk başına değişken kuvvet üzerindeki marjinal etkilerin grafiği. (C) Işınlama değişkeni için birim alan modeli başına depolanan enerjinin kısmi bağımlılık grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İmplante edilen trakeanın 2. haftada görünümü . (A) Masson'un trikrom boyaması. Trakeal dış yüzeyin konsantrik lif ve hücre tabakalarında organize olmuş neoformlu bağ dokusu gözlenir. (B) Hematoksilin-eozin. Mükemmel korunmuş kıkırdağın panoramik görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: 2 haftada trakea implantlarına karşı birim uzunluk başına kuvvet ile oklüzyon ve kontrol (doğal) trakea yüzdesi arasındaki etkileşimin marjinal etkilerinin grafiği. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Işınlanmış trakealarda çekme testleri. Kontroller yerli tavşan trakealarıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: Işınlanmış, desellülarize trakealarda kompresyon testleri. Kontroller yerli tavşan trakealarıdır. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Var olan birkaç sterilizasyon stratejisi vardır. Süperkritik CO2, dokulara tamamen nüfuz eder, ortamı asitleştirir ve implantın basınçsızlaştırılması yoluyla basit eliminasyonla hücresel fosfolipid çift katmanını dekonstrüksiyona uğratır 8,14,25. Ultraviyole radyasyon da kullanılmıştır ve literatürde sadece birkaç rapor olmasına rağmen, kemirgen trakeasındaki etkinliği yayınlanmıştır10. Kullanılan diğer yöntemler arasında, düzensiz sonuçlar veren ve dokuyu büyük ölçüde etkilediği gösterilen perasetik asit, etanol, oksijen peroksit veya elektrolize su gibi maddelerin uygulanması yer almaktadır11,12. Yukarıda belirtilen stratejilerin aksine, gama ışınlamasının sadece sterilizasyon açısından tamamen etkili olduğu gösterilmemiş, aynı zamanda hem dozu hem de sterilizasyon etkileri açısından kapsamlı ve bol miktarda çalışılmıştır. Aslında, sterilizasyonda gama radyasyonunun kullanımı için bir ISO standardı olduğu ve insanlara implante edilecek inert malzemenin sterilizasyonu için dozun 25 kGy13,14,15 olarak belirlendiği çok çalışılmıştır.
Öte yandan, sterilize edici malzemeye ek olarak, ışınlamanın da tekniğin bir sınırlaması olarak kollateral etkilere neden olduğu gösterilmiştir. Bunlar, kollajen de dahil olmak üzere protein moleküllerini denatüre ederek ve hatta toksik hale gelebilecek artık moleküller üreterek matrislerin yok edilmesini ve değiştirilmesini içerir. Sonuç olarak, organ yapısındaki bu bozulma, hem biyolojik hem de biyomekanik özelliklerini etkiler, ışınlamanın zararlı etkileri dozuyla doğru orantılıdır ve nispeten düşük dozlarda gözlenmektedir 13,14,15,16,17. Bu nedenle burada amaç iki yönlüydü: bir yandan, uygulanabilir bir implant sağlamak için steril bir yapı elde etmek, diğer yandan matrisin biyolojik ve biyomekanik özelliklerini korumak, çünkü her ikisi de korunmadıkça implant boşuna olacaktır26. Bu nedenle, zorluk, başarılı sterilizasyon ile doku yapısını koruma arasında bir denge kurulmasına izin veren bir strateji seçmekti.
Burada, sterilizasyon için minimum doz olarak 1 kGy belirlenmiştir. Histolojik inceleme, bu ışınlama dozunun doku üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermiştir. Ayrıca, ışınlanmış trakeaların biyomekanik karakterizasyonu, ışınlama kullanımının çekiş parametrelerinde kesinlikle bir fark yaratmadığını belirlemiştir. Radyal sıkıştırma testlerinde trakeanın tolere edebildiği birim uzunluk başına kuvvette hafif fakat istatistiksel olarak anlamlı bir azalma olmuştur, ancak bu diğer radyal özelliklerini etkilememektedir.
Sterilizasyonun imkansızlığını ve 1.5 kGy 19 kadar düşük dozların neden olduğu yıkımı tartışan birkaç makale olsa da, büyük çoğunluğu sunulan verilerle uyumludur 2,18,19. Bu şekilde, yazarlar kemiğin 10, 15, 20 ve 25 kGy dozlarında sterilize edilmesinin, hücre inkübasyon kapasitesinde bir azalma ve 15 kGy18'den daha yüksek dozlarda kollajen bozunma ürünlerinde bir artış karşılığında tam sterilizasyona ulaştığını gözlemlemektedir. 1.5 kGy'lik bir doz, desellülarize kalp kapakçıklarında sterilizasyon sağlamadı, ancak numunelerin hem in vivo hem de in vitro mekanik özelliklerine zarar verdi; Bu arada, 3 kGy'lik bir doz sterilizasyona ulaştı, ancak yıkıma ve fibrozise neden oldu19. Trakea ile ilgili olarak, Johnson ve ark. 25 kGy'lik ISO dozunda sterilizasyonun etkilerini 5 kGy'lik bir dozla karşılaştırdılar. Her iki doz da terminal sterilizasyon elde etti, 5 kGy'lik doz numunenin yapısını hafifçe değiştirdi ve 25 kGy'lik doz trakea2'yi tamamen tahrip etti.
Ek olarak, etkili sterilizasyon, 2 hafta sonra implantla ilgili bulaşıcı olayların olmaması sayesinde doğrulanır ve sterilizasyon organlar tarafından tamamen tolere edilir. Ayrıca, yapı nekroz veya organın denatürasyonu olmadan tamamen korunmuştur. Ayrıca, ek bir bulgu olarak, biyomekanik özelliklerdeki küçük değişikliğin - trakeanın birim uzunluk başına tolere edebileceği kuvvete - implantasyondan sadece 2 hafta sonra doğal trakea değerlerine geri döndüğü gözlenmiştir; Bu nedenle, bu etki, yapının nihai yönetimine göre göz ardı edilebilir.
Bu nedenle, bu makale önerilen 25 kGy dozundan çok daha düşük dozlarda tamamen steril organlar elde etme olasılığını sunmaktadır; Teklif, Yeni Zelanda tavşan trakealarının sterilizasyonunu 1 kGy'lik bir dozla giderir. Bu doz, bu organların histolojik, ultrayapısal ve biyomekanik özelliklerinin korunmasını sağlar ve implantasyona mükemmel tolerans gösterir. Çalışmanın bir sınırlaması, yalnızca daha küçük olması nedeniyle genellikle daha düşük bir dozaj gerektiren sterilize tavşan trakealarında gerçekleştirilmesidir; Bununla birlikte, inert implantlar için ISO standardında belirlenen aşırı yüksek rakamların, desellülarize trakeaların sterilizasyonu için gerekli olmadığı, dolayısıyla dokuya verilen zararın büyük ölçüde azalması nedeniyle büyük bir başarı olduğu sonucuna varılabilir. Ayrıca, gelecekteki çalışmalarda, hayvana ve dolayısıyla trakeasının büyüklüğüne bağlı olarak, bu dozlar, sonuç olarak organın yapısına ve işlevine daha saygılı olan çok daha düşük dozlara ayarlanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinde çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu makale, 2018 İspanyol Göğüs Cerrahisi Derneği Ulusal Çok Merkezli Çalışmaya Hibe [Sayı 180101 Néstor J.Martínez-Hernández'e verildi] ve PI16-01315 [Manuel Mata-Roig'e verildi] tarafından Instituto de Salud Carlos III tarafından desteklendi. CIBERER, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'nun yardımıyla VI Ulusal Ar-Ge ve I Planı 2018-2011, Iniciativa Ingenio 2010, Consolider Programı, CIBER Eylemleri ve Instituto de Salud Carlos III tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-0 nylon monofilament suture | Monosoft. Covidien; Mansfield, MA, USA | SN-5698G | |
| Amphotericin B 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15290018 | |
| Bioanalyzer | Agilent, Santa Clara, CA, USA | G2939BA | |
| Buprenorphine | Buprex. Reckitt Benckiser Healthcare; Hull, Reino Unido | N02AE01 | |
| Compression desktop UTM | Microtest, Madrid, Spain | EM1/10/FR | |
| Cryostate | Leyca CM3059, Leyca Biosystems, Wetzlar, Alemania | CM3059 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich; MO, USA | D2650 | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA | 11965084 | |
| DNA extraction kit | DNeasy extraction kit Quiagen, Hilden, Germany | 4368814 | |
| Enrofloxacin, 2.5% | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 0035-0002 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GE Healthcare Hyclone; Madrid, Spain | SH20898.03IR | |
| Fluorescence microscope | Leyca DM2500 (Leica, Wetzlar, Germany) | DM2500?? | |
| Freezing Container | Mr Frosty. Thermo Fisher; Madrid, Spain | 5100-0001 | |
| Isofluorane | Isoflo; Proyma Ganadera; Ciudad Real, Spain | 8.43603E+12 | |
| Ketamin | Imalgene. Merial; Toulouse, Francia | BOE127823 | |
| Linear accelerator | "True Beam". Varian, Palo Alto, California, USA | H191001 | |
| Magnetic stirrer | Orbital Shaker PSU-10i. Biosan; Riga, Letonia | BS-010144-AAN | |
| Meloxicam 5 mg/ml | Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein, Germany | 6283-MV | |
| Penicillin-streptomycin 5% | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA USA | 15140122 | |
| Pentobarbital sodium | Dolethal. Vetoquinol; Madrid, España | 3.60587E+12 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | P2272 | |
| Propofol | Propofol Lipuro. B. Braun Melsungen AG; Melsungen, Alemania | G 151030 | |
| Proteinase K | Gibco Thermo Fisher Scientific; Waltham, Massachussetts, USA | S3020 | |
| PVC hollow tubes | Cristallo Extra; FITT, Sandrigo, Italy | hhdddyyZ | |
| PVC stent | ArgyleTM Medtronic; Istanbul, Turkey | 019 5305 1 | |
| R software, Version 3.5.3 R Core | R Foundation for Statistical Computing | R 3.5.3 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich; MO, USA | 8,17,034 | |
| Spectrophotometer | Nanodrop, Life Technologies; Isogen Life Science. Utrech, Netherlands | ND-ONEC-W | |
| Spreadsheet | Microsoft Excel for Mac, Version 16.23, Redmond, WA, USA | 2864993241 | |
| Traction Universal Testing Machine | Testing Machines, Veenendaal, Netherlands | 84-01 | |
| UTM Software | TestWorks 4, MTS Systems Corporation, Eden Prairie, MN, USA | 100-093-627 F | |
| VECTASHIELD Mounting Medium | Vector Labs, Burlingame; CA; USA | H-1000-10 | |
| Xylacine | Xilagesic. Calier; Barcelona, España | 20102-003 |
References
- Ch'ng, S., et al. Reconstruction of the (Crico)trachea for malignancy in the virgin and irradiated neck. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (12), 1645-1653 (2012).
- Johnson, C. M., Guo, D. H., Ryals, S., Postma, G. N., Weinberger, P. M. The feasibility of gamma radiation sterilization for decellularized tracheal grafts. Laryngoscope. 127 (8), 258-264 (2017).
- de Donato, G., et al. Prosthesis infection: prevention and treatment. The Journal of Cardiovascular Surgery. 55 (6), 779-792 (2014).
- Vangsness, C. T., Dellamaggiora, R. D. Current safety sterilization and tissue banking issues for soft tissue allografts. Clinics in Sports Medicine. 28 (2), 183-189 (2009).
- Den Hondt, M., Vanaudenaerde, B. M., Delaere, P., Vranckx, J. J. Twenty years of experience with the rabbit model, a versatile model for tracheal transplantation research. Plastic and Aesthetic Research. 3 (7), 223-230 (2016).
- Hysi, I., et al. Successful orthotopic transplantation of short tracheal segments without immunosuppressive therapy. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 47 (2), 54-61 (2015).
- Wurtz, A., et al. Tracheal reconstruction with a composite graft: Fascial flap-wrapped allogenic aorta with external cartilage-ring support. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 16 (1), 37-43 (2013).
- White, A., Burns, D., Christensen, T. W. Effective terminal sterilization using supercritical carbon dioxide. Journal of Biotechnology. 123 (4), 504-515 (2006).
- Qiu, Q. Q., et al. Inactivation of bacterial spores and viruses in biological material using supercritical carbon dioxide with sterilant. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 91 (2), 572-578 (2009).
- Lange, P., et al. Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11 (3), 800-811 (2017).
- Wedum, A. G., Hanel, E., Phillips, G. B.
- Hennessy, R. S., et al. Supercritical carbon dioxide-based sterilization of decellularized heart valves. JACC. Basic to Translational Science. 2 (1), 71-84 (2017).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Balestrini, J. L., et al. Sterilization of lung matrices by supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (3), 260-269 (2016).
- AENOR. UNE-EN. ISO 11737-1:2006. Esterilización de productos sanitarios. Métodos biológicos. Parte 1: Determinación de la población de microorganismos en los productos. AENOR. UNE-EN. , Published online 2006 (2006).
- Uriarte, J. J., et al. Mechanical properties of acellular mouse lungs after sterilization by gamma irradiation. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 40, 168-177 (2014).
- Sun, W. Q., Leung, P. Calorimetric study of extracellular tissue matrix degradation and instability after gamma irradiation. Acta Biomaterialia. 4 (4), 817-826 (2008).
- Nguyen, H., et al. Reducing the radiation sterilization dose improves mechanical and biological quality while retaining sterility assurance levels of bone allografts. Bone. 57 (1), 194-200 (2013).
- Helder, M. R. K., et al. Low-dose gamma irradiation of decellularized heart valves results in tissue injury in vitro and in vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 101 (2), 667-674 (2016).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. Decellularized tracheal prelamination implant: A proposed bilateral double organ technique. Artificial Organs. 45 (12), 1491-1500 (2021).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- López Caballero, J., Peña, M., De Federico, M. Coloraciones para fibras colágenas y elásticas del tejido conjuntivo. Coloraciones para sustancia amiloidea. Laboratorio de Anatomía Patologica. , McGraw-Hill. 175-195 (1993).
- Martínez-Hernández, N. J., et al. A standardised approach to the biomechanical evaluation of tracheal grafts. Biomolecules. 11 (10), 1461 (2021).
- Kajbafzadeh, A. M., Javan-Farazmand, N., Monajemzadeh, M., Baghayee, A. Determining the optimal decellularization and sterilization protocol for preparing a tissue scaffold of a human-sized liver tissue. Tissue Engineering. Part C, Methods. 19 (8), 642-651 (2013).
- Wehmeyer, J. L., Natesan, S., Christy, R. J. Development of a sterile amniotic membrane tissue graft using supercritical carbon dioxide. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (7), 649-659 (2015).
- Ross, E. A., et al. Mouse stem cells seeded into decellularized rat kidney scaffolds endothelialize and remodel basement membranes. Organogenesis. 8 (2), 49-55 (2012).
