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Summary
ここでは、急性リンパ芽球性白血病患者由来の異種移植片モデルを、CD19標的キメラ抗原受容体T細胞関連毒性を評価および監視するための戦略として使用するプロトコルについて説明します。
Abstract
キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、複数のタイプのCD19+ 悪性腫瘍を治療するための強力なツールとして登場し、最近、いくつかのCD19標的CART(CART19)細胞療法のFDA承認につながっています。ただし、CART細胞療法は、独自の罹患率と死亡率を伴う独自の毒性のセットに関連しています。これには、サイトカイン放出症候群(CRS)および神経炎症(NI)が含まれます。前臨床マウスモデルの使用は、CARTの有効性とCART毒性の両方を評価するためのCART技術の研究開発において非常に重要です。この養子細胞免疫療法をテストするために利用可能な前臨床モデルには、同系、異種移植片、トランスジェニック、およびヒト化マウスモデルが含まれます。人間の免疫システムをシームレスに反映する単一のモデルはなく、各モデルには長所と短所があります。この論文は、CART19関連毒性、CRS、およびNIを評価するための戦略として、急性リンパ芽球性白血病患者からの白血病芽球を使用した患者由来の異種移植片モデルを説明することを目的としています。このモデルは、クリニックで見られるように、CART19関連の毒性と治療効果を再現することが示されています。
Introduction
キメラ抗原受容体T(CART)細胞療法は、がん免疫療法の分野に革命をもたらしました。再発/難治性の急性リンパ芽球性白血病(ALL)、大細胞型B細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、および多発性骨髄腫の治療に成功することが証明されており、最近のFDA承認につながっています。臨床試験での最初の成功にもかかわらず、CART細胞療法による治療は、しばしば重篤で時には致命的な毒性をもたらします。CART細胞療法後の最も一般的な毒性には、免疫エフェクター細胞関連神経毒性症候群(ICANS)とも呼ばれるCRSおよびNIの発症が含まれます8,9。CRSは、in vivoでのCART細胞の過剰活性化と大規模な増殖によって引き起こされ、その後、インターフェロンγ、腫瘍壊死因子-α、顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、およびインターロイキン-6(IL-6)を含む複数の炎症性サイトカインの分泌につながります。これは、低血圧、高熱、毛細血管漏出症候群、呼吸不全、多臓器不全、そして場合によっては死に至る10,11をもたらします。CRSは、CART19細胞療法後の症例の50〜100%で発症する11、12、13。ICANSは、CART細胞療法に関連する別のユニークな有害事象であり、全身性脳浮腫、混乱、鈍化、失語症、運動衰弱、そして時には発作を特徴としています9,14。ICANSのどのグレードも患者の最大70%で発生し、グレード3〜4は患者の20〜30%で報告されています5、10、15、16。全体として、CRSとICANSは一般的であり、致命的となる可能性があります。
CART細胞療法後のICANSの管理は困難です。ICANSのほとんどの患者はCRS17も経験し、IL-6受容体拮抗薬トシリズマブまたはステロイド18で治療できることがよくあります。以前の報告では、トシリズマブの早期介入は重症CRSの発生率を低下させたが、ICANS19の発生率または重症度には影響しなかったことが明らかになった。現在、ICANSに対する有効な治療法や予防薬は存在せず、予防戦略を検討することが重要です20。
骨髄系細胞および関連するサイトカイン/ケモカインは、CRSおよびICANS21の開発の主な推進力であると考えられています。CRSはサイトカインの極端な上昇とT細胞増殖に直接関係していますが、ICANSの病態生理はほとんど知られていません22,23。したがって、CART細胞療法後のこれらの毒性を再現するマウスモデルを確立し、メカニズムを研究し、予防戦略を開発することが不可欠です。
現在、CART細胞の有効性を研究、最適化、検証し、関連する毒性を監視するために使用されている複数の前臨床動物モデルがあります。これらには、霊長類モデルに加えて、同系、異種移植片、免疫適格トランスジェニック、ヒト化トランスジェニック、および患者由来の異種移植片マウスが含まれる。しかしながら、これらのモデルの各々は欠点を有し、そしていくつかはCART細胞の真の有効性または安全性の懸念を反映していない24、25。したがって、研究の意図された目的に最適なモデルを慎重に選択することが不可欠です。
この記事では、ALL患者由来の異種移植片(PDX)in vivoモデルを使用して、CART細胞関連毒性であるCRSおよびNIを評価するために使用される方法論について説明します(図1)。具体的には、ここに記載の方法では、著者らの研究室で作製したCART19細胞を、前述のプロトコールに従って使用する。簡単に説明すると、ヒトT細胞は、密度勾配法を介して健康なドナー末梢血単核細胞(PBMC)から単離され、0日目にCD3 / CD28ビーズで刺激され、1日目に4-1BBおよびCD3ζシグナル伝達ドメインに融合したCD19標的一本鎖可変断片で構成されるCARでレンチウイルス形質導入されます。次に、これらのCART細胞を増殖させ、6日目にビーズを除去し、8日目に凍結保存します26、27、28、29、30日目。先に概説したように、マウスはリンパ球枯渇治療を受け、続いて患者由来の白血病芽球(ALL)を投与される28。まず、腫瘍の生着が顎下採血によって検証されます。適切な腫瘍量の確立に続いて、CART19細胞をマウスに投与する。次に、マウスの体重を毎日測定して、健康状態を評価します。小動物磁気共鳴画像法(MRI)は、T細胞の増殖とサイトカイン/ケモカイン産生を評価するために尾部出血とともにNIを評価するために実行されます。以下に説明する手法は、PDXモデルでCART細胞関連毒性を研究するためのモデルとして使用することを強くお勧めします。
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Protocol
このプロトコルは、メイヨークリニックの治験審査委員会(IRB)、施設動物の管理および使用委員会(IACUC A00001767)、および施設バイオセーフティ委員会(IBC、Bios00000006.04)のガイドラインに従います。
注:マウスを扱うために使用されるすべての材料は無菌でなければなりません。
1. NSGマウスへのブスルファン注射
- 8〜12週齢の雄、免疫不全のNOD-SCID IL2rγnull(NSG)マウスを入手し、注射前に体重を測定します。
注:統計的有意性のために、グループごとに少なくとも5匹のマウスを使用し、メスマウスでこの実験を少なくとももう一度繰り返すことをお勧めします。 - 腹腔内(i.p.)注射用のブスルファンを準備します。1 mLのインスリンシリンジを使用して、シリンジに正確に30 mg / kgのブスルファンをゆっくりと注意深く満たし、続いてマウスにi.p注射し、ケージに戻します。
2.NSGマウスへのすべての患者由来芽球(CD19+)の注射
注:このプロトコルは、メイヨークリニックの施設バイオセーフティ委員会(IBC、Bios00000006.04)のガイドラインに従います。
- 再発および難治性のALL患者の末梢血から原発性白血病芽球を収集します。
- 静脈内(IV)注射用の標的細胞を準備します。
- 血球計算盤を使用してCD19+ 標的細胞をカウントし、細胞の最終体積と濃度を記録します。
注:細胞の生存率を判断するには、細胞のカウント中にトリパンブルーを使用することを強くお勧めします。 - 細胞を300 × g で4°Cで5分間遠心分離してペレット化します。
- 細胞ペレットをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に最終濃度50 × 106 細胞/mLまで1.5 mLマイクロ遠心チューブに再懸濁し、氷上に置きます。
- 細胞が完全に均質になるまで、標的細胞を含む1.5 mLマイクロ遠心チューブを指で渦流します。
- 1 mLのインスリンシリンジを使用して、調製した標的細胞を正確に100 μLずつゆっくりと慎重にシリンジに充填し、シリンジをフリックして気泡を除去します。
注:100 μLの容量は、各マウスに5×106 細胞を投与します。 - マウスを暖かい光の下に5〜10分間置きます。尾静脈が充血し、肉眼で見やすくなったら、マウスを適切な閉じ込め/拘束室に置きます。
- アルコール綿棒でマウスの尾を拭きます。標的細胞を尾静脈(i.v.)に直接注入し、マウスをケージに戻します。標的細胞の接種後、毎日、または地元の動物倫理委員会の推奨に従ってマウスを監視します。
- 血球計算盤を使用してCD19+ 標的細胞をカウントし、細胞の最終体積と濃度を記録します。
3. 腫瘍生着評価
- 標的細胞注入の6週間後から、フローサイトメトリーを使用して末梢血中のCD19+ 細胞の発現を測定することにより、腫瘍の生着を評価します。
- CD19+ 拡大を評価するための末梢血アッセイ
- CART19細胞注射の6〜8週間後にマウスから血液を採取する。
注:採血にはいくつかの方法を使用できます。このプロトコルでは、顎下採血が好ましい方法です。 - マウスを5%イソフルランを含む誘導チャンバー内でイソフルランで麻酔する。麻酔が達成されたら、鼻錐体を通して吸入されたイソフルランを1〜3%に維持する。
注:目の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布することを強くお勧めします。 - マウスをチャンバーから取り外し、首の上の緩んだ皮膚をつかんで、利き手でない手でマウスを持ちます。下顎骨の少し後ろのランセットで静脈を穿刺します。
注意: 静脈に入るには、針の先端(1〜2 mm)のみが必要です。 - 血液が滴り落ちるので、ヘパリンコートチューブに50μL以上集め、チューブを数回上下に反転させてよく混ぜます。30 μLの血液を5 mLの丸底ポリスチレンチューブに移します。
注:残りの血液については、チューブを17,000 × g で4°Cで10分間回転させます。 血清(上清層)を清潔で標識された1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、-80°Cで保存します(サイトカインアッセイで使用するため)。 - 血液を含む5 mLの丸底チューブに2 mLの溶解バッファー(ヌクレアーゼフリー水を使用して1倍に希釈した10x塩化アンモニウムベースの溶解バッファー)を追加します。チューブをボルテックスしてよく混ぜます。赤血球の適切な溶解を確実にするために、チューブを室温で20分間インキュベートします。
- 2 mLのフローバッファー(PBS、0.2 g/Lの塩化カリウム、0.2 g/Lのリン酸一カリウム、8 g/Lの塩化ナトリウム、および2%ウシ胎児血清と1%のアジ化ナトリウムを含む1.15 g/Lのリン酸二塩基性ナトリウム)を追加します。
- チューブを300 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清をデカントし、2mLのフローバッファーを加える。この洗浄手順を2回繰り返します。
- チューブの内容物を慎重にデカントします。チューブ内にペレットが残っている少量の液体を観察します。100 μLのフローバッファーを加え、よく再懸濁します。
- 5 mLフローチューブ内の残りの液体をすべて96ウェルプレートに移します。各サンプルが適切にラベル付けされていることを確認してください。対応するウェルに100 μLのフローバッファーを加え、96ウェルプレートを650 × g で4°Cで3分間遠心分離します。
- CART19細胞注射の6〜8週間後にマウスから血液を採取する。
- CD19+ 標的細胞の増殖をフローサイトメトリーで評価します(図2)。
- 0.3 μLの生/死染色剤、0.13 μg(2.5 μL)の抗ヒトCD19抗体、0.06 μg(2.5 μL)の抗ヒトCD45抗体、5 μg(2.5 μL)の抗マウスCD45、および42.2 μLのフローバッファーを含むマスターミックスを、サンプルあたり合計50 μLで調製します。暗所で室温で15分間インキュベートします。
- 150 μLのフローバッファーで洗浄した後、650 × g で4°Cで3分間遠心分離します。 上清をデカントし、ペレットを195μLのフローバッファーおよび5μLの計数ビーズに再懸濁する。
- フローサイトメーターで取得し、CD19+ 細胞発現のレベルを測定します。ゲーティングと解析の目的で、最初に前方散乱特性と側方散乱特性に基づいて対象集団(CD19+)をゲートし、次に単一のゲーティング集団をゲートし、次に生細胞をゲートします。生細胞がゲートされたら、ヒトCD45対マウスCD45集団を評価し、ヒト集団からCD19+ 標的集団をゲートします。
- 定量して70 μLに存在する量を決定し、式(1)を使用して細胞/μLで表します。
CD19+絶対細胞数=([CD19+細胞/カウントビーズ]×5 μL以内のカウントビーズ数)/70
注:末梢血アッセイを5日ごとに繰り返して、CD19 + 細胞の増殖を評価します。地域の動物倫理委員会のガイドラインに従って、2週間ごとに累積的に200μL以下の血液を収集します。マウスが≥10細胞/μLの疾患負荷に達したら、CART19細胞群または対照群に無作為化します(セクション4)。
4. CART19細胞の生体内投与
- CART19細胞の調製(~80日目):
注:CART19細胞の生成は、以前に公開されている27、30、31。この手順は、バイオセーフティキャビネットレベル2+内で、無菌技術と個人用保護具を使用して実行する必要があります。- CART19細胞を水浴容器(37°C)で解凍する。次いで、温T細胞培地(TCM)で細胞を洗浄し、ジメチルスルホキシドを除去した。
注:TCMは、10%ヒトAB血清(v / v)、1%ペニシリン-ストレプトマイシン-グルタミン(v / v)、および無血清造血細胞培地27,30でできています。 - CART19細胞を300 × g で4°Cで8分間遠心分離し、温かいTCMに最終濃度2 × 106 細胞/mLまで再懸濁します。CART細胞をインキュベーター(37°C、5%CO2)で一晩、ただし16時間以内で休ませます。
- CART19細胞を水浴容器(37°C)で解凍する。次いで、温T細胞培地(TCM)で細胞を洗浄し、ジメチルスルホキシドを除去した。
- IV注射 による CART19細胞の投与(~80日目)
- CART19細胞をカウントし、300 × g で4°Cで8分間スピンダウンします。
- CART19細胞を10 mLのPBSで再懸濁し、300 × g で4°Cで8分間スピンダウンします。
- CART19細胞をPBSで最終濃度40 × 106 細胞/mLに再懸濁し、細胞を滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、氷上に置きます。
- 100μLの再懸濁細胞i.v.を注入することにより、CART19細胞尾静脈注射(上記で詳述)を実行します。
注:100 μLの容量は、各マウスに4×106 細胞を投与します。陰性対照として未処置マウスの群を含む。
第5章 CART19細胞関連毒性の評価
- CART19細胞投与後、マウスを1日2回モニターして、運動衰弱、猫背、体重減少などの健康状態の変化を評価します。
注:これらの物理的変化はすべて、このモデル28のCRS症状と相関しています。 - マウスが運動衰弱と体重減少(ベースラインから10〜20%減少)を発症し始めたら、末梢血を収集して腫瘍量を分析し、セクション3(図3)で説明されている方法論に従ってサイトカインの血清分離を行います。
- 血清微小遠心チューブを-80°Cで保存し、血清を使用してマルチプレックスアッセイを使用してケモカインとサイトカインを分析します(図4)。
注:マウスが後肢麻痺の兆候を示し、瀕死または無気力に見え、体重減少が体重の20%>、食物および/または水に到達する能力を制限するまでである場合、安楽死の対象となります。
6. MRIイメージング
注:垂直ボア磁石を備えた前臨床(小動物用)MRIスキャナーを、in vivo磁気共鳴および画像取得に使用しました32,33。
- 120 μLのガドリニウム+ 880 μLの生理食塩水を混合し、1 mLのインスリンシリンジにロードします。各マウスに100 μLを注入します(i.p.)。
注:ガドリニウムは、実験開始の15〜20分前に注射する必要があります。 - 誘導チャンバー内でイソフルラン(2〜3%)を使用してマウスを10〜15分間麻酔します。
注:目の乾燥を防ぐために眼科用軟膏を塗布することを強くお勧めします。 - マウスの背骨をげっ歯類互換クレードルプローブに置きます。次に、マウスをバイトバーに歯を引っ掛けて配置します。
- マウスの頭部を25mmの体積コイルに引き込み、イソフルラン麻酔システムにつながれたノーズコーンを調整します。バイトバーのノブを締めて、スキャン中は位置を維持します。
注意: 造影MRIスキャンを実施する場合は、装置をボアマグネットに入れる少なくとも10分前に、ガドリニウム(この場合)または造影剤を注入してください。イメージングの時間を通して、マウスは鼻錐を介して空気中の2〜3%イソフルランを吸入することによって麻酔され、それらの呼吸数は同時に監視されます。 - 呼吸評価には、呼吸/呼吸モニタリングデバイスを使用します。
注:麻酔への長時間の曝露による低体温の可能性を防ぐために、体温も評価することが重要です。体温を制御するためにヒートパッドを使用することをお勧めします。- 呼吸モニタープローブを横隔膜の近くに取り付け、サージカルテープで固定します。マウスの状態が安定するように、呼吸数を毎分20〜60回の呼吸に保ちます。
注:このレートは、より安定したMRI画像を提供し、取得した画像のモーションアーチファクトを防ぎます。呼吸数が毎分20〜60回の呼吸範囲よりも高い場合は、イソフルランの濃度を上げます。呼吸数が毎分20呼吸未満の場合、麻酔は深すぎます。したがって、濃度を下げる必要があります。
- 呼吸モニタープローブを横隔膜の近くに取り付け、サージカルテープで固定します。マウスの状態が安定するように、呼吸数を毎分20〜60回の呼吸に保ちます。
- 動物用プローブを垂直口径小動物MRIシステム内の小口径に挿入します。コイルの中央で動物の頭を調整します。装置を直立できるようにロックで固定し、機器をコンピューターに接続します。
- ソフトウェア(Paravisionなど)を開いて使用し、スキャンの位置とスキャンの種類を設定します。すべての実験グループで一貫性を保ちながら、最適な軸方向と矢状位置を決定します。
注意: 実際の全長MRIスキャンの前に、トライアルスキャンの取得を参照として使用することをお勧めします。 - MRIデータ収集を続行します(前述の32、34、35、36を参照)。下記の推奨セットアップを使用して、T1強調MRI画像とT2強調MRI画像の両方を取得します。
- T1 強調 MRI 画像の場合は、繰り返し時間(TR)が 300 ミリ秒、エコー時間 (TE) が 9.5 ミリ秒、視野 (FOV) が 4 cm x 2 cm x 2 cm、マトリックスが 192 x 96 x 96 の T1 強調マルチスライス マルチエコー (MSME) シーケンスを使用します。
- T2強調MRI画像には、TRが300ミリ秒、TEが9.5ミリ秒、FOVが4 cm x 2 cm x 2 cm、マトリックスが192 x 96 x 96のマルチスライスマルチエコー(MSME)シーケンスを使用しました。
- スキャンが完了したら、プローブをボアから取り外します。バイトバーから歯を外して、マウスをそっと抽出します。動物が完全に意識を持ち、適切な運動機能を取り戻すまで、別のケージで動物を監視します。
- ソフトウェアからデータを抽出した後、解析ソフトウェアを使用して、超高強度領域の定量化と3Dボリュームレンダリング(図4)を行います。
注:可能であれば、データ分析のために2人の別々の盲検オブザーバーを用意することを強くお勧めします。
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Representative Results
このプロトコルの目的は、ALL患者の腫瘍細胞からのPDXマウスモデルを使用してCART細胞関連毒性を評価することです(図1)。まず、NSGマウスにブスルファン(30 mg/kg)のi.p.注射を行い、免疫抑制とCART細胞の生着促進を目的として投与しました28。翌日、彼らはすべての患者に由来する106 PBMC (i.v.)×~5を受け取りました。マウスは、尾出血アッセイ を介して ~13週間生着についてモニターされました。赤血球を回収し、溶解し、続いてフローサイトメトリー調製物を用いて、CD19+ 腫瘍細胞の発現を評価した(図2)。
マウスが≥10腫瘍細胞/μLに達したら、それらを無作為化し、4×106 CART19細胞(i.v.)を受け取るように準備した。CART19関連毒性を評価するために、マウスを1日1回体重を測定した(図3A)。体重減少は、CART細胞関連毒性に関連していることが以前に明らかにされているため、CRSの出現の症状として選択されました28,37。末梢血アッセイ(顎下採血による)を実施し、ヒトCD19+腫瘍細胞およびヒトCD3+ T細胞のフローサイトメトリー分析により、腫瘍量およびCART細胞増殖を評価した。さらに、血清を採取し、炎症性サイトカインの評価を行った。アッセイは、CART19細胞注入の1日前、およびCART19細胞注入後5日および10日に、これらの時点がCRSの発症および症状の発症に特に関連しているため、実施した。
ここでは、特に、CART19細胞投与の前後にマルチプレックスアッセイを実施し、最も代表的なサイトカインおよびケモカインはGM-CSF、IL-18、MIP-1α、およびIP-10でした(図3B)。しかしながら、血清中のこれらのタンパク質の濃度を評価するために他のアッセイを行うことができる。あるいは、マウスをMRIスキャンに供して、中枢神経系(CNS)における血管透過性を評価した。マウスに造影試薬ガドリニウム(i.p.)を注射して、脳の炎症および血液脳関門破壊を測定した38。次に、イソフルランで麻酔し、コントラスト増強T1強調画像とT2強調画像を撮影しました(図4)。T2画像(図4、左)では、明るい部分(白)は浮腫または体液の存在を示しており、これは主に脳腫瘍および炎症に見られます。T1画像(図4、中央)では、明るい部分は血液漏れまたは血液脳関門の破壊がある領域を示します。最後に、ソフトウェアの助けを借りて、脳内のガドリニウム漏出の体積をレンダリングする血管透過性に対応する超信号に基づくガドリニウム増強T1画像を使用して、3D再構成画像(図4、右)を組み立てました34。
図1:CART細胞関連毒性、サイトカイン放出症候群、および神経炎症を評価するために使用される患者由来の異種移植片モデルの実験スキーム。NSGマウスを30 mg/kgのブスルファン(i.p.)で馴化させ、ALL患者の末梢血に由来する3 × 10 6-5 ×10 6芽球(i.v.)を投与した。次に、マウスを顎下採血を介して腫瘍生着についてモニターし、続いてフローサイトメトリーを行ってCD19+芽球を評価した。末梢血CD19+細胞が≥10細胞/μLの場合、マウスは2×10 6-5 × 106 CART19細胞を受け取った。マウスは、彼らの幸福の尺度として毎日体重を量った。CART19細胞注入後10日目に、神経炎症を検出するためにマウス脳MRIを実施した。サイトカイン/ケモカイン産生およびT細胞増殖を評価するための尾部出血を、CART19細胞注射後毎週実施した。略語:CART=キメラ抗原受容体T細胞;CART19 = CD19 ターゲット カート。ALL =急性リンパ芽球性白血病;IV =静脈内;i.p. =腹腔内;PB =末梢血;NSG = NOD-SCID IL2rγnull.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:CART細胞関連毒性を評価するためのALL PDXモデルにおける腫瘍量の指標としてのCD19+ 腫瘍細胞の分析。 (A)患者由来のALL芽球を注射したマウスの末梢血サンプルから採取したCD19+ 細胞集団を分析するためのゲーティング戦略を示す代表的なフローサイトメトリー分析。(B)フローサイトメトリー分析から得られた生データに基づく、CART19で治療されたマウスと未治療のマウスとの間のCD19+ 細胞集団の定量および比較。(一元配置分散分析;n = 1群3匹のマウス;エラーバー、SEM)。略語: ns = 重要ではありません。ALL =急性リンパ芽球性白血病;PDX =患者由来の異種移植片。CART = キメラ抗原受容体T細胞;CART19 = CD19 ターゲット カート。SSC-H = 側方散乱ピーク高さ;FSC-H =前方散乱ピーク高さ。SSC-A = 側方散乱ピーク面積;FSC-A = 前方散乱ピーク面積。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ALL PDXモデルを用いたCART19関連毒性の評価。 (A)CART後最初の6日間のCART19細胞または対照形質導入T細胞で治療したマウスにおける体重減少率の代表的なグラフ(二元配置分散分析、****p < 0.001、****p < 0.00001;エラーバー、SEM)。(B)CART19細胞投与前後のNSGマウス血清におけるサイトカインおよびケモカインの発現。NSGマウスをCART19細胞投与の前後に顎下出血(i.v.)して血清を採取し、以下のサイトカインおよびケモカインの発現を評価した:GM-CSF、IL-18、MIP-1α、IP-10、IL-1βおよびIL-6(二元ANOVA、*p < 0.05、**p < 0.01、****p < 0.001、****p < 0.0001;n = 3マウス;9つのテクニカルレプリケート;エラーバー、 SEM)。略語: ns = 重要ではありません。ALL =急性リンパ芽球性白血病;PDX =患者由来の異種移植片。CART = キメラ抗原受容体T細胞;CART19 = CD19 ターゲット カート。NSG = NOD-SCID IL2rγnull;GM-CSF =顆粒球マクロファージコロニー刺激因子;IL-18 = インターロイキン-18;MIP-1α=マクロファージ炎症性タンパク質-1α;IP-10 = インターフェロンガンマ誘導タンパク質 10;IL-1β=インターロイキン-1β;IL-6 =インターロイキン-6。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PDXモデルにおけるCART19細胞治療中の神経炎症を評価するために使用される磁気共鳴画像法。 ALL患者由来の腫瘍細胞を生着させたNSGマウスにCART19細胞を注入し、CART注入後10日以内に神経症状を呈した後、ガドリニウム増強MRIで脳を画像化した。(写真左)CART19投与マウスにおけるNI中の浮腫および炎症性浸潤の可能性の証拠を明らかにするT2強調画像(赤い矢印)。(中)脳実質内の造影増強を示すT1強調MRIの代表的な軸切片は、CART19処置マウスにおける血管透過性の増加を示す(赤矢印)。(右)T1高信号領域(赤)を有するげっ歯類脳の3次元再構成は、Analyze 12.0ソフトウェアを使用して生成されました。略語:MRI =磁気共鳴画像法;ALL =急性リンパ芽球性白血病;PDX =患者由来の異種移植片。CART = キメラ抗原受容体T細胞;CART19 = CD19 ターゲット カート。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 人間 | 鼠 | |
| サイトカイン/ケモカイン | ヒトミエロイド系サイトカイン(IL-6、GM-CSF、IL-1、MCP-1) | ヒトミエロイド系サイトカイン(IL-6、GM-CSF、IL-1、MCP-1) |
| CRSまでの時間(日) | 2-5 | 4-6 |
| NIまでの時間(日) | 5-7 | 6-8 |
| BBB ステータス | BBBの混乱 | BBBの混乱 |
| 組織常在性マクロファージ | ミクログリア活性化 | ミクログリア活性化 |
| 中枢神経系のカート細胞 | 脳浸潤 | 脳浸潤 |
表1:ALL PDXモデルによる臨床的に観察されたCART細胞関連毒性の再現。 略語:GM-CSF =顆粒球 - マクロファージコロニー刺激因子;IL =インターロイキン;CRS = サイトカイン放出症候群;NI = 神経炎症;BBB = 血液脳関門;中枢神経系=中枢神経系;MCP-1 = 単球走化性タンパク質 1.
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Discussion
本報告では、ALL PDXモデルを用いてCART細胞関連毒性を評価する方法論について述べる。より具体的には、このモデルは、患者がCART細胞の注入後にしばしば経験する2つの生命を脅かす毒性、CRSおよびNIを模倣しようとしています。これは、クリニックで観察されたCART毒性の多くの特徴を要約します:体重減少、運動機能障害、神経炎症、炎症性サイトカインおよびケモカイン産生、および中枢神経系へのさまざまなエフェクター細胞の浸潤8,20,28。これまで、このPDXモデルは、CRSとNIの初期開発を模倣し(表1)、毒性の予防と治療のためのさまざまな戦略を評価するために使用されていました。このPDXモデルにおける1つの研究では、GM-CSFが枯渇したCART19細胞を利用した。より具体的には、これらの結果は、GM−CSF枯渇がCRS結合サイトカインおよびケモカインの分泌減少をもたらすことを実証し、これは、このALLPDXマウスモデルを用いて明確に実証された29。このPDXモデルは、イメージングプラットフォームとしてヨウ化ナトリウムシンポーター(NIS)を用いたCART19細胞注入後のCRS発生と相関するCART細胞のインビボ拡大を評価するためにも首尾よく使用されている26。したがって、この提案されたモデルは、CART細胞から生じる潜在的な毒性を評価するために使用できる有用なツールを表しています。
インビボでCART細胞を研究するために他の多くのモデルが使用されていることに言及することが重要です。これらには、異種モデルに加えて、同系、トランスジェニック、およびヒト化マウスモデルが含まれます24。免疫適格同種移植マウスモデルとも呼ばれる同系マウスモデルは、CART細胞、腫瘍、およびマウス由来の標的抗原を利用します。これは、完全に機能する免疫系におけるCART細胞の研究を可能にし、オンターゲット、オフ腫瘍の毒性を明らかにすることもできるため、有利です。このモデルの欠点は、マウスの生物学と免疫がヒトのものとは異なるため、臨床試験に進むことを目標とするトランスレーショナル研究に関連するモデルではないことです24,39。
免疫適格トランスジェニックマウスモデルは、ヒト組織に見られるパターンを模倣したパターンで、健康な組織と腫瘍の両方にヒト腫瘍関連抗原(TAA)導入遺伝子を発現します。これらのマウスは、オンターゲットのオフ腫瘍効果を明らかにすることにより、CART細胞の安全性をより適切に評価するために、CART研究でも使用されています40,41。CD34+ヒト造血幹細胞を移植したヒト化マウスは、再構成された免疫系がCART阻害を模倣し、臨床で見られるCRSを再現するサイトカインストームを誘発することができるため、ヒト造血系に対するCARTの有効性および毒性を研究するための有利なモデルとなり得る42,43,44.これらのモデルは、CARTの有効性に関連して特定の免疫細胞の研究を可能にしますが、ヒト化システムはまだ原始的であり、さらなる最適化が必要です。さらに、健康な組織上の宿主抗原のほとんどがマウス起源であるため、オフターゲット効果の研究におけるそれらの使用は制限されています。さらに、CD34+ヒト化マウスモデルは、45を開発することが技術的に困難である。しかし、免疫不全マウスのヒト異種移植片モデルは、臨床試験に変換する前にヒトCART細胞の有効性を評価するために一般的に使用されており、この論文で実証されているように、CART細胞活性に関連する毒性を評価するために使用できます。しかし、T細胞やNK細胞などの免疫系や免疫細胞が不足しているため、腫瘍外での標的毒性、CART細胞と自然免疫細胞との相互作用、および腫瘍微小環境によるCART細胞阻害を評価するためのアプリケーションが制限されています。
ここで説明するプロトコルの利点は、CART細胞関連毒性を観察および評価するためにNSGマウスを使用する簡単な手順を必要とすることです。まず、再現が容易であり、GM-CSF中和によってCART毒性を予防するための戦略を評価し、CRSの発症と相関してCART細胞増殖を視覚化するために最適化されています。この新しいPDXモデルを用いる際には、ALL芽球の適切な生着の確認やCART投与直後のCRS発症の早期モニタリングなど、重要なステップを正しく行うことが重要です。サイトカインの評価と体重モニタリングは、CART関連の毒性を決定するために重要であり、MRIはNIの発症を定義します。このモデルの欠点は次のとおりです:1)PDX ALL細胞は生着して高い腫瘍量に達するのに時間がかかるため、腫瘍細胞の接種からCART19細胞治療まで約2〜3か月かかります。2)主要なPDXモデルとして、生着までの時間およびCART細胞療法への応答に関して、患者間の有意な変動性がある。3)腫瘍量は生物発光イメージングでは評価できず、頻繁な末梢血評価が必要です。4)自然免疫細胞の欠如は、免疫細胞または腫瘍微小環境とのCART相互作用を研究するこのモデルの能力を制限します。
単純な免疫不全マウスモデルが理想的な前臨床モデルではないことが明らかになったため、より複雑なマウスモデル内で養子細胞をテストすることへの関心が過去10年間で高まっています。CART細胞関連毒性を評価するためにここで説明するPDXマウスモデルは、臨床で見られるようにCART細胞注入後のCRSおよびNIのタイムライン、症状、およびマーカーを模倣しているため、CART細胞療法の分野における有望な前臨床モデルを表しています。全体として、ここで説明する方法論は、CART19細胞関連毒性および有効性を評価するための堅牢なプラットフォームを提供します。
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Disclosures
S.S.K.は、CAR免疫療法の分野における特許の発明者であり、ノバルティス(メイヨークリニック、ペンシルベニア大学、ノバルティスの間の契約を通じて)およびメッタフォージ(メイヨークリニックを通じて)にライセンス供与されています。R.L.S.とS.S.K.は、ヒューマニジェンにライセンス供与されているCAR免疫療法の分野における特許の発明者です。S.S.K.は、Kite、Gilead、Juno、Celgene、Novartis、Humanigen、MorphoSys、Tolero、Sunesis、Leahlabs、Lentigenから研究資金を受けています。
Acknowledgments
この作業の一部は、国立衛生研究所(R37CA266344、1K99CA273304)、国防総省(CA201127)、メイヨークリニックK2Rパイプライン(S.S.K.)、メイヨークリニック個別化医療センター(S.S.K.)、およびプレドリン財団(R.L.S.)を通じて支援されました。また、メイヨークリニックNMRコア施設のスタッフにも感謝申し上げます。 図 1 は BioRender.com で作成されたものです
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Anti-Human CD19 | Biolegend | 302211 | |
| Alcohol Prep Pad | Wecol | 6818 | |
| Analyze 14.0 software | AnalyzeDirect Inc. | N/A | https://analyzedirect.com/analyze14/ |
| Artificial tears (Mineral oil and petrolatum) | Akorn | 17478-062-35 | Topical ophtalmic gel to prevent eye dryness |
| BD FACS Lysing Solution | BD | 349202 | Red blood cells lysing buffer |
| BD Micro-Fin IV insulin syringes | BD | 329461 | |
| Brillian Violet 421 Anti-Human CD45 | Biolegend | 304032 | |
| Bruker Avance II 7 Tesla | Bruker Biospin | N/A | MRI machine |
| Busulfan (NSC-750) | Selleckchem | S1692 | |
| CountBright absolute counting beads | Invitrogen | C36950 | |
| CytoFLEX System B4-R2-V2 | Beckman Coulter | C10343 | flow cytometer |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | |
| ERT Control/Gating Module | SA Instruments | Model 1030 | Small Animal Monitoring Respiratory and Gating System |
| Fetal bovine serum | Millipore Sigma | F8067 | |
| Hemocytometer | Bright-Line | Z359629-1EA | |
| Human AB Serum; Male Donors; type AB; US | Corning | 35-060-CI | |
| Isoflurane (Liquid) | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation | Invitrogen | L34966 | |
| Microvette 500 Lithium heparin | Sarstedt | 20.1345.100 | Blood collection tube |
| MILLIPLEX Huma/Cytokine/Chemokine Magnetic Beads Panel | Millipore Sigma | HCYTMAG-60K-PX38 | Immunology Multiplex Assay to identify cytokines and chemokines |
| Omniscan | Ge Healthcare Inc. | 0407-0690-10 | Gadolinium-based constrast agent |
| Pd Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103106 | |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid | Gibco | 10378-016 | |
| Round Bottom Polysterene Test tube | Corning | 352008 | |
| Sodium Azide, 5% (w/v) | Ricca Chemical | 7144.8-16 | |
| Stainless Steel Surgical Blade | Bard-Parker | 371215 | |
| X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium | Lonza | 04-418Q |
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Tags
がん研究、第192号、CART細胞、CART細胞関連毒性、患者由来異種移植片(PDX)モデル、がん治療、 in vivo 前臨床モデルErratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model
Posted by JoVE Editors on 03/14/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5
R. Leo Sakemura1,2
Brooke L. Kimball1,2
Fang Jin6
Roman H. Khadka6
Mohamad M. Adada1,2
Elizabeth L. Siegler1,2
Aaron J. Johnson6
Saad S. Kenderian1,2,6
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester,
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester,
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester,
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester,
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester,
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
