Summary
这份手稿提出了一个详细的协议，用于对活苔藓组织的3-D细胞壁动力学进行成像，允许可视化 ggb 突变体中细胞壁的分离和野生型在长期发育过程中增厚的细胞壁模式。
Abstract
使用荧光显微镜的延时成像可以观察细胞和亚细胞水平的生长和发育的动态变化。通常，对于长时间的观察，该技术需要荧光蛋白的转化;然而，对于大多数系统来说，遗传转化要么耗时，要么在技术上不可用。本手稿介绍了一种在 3 天内使用钙荧光染料（在植物细胞壁中染色纤维素）对细胞壁动力学进行 3-D 延时成像的方案，该染料在苔藓 Physcomitrium patens 中开发。来自细胞壁的钙荧光染料信号稳定，可持续1周无明显衰减。使用这种方法，已经表明 ggb 突变体（其中蛋白质香叶基香叶基转移酶-I β亚基被敲除）中的细胞分离是由不受调节的细胞扩增和细胞壁完整性缺陷引起的。此外，钙荧光染色的模式随时间而变化;染色强度较低的区域与野生类型中未来的细胞扩增/分支位点相关。该方法可应用于许多其他包含细胞壁且可由钙氟染色的系统。
Introduction
植物细胞壁在细胞扩增和发育过程中发生动态变化1，2，3。保持细胞壁的完整性对于植物细胞在生长和发育过程中的粘附以及对环境信号的响应至关重要。尽管长时间可视化活细胞的细胞壁动力学对于了解细胞在发育和适应环境变化过程中如何保持粘附至关重要，但目前直接观察细胞壁动力学的方法仍然具有挑战性。
细胞变化的延时成像可以使用高分辨率荧光显微镜4，5，6，7提供生物体的信息发育动态。虽然延时3D成像在研究生长和发育过程中细胞形状的动态变化方面具有很大的潜力，但该技术通常需要荧光蛋白4，5，6，7的转化。然而，对于大多数系统来说，遗传转化要么耗时，要么在技术上具有挑战性。作为替代方案，附着在细胞成分上的荧光染料早已可用。荧光染料在用一定波长的光照射后可以发出荧光。常见的例子是Edu，DAPI，PI，FM4-64和Calcofluor白色8，9，10。然而，一个主要缺点是这些染料通常只能用于固定组织或短期实验，部分原因是它们对细胞8，9，10造成的伤害。
使用此处介绍的方案，在苔藓P. patens的延时实验期间，当钙荧光白在培养基中混合时，钙氟信号是稳定的。使用这种方法，使用3-D延时成像在3天内观察到ggb突变体中细胞的分离3（图1）。该方法可应用于许多其他包含细胞壁且可由钙氟染色的系统。
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Protocol
注意：有关材料和设备的列表，请参阅 材料 表，有关本协议中使用的解决方案列表，请参阅 表1 。
1. 玻璃底培养皿的植物制备
- 在生长室中的恒定白光（~50μmolm -2 s-1）下在13cm培养皿中的BCDAT琼脂培养基中生长苔藓质子组织7天。
- 过滤灭菌钙荧光白色并储存在4°C直至使用。试剂可稳定数月。
- 将 7 天大的苔藓组织分散到含有 20 μL 灭菌水的 1.5 mL 微管中。确保苔藓质子组织充分分散为水中的小块。对于野生型（WT），使用镊子分离质子;对于 GGB 突变体，请使用 P-1000 移液器。
- 将 10 μL 灭菌的钙氟白加入 1.5 mL 微管中，并将微管直立在罩中放置 2 分钟以进行染色。
- 染色后立即将植物与 200 μL 冷却的 BCDATG 混合，其中含有补充有 0.5% （w/v） 葡萄糖和 0.4% （w/v） 结冷胶的 BCDAT 培养基，用 P-1000 移液器移液 5 次。
注意：确保BCDATG介质足够冷却（就在介质凝固之前），以避免对植物造成压力。 - 将含有植物和BCDATG培养基的混合物转移到直径为27毫米的玻璃基皿中。确保用于混合细胞的BCDATG体积不超过200μL，并且200μL的BCDATG与样品均匀分布在7mm玻璃底培养皿的表面上以产生一层薄膜，使样品在成像过程中处于物镜工作距离内。
- 在室温下凝固2分钟后，用3mL冷却的BCDATG覆盖薄层，静置10分钟以再次凝固。
注意：确保步骤1.2-1.5在无菌罩中进行，以避免污染。 - 在培养皿的底部，在平行和垂直方向上分别绘制九条线（图2）。用 a 到 h 之间的字符标记行，用 1 到 8 之间的数字标记列。使用上、下、右、中和左标记每个方块内的位置。例如，如果植物位于第二行和第六列的正方形中，并且位于正方形的左上角，则该植物的名称为“b6_upper_left”。
- 在生长室中将含有植物的玻璃底培养皿在红光下预培养5天，然后在白光下预培养1-2天，然后每天进行延时成像长达3天。对于WT，将植物在上述弱红光（0.5μmolm-2 s-1）中预培养5天，以诱导质子的光向性响应，使植物可以附着在培养皿的底部11。
注意：弱红光是通过将白光通过 3 毫米厚的红色丙烯酸塑料滤光片进入防光盒来提供的。对于ggb突变体，在红光下预培养是可选的，因为ggb突变体没有光向反应3。
2. 成像和三维重建
- 将装有植物的玻璃底培养皿放在倒置共聚焦显微镜的载物台上，玻璃底朝向物镜。使用共聚焦显微镜通过20倍物镜可视化钙荧光。使用 405 nm 激光拍摄图像，针孔为 1.0，高压增益为 100，偏移背景调整为 0，激光功率为 5%-7%，扫描尺寸为 1，024 x 1，024，扫描速度为 1/2 帧/秒。收集 17-30 个步长为 1.0 μm 的 z 系列光学切片。使用步骤 1.6 中的代码（例如“b6_upper_left-day0”）命名图像并保存。
- 在采集中选择 DAPI 通道，然后选中 ND 采集中的 Z 框。要设置 Z 堆栈的下限和上限，请单击顶部和底部按钮。
- 要重建3D图像，请打开.nd2文件（图3A;见材料表）并单击体积（图3B）。
3. 在不同时间点对同一植物进行成像
- 每次成像后，将玻璃基皿放回生长室。
- 从步骤2.1重复成像和3-D重建。
注意：要查找相同的植物，请使用步骤1.6中提到的代码，并根据植物的年龄命名为“b6_upper_left-day1”或“b6_upper_left-day2”。
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Representative Results
该方法允许观察野生型和ggb突变体发育过程中的细胞壁动力学（图1）。结果表明，细胞壁增厚较少的区域与细胞扩增/分支位点相关，从而可以预测野生型的扩增/分支位点（图1A）。由于不受控制的细胞扩增3，ggb突变体的细胞壁表面在发育过程中被撕裂（图1B）。而且，ggb突变体（较老纤维素）破碎表面的染色信号强于破碎细胞壁表面下的细胞表面（较年轻的纤维素）。
图 1：苔藓发育的 3-D 时间序列。 （A，B）在WT（A）和ggb突变体（B）中通过钙荧光白色染色（染色纤维素）显示了横壁的动态变化。对于ggb突变体（B），每个图像下方的白色虚线表示扩增细胞上的破碎表面细胞壁，橙色线表示ggb中细胞壁表面下方的细胞。B小组经3许可转载。请注意，可以在细胞的表面位置检测到钙荧光白信号的差异，并且密度较低的染色区域（箭头）与细胞扩增/分支位点相关。比例尺 = 20 μm。缩写：d = 天;WT = 野生型;ggb = 香叶基香叶基转移酶-I β。请点击此处查看此图的大图。
图2：标记植物的位置。 在盘子的底部，每条线分别以平行和垂直的方向绘制，以标记正方形的位置。字符 a 到 h 用于标记行，数字 1 到 8 用于标记列。上、下、右、中和左用于标记每个方块内的位置。例如，如果植物（用绿点表示）位于第二行和第六列的正方形中，并位于左上角，则该植物被命名为b6_upper_left。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：使用 nd2 z 堆栈文件重建 3D 图像 。 （A） 在 NIS 元素查看器中打开 nd2 文件。单击 LUT （圆圈）以调整图像的对比度和亮度，然后单击 体积 （正方形）以重建3D图像。（B） 从 A重建的3D图像。 请点击此处查看此图的大图。
表 1：此协议中使用的解决方案列表。请按此下载此表格。
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Discussion
延时3-D重建或4-D成像是观察发育过程中细胞形态动态的有力工具。在该协议中，通过在培养基中混合钙荧光白色，可以在苔藓 P. patens中观察到3-D细胞形态的动力学。使用这种方法，我们观察到 ggb 突变体的细胞壁表面在发育过程中被撕裂3。此外，细胞壁增厚的减少与野生型细胞扩增/分支位点相关，可以预测扩增/分化位点。此外，由于钙荧光白可以与其他染料（例如微球）一起使用，因此可以观察到有关细胞扩增的附加信息3。
有两个原因可以解释钙荧光染料如何在不影响/破坏分子靶标的情况下与植物结合数天。首先，低工作浓度（200 μL BCDATG 培养基中的 10 μL 或 5%）可能足够低，以使苔藓质子不受影响。其次，钙荧光可能会对纤维素的成熟阶段进行染色，因为野生型基部（较老的组织）的染色信号比顶端细胞（较年轻的组织）的顶端区域强得多，并且 ggb 突变体（较老的纤维素）的破碎细胞壁表面比破碎细胞壁表面下的细胞（较年轻的纤维素）强。
该协议已用于结构简单的苔藓组织。目前的协议也可以应用于具有简单结构的其他系统，例如开花植物中的根毛和毛状体。然而，钙荧光白色染色是否适用于具有更多细胞层的其他系统（例如茎）还有待观察。此外，由于钙荧光白与培养基混合，因此必须将要染色的组织浸入培养基中。因此，可能需要优化才能将此协议应用于其他系统。
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Disclosures
作者声明没有竞争或经济利益。
Acknowledgments
作者感谢路易斯维尔大学的Soucy Patricia博士和Betty Nunn博士在共聚焦显微镜方面的帮助。这项工作由美国国家科学基金会（1456884至MPR）和国家科学基金会合作协议（1849213至MPR）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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