Summary
यह पांडुलिपि जीवित काई ऊतक की 3-डी सेल दीवार गतिशीलता को चित्रित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है, जिससे जीजीबी उत्परिवर्ती में सेल की दीवारों की टुकड़ी के दृश्य और लंबे समय तक विकास के दौरान जंगली प्रकार में सेल की दीवार पैटर्न को मोटा करने की अनुमति मिलती है।
Abstract
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के साथ टाइम-लैप्स इमेजिंग सेलुलर और उपकोशिकीय स्तरों पर विकास और विकास के गतिशील परिवर्तनों के अवलोकन की अनुमति देता है। सामान्य तौर पर, लंबी अवधि में टिप्पणियों के लिए, तकनीक को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के परिवर्तन की आवश्यकता होती है; हालांकि, अधिकांश प्रणालियों के लिए, आनुवंशिक परिवर्तन या तो समय लेने वाला या तकनीकी रूप से अनुपलब्ध है। यह पांडुलिपि कैल्कोफ्लोर डाई (जो प्लांट सेल की दीवार में सेल्यूलोज को दाग देती है) का उपयोग करके 3 दिन की अवधि में सेल दीवार गतिशीलता की 3-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करती है, जिसे मॉस फिकोमिट्रियम पेटेंस में विकसित किया गया है। सेल की दीवार से कैल्कोफ्लोर डाई सिग्नल स्थिर है और स्पष्ट क्षय के बिना 1 सप्ताह तक रह सकता है। इस विधि का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि जीजीबी उत्परिवर्ती में कोशिकाओं की टुकड़ी (जिसमें प्रोटीन गेरानिलजेरनिलट्रांसफेरेज़-आई बीटा सबयूनिट को बाहर कर दिया जाता है) अनियमित सेल विस्तार और सेल दीवार अखंडता दोषों के कारण होता है। इसके अलावा, समय के साथ कैल्कोफ्लोर धुंधला होने के पैटर्न बदलते हैं; कम तीव्रता से दाग वाले क्षेत्र जंगली प्रकार में भविष्य के सेल विस्तार / शाखाओं के स्थलों के साथ सहसंबंधित हैं। इस विधि को कई अन्य प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है जिनमें सेल की दीवारें होती हैं और जिन्हें कैल्कोफ्लोर द्वारा दाग दिया जा सकता है।
Introduction
प्लांट सेल की दीवारें सेल विस्तार और विकास 1,2,3 के दौरान गतिशील परिवर्तनों से गुजरती हैं। सेल दीवार अखंडता को बनाए रखना विकास और विकास के दौरान पौधे सेल आसंजन के साथ-साथ पर्यावरणीय संकेतों की प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। यद्यपि लंबे समय तक जीवित कोशिकाओं की सेल दीवार गतिशीलता की कल्पना करना यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्यावरणीय परिवर्तनों के विकास और अनुकूलन के दौरान सेल आसंजन कैसे बनाए रखा जाता है, सेल दीवार गतिशीलता को सीधे देखने के लिए वर्तमान तरीके अभी भी चुनौतीपूर्ण हैं।
सेलुलर परिवर्तनों की टाइम-लैप्स इमेजिंग एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप 4,5,6,7 का उपयोग करके एक जीव की सूचनात्मक विकास गतिशीलता प्रदान कर सकती है। जबकि टाइम-लैप्स 3-डी इमेजिंग में विकास और विकास के दौरान सेल आकार के गतिशील परिवर्तनों का अध्ययन करने की बहुत क्षमता है, तकनीक को आमतौर पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन 4,5,6,7 के परिवर्तन की आवश्यकता होती है। हालांकि, अधिकांश प्रणालियों के लिए, आनुवंशिक परिवर्तन या तो समय लेने वाले या तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण होते हैं। एक विकल्प के रूप में, फ्लोरोसेंट रंजक जो सेलुलर घटकों से जुड़ते हैं, लंबे समय से उपलब्ध हैं। फ्लोरोसेंट रंजक एक निश्चित तरंग दैर्ध्य के प्रकाश के साथ विकिरण के बाद फ्लोरोसेंट प्रकाश का उत्सर्जन कर सकते हैं। सामान्य उदाहरण एडु, डीएपीआई, पीआई, एफएम 4-64 और कैल्कोफ्लोर व्हाइट 8,9,10 हैं। हालांकि, एक बड़ी खामी यह है कि इन रंगों का उपयोग आमतौर पर केवल निश्चित ऊतक में या छोटे प्रयोगों के लिए किया जा सकता है, आंशिक रूप से सेल 8,9,10 को होने वाले नुकसान के कारण।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल के साथ, कैल्कोफ्लोर सिग्नल स्थिर होते हैं जब काई पी पेटेंस में टाइम-लैप्स प्रयोगों के दौरान माध्यम के भीतर कैल्कोफ्लोर सफेद मिलाया जाता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, 3-डी टाइम-लैप्स इमेजिंग का उपयोग करके जीजीबी उत्परिवर्ती में कोशिकाओं की टुकड़ी 3 दिन की अवधि3 (चित्रा 1) में देखी गई थी। इस विधि को कई अन्य प्रणालियों पर लागू किया जा सकता है जिनमें सेल की दीवारें होती हैं और जिन्हें कैल्कोफ्लोर द्वारा दाग दिया जा सकता है।
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Protocol
नोट: सामग्री और उपकरणों की सूची के लिए सामग्री की तालिका और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की सूची के लिए तालिका 1 देखें।
1. कांच के निचले व्यंजनों के लिए पौधों की तैयारी
- विकास कक्ष में 25 डिग्री सेल्सियस पर 7 दिनों के लिए निरंतर सफेद प्रकाश (~ 50 μmol m-2 s-1) के तहत 13 सेमी पेट्री डिश में BCDAT एगर माध्यम में काई प्रोटोनेमल ऊतक उगाएं।
- कैल्कोफ्लोर सफेद को फ़िल्टर-स्टरलाइज़ करें और उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। अभिकर्मक कई महीनों के लिए स्थिर है।
- 7 दिन पुराने काई ऊतक को 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में फैलाएं जिसमें 20 μL निष्फल पानी हो। सुनिश्चित करें कि काई प्रोटोनेमल ऊतक पानी में छोटे टुकड़ों के रूप में पर्याप्त रूप से फैला हुआ है। जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) के लिए, प्रोटोनेमाटा को अलग करने के लिए फोर्स का उपयोग करें; जीजीबी उत्परिवर्ती के लिए, पी -1000 पिपेट का उपयोग करें।
- 1.5 एमएल माइक्रोट्यूब में 10 μL स्टरलाइज़्ड कैल्कोफ्लोर व्हाइट जोड़ें और माइक्रोट्यूब को धुंधला होने के लिए 2 मिनट के लिए हुड में सीधा छोड़ दें।
- धुंधला होने के तुरंत बाद, पौधों को 200 μL ठंडा BCDATG के साथ मिलाएं, जिसमें BCDAT माध्यम होता है, जिसमें 0.5% (w /v) ग्लूकोज और 0.4% (w / v) गेलन गम होता है, जिसे P-1000 पिपेट के साथ पांच बार पाइप करके।
नोट: सुनिश्चित करें कि बीसीडीएटीजी माध्यम को पौधों पर जोर देने से बचने के लिए पर्याप्त ठंडा किया जाता है (माध्यम के जमने से ठीक पहले)। - पौधों और बीसीडीएटीजी माध्यम वाले मिश्रण को 27 मिमी व्यास ग्लास बेस डिश में स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को मिलाने के लिए BCDATG की मात्रा 200 μL से अधिक नहीं है और नमूनों के साथ BCDATG के 200 μL को फिल्म की एक पतली परत का उत्पादन करने के लिए 7 मिमी ग्लास बॉटम डिश की सतह पर समान रूप से वितरित किया जाता है, ताकि नमूने इमेजिंग के दौरान उद्देश्य कार्य दूरी के भीतर हों।
- कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए जमने के बाद, पतली परत को 3 एमएल ठंडा बीसीडीएटीजी के साथ कवर करें और इसे फिर से जमने के लिए 10 मिनट के लिए सेट होने दें।
नोट: सुनिश्चित करें कि संदूषण से बचने के लिए चरण 1.2-1.5 बाँझ हुड में आयोजित किए जाते हैं। - पकवान के निचले भाग पर, समानांतर और लंबवत दिशाओं में नौ रेखाएं खींचें (चित्र 2)। पंक्तियों को a से h तक के वर्णों के साथ चिह्नित करें, और स्तंभों को 1 से 8 तक की संख्याओं के साथ चिह्नित करें। प्रत्येक वर्ग के भीतर स्थितियों को चिह्नित करने के लिए ऊपरी, निचले, दाएं, मध्य और बाएं का उपयोग करें। उदाहरण के लिए, यदि कोई पौधा दूसरी पंक्ति और छठे स्तंभ में एक वर्ग में है और वर्ग के ऊपरी बाएं भाग में स्थित है, तो इस पौधे को "b6_upper_left" का नाम दिया जाता है।
- प्रीकल्चर ग्लास बॉटम डिश जिसमें पौधों को विकास कक्ष में 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 दिनों के लिए लाल बत्ती के तहत रखा जाता है, और फिर 1-2 दिनों के लिए सफेद रोशनी के तहत 3 दिनों तक हर दिन टाइम-लैप्स इमेजिंग के अधीन किया जाता है। डब्ल्यूटी के लिए, प्रोटॉनमाटा की फोटोट्रोपिक प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए 5 दिनों के लिए उपरोक्त से कमजोर लाल प्रकाश (0.5 μmol m-2 s-1) में पौधों को प्रीकल्चर करें, ताकि पौधे व्यंजन11 के तल से जुड़ सकें।
नोट: कमजोर लाल प्रकाश प्रकाश 3 मिमी मोटी लाल ऐक्रेलिक प्लास्टिक फिल्टर के माध्यम से प्रकाश-प्रूफ बक्से में पारित करके प्रदान किया जाता है। जीजीबी म्यूटेंट के लिए, लाल रोशनी में प्रीकल्चरिंग वैकल्पिक है, क्योंकि जीजीबी म्यूटेंट में फोटोट्रोपिक प्रतिक्रिया3 नहीं होती है।
2. इमेजिंग और 3-डी पुनर्निर्माण
- ग्लास बॉटम डिश जिसमें पौधे होते हैं, को उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें, जिसमें ग्लास बॉटम उद्देश्य के सामने हो। 20x उद्देश्य लेंस के साथ कैल्कोफ्लोर के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। 405 एनएम लेजर, 1.0 पर पिनहोल, 100 पर एचवी-गेन, 0 पर ऑफसेट-पृष्ठभूमि समायोजन, 5% -7% पर लेजर पावर, 1,024 x 1,024 का स्कैन आकार और 1/2 फ्रेम / सेकंड की स्कैन गति के साथ छवियां लें। 1.0 μm के चरण आकार के साथ 17-30 z-श्रृंखला ऑप्टिकल अनुभाग एकत्र करें। चरण 1.6 में कोड का उपयोग करके छवियों को नाम दें, जैसे कि "b6_upper_left-दिन 0", और सहेजें।
- अधिग्रहण में DAPI चैनल का चयन करें और ND अधिग्रहण में Z बॉक्स चेक करें। Z-स्टैक के लिए निचली और ऊपरी सीमाएँ सेट करने के लिए, शीर्ष और नीचे बटन क्लिक करें.
- 3-D छवियों का पुनर्निर्माण करने के लिए, .nd2 फ़ाइल खोलें (चित्रा 3A; सामग्री तालिका देखें) और वॉल्यूम (चित्रा 3B) क्लिक करें।
3. अलग-अलग समय बिंदुओं पर एक ही पौधे की इमेजिंग
- प्रत्येक इमेजिंग के बाद, ग्लास बेस डिश को विकास कक्ष में वापस रखें।
- इमेजिंग और 3-डी पुनर्निर्माण के लिए चरण 2.1 से दोहराएं।
नोट: एक ही पौधे को खोजने के लिए, चरण 1.6 में उल्लिखित कोड का उपयोग करें और पौधों की उम्र के अनुसार "b6_upper_left-डे 1", या "b6_upper_left-डे 2" नाम दें।
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Representative Results
यह विधि जंगली प्रकार और जीजीबी उत्परिवर्ती (चित्रा 1) में विकास के दौरान सेल की दीवार की गतिशीलता के अवलोकन की अनुमति देती है। परिणामों से पता चला है कि सेल की दीवार के कम मोटे होने वाले क्षेत्र सेल विस्तार / ब्रांचिंग साइटों के साथ सहसंबंधित हैं, जिससे जंगली प्रकार में विस्तार / शाखाओं की साइटों की भविष्यवाणी की अनुमति मिलती है (चित्रा 1 ए)। अनियंत्रित सेल विस्तार3 (चित्रा 1 बी) के कारण विकास के दौरान जीजीबी उत्परिवर्ती में कोशिका की दीवारों की सतह अलग हो गई थी। इसके अलावा, जीजीबी उत्परिवर्ती (जो पुराना सेल्यूलोज है) की टूटी हुई सतह का धुंधला संकेत टूटी हुई कोशिका भित्ति की सतह के नीचे कोशिका की सतह (जो छोटा सेल्यूलोज है) की तुलना में अधिक मजबूत है।
चित्र 1: काई विकास की 3-डी समय श्रृंखला। (A, B) क्रॉस-दीवारों में गतिशील परिवर्तन WT (A) और GGB उत्परिवर्ती (B) में कैल्कोफ्लोर सफेद धुंधलापन (जो सेल्यूलोज को दाग देता है) द्वारा दिखाया गया था। जीजीबी उत्परिवर्ती (बी) के लिए, प्रत्येक छवि के नीचे सफेद डैश लाइनें विस्तारित कोशिकाओं पर टूटी हुई सतह सेल की दीवारों को इंगित करती हैं, और नारंगी रेखाएं जीजीबी में सेल की दीवार की सतह के नीचे कोशिकाओं को इंगित करती हैं। पैनल बी को 3 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया है। ध्यान दें कि कोशिकाओं की सतह की स्थिति पर कैल्कोफ्लोर सफेद संकेत में अंतर का पता लगाया जा सकता है, और कम घने धुंधला क्षेत्र (तीर) सेल विस्तार / शाखाओं साइटों से संबंधित हैं। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: डी = दिन; डब्ल्यूटी = जंगली प्रकार; जीजीबी = जेरानिलजेरनिलट्रांसफेरेज़-आई बीटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 2: पौधों के स्थान को चिह्नित करना। पकवान के निचले भाग पर, वर्गों के स्थान को चिह्नित करने के लिए समानांतर और लंबवत दिशाओं में नौ रेखाएं खींची गईं। पंक्तियों को चिह्नित करने के लिए वर्ण ए से एच का उपयोग किया गया था, और कॉलम को चिह्नित करने के लिए संख्या 1 से 8 का उपयोग किया गया था। प्रत्येक वर्ग के भीतर पदों को चिह्नित करने के लिए ऊपरी, निचले, दाएं, मध्य और बाएं का उपयोग किया गया था। उदाहरण के लिए, यदि एक पौधा (हरे बिंदु द्वारा निरूपित) दूसरी पंक्ति और छठे स्तंभ पर एक वर्ग में स्थित था, और ऊपरी बाएं हिस्से में स्थित था, तो पौधे को b6_upper_left नाम दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: nd2 z-स्टैक फ़ाइल का उपयोग करके 3-D छवियों का पुनर्निर्माण. (A) NIS-तत्व व्यूअर में एक ND2 फ़ाइल खोलें. छवियों के कंट्रास्ट और चमक को समायोजित करने के लिए एलयूटी (सर्कल) पर क्लिक करें और 3-डी छवि के पुनर्निर्माण के लिए वॉल्यूम (वर्ग) पर क्लिक करें। (बी) ए से पुनर्निर्मित 3-डी छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समाधानों की सूची। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
टाइम-लैप्स 3-डी पुनर्निर्माण, या 4-डी इमेजिंग, विकास प्रक्रियाओं के दौरान सेलुलर आकृति विज्ञान की गतिशीलता को देखने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इस प्रोटोकॉल में, माध्यम में कैल्कोफ्लोर सफेद को मिलाकर, 3-डी सेलुलर आकृति विज्ञान की गतिशीलता को काई पी पैटेंस में देखा जा सकता है। इस विधि का उपयोग करते हुए, हमने देखा कि जीजीबी उत्परिवर्ती में कोशिका भित्ति की सतह विकास के दौरान अलग हो जातीहै। इसके अलावा, सेल की दीवारों की कम मोटाई जंगली प्रकार में सेल विस्तार / ब्रांचिंग साइटों के साथ सहसंबद्ध है, जिससे विस्तार / शाखाओं के स्थलों की भविष्यवाणी की जा सकती है। इसके अलावा, क्योंकि कैल्कोफ्लोर सफेद का उपयोग अन्य रंगों, जैसे माइक्रोसेफर्स के साथ किया जा सकता है, सेल विस्तार के बारे में अतिरिक्त जानकारी देखी जा सकतीहै।
दो कारण हैं जो समझा सकते हैं कि कैल्कोफ्लोर डाई आणविक लक्ष्य को प्रभावित / नुकसान पहुंचाए बिना पौधों को कई दिनों तक कैसे बांध सकती है। सबसे पहले, कम कार्यशील एकाग्रता (बीसीडीएटीजी माध्यम के 200 μL में 10 μL, या 5%) काई प्रोटोनेमाटा को प्रभावित नहीं करने के लिए पर्याप्त रूप से कम हो सकती है। दूसरा, कैल्कोफ्लोर सेल्यूलोज के परिपक्व चरण को दाग सकता है, क्योंकि एपिकल सेल (जो छोटा ऊतक है) के एपिकल क्षेत्र की तुलना में जंगली प्रकार (जो पुराना ऊतक है) के बेसल भाग में धुंधला संकेत बहुत मजबूत होता है, और जीजीबी उत्परिवर्ती (जो पुराना सेल्यूलोज है) की टूटी हुई कोशिका भित्ति सतह टूटी हुई कोशिका भित्ति सतह के नीचे कोशिकाओं (जो छोटी सेल्यूलोज है) की तुलना में अधिक मजबूत होती है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग काई ऊतक के लिए किया गया है, जो संरचना में सरल है। वर्तमान प्रोटोकॉल को सरल संरचनाओं के साथ अन्य प्रणालियों पर भी लागू किया जा सकता है, जैसे कि फूलों के पौधों में जड़ के बाल और ट्राइकोम। हालांकि, यह देखा जाना बाकी है कि क्या कैल्कोफ्लोर सफेद धुंधला पन अधिक सेल परतों के साथ अन्य प्रणालियों के लिए काम करता है, जैसे कि तने। इसके अलावा, क्योंकि कैल्कोफ्लोर सफेद माध्यम के साथ मिलाया जाता है, दाग वाले ऊतक को माध्यम के भीतर डुबोया जाना चाहिए। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को अन्य प्रणालियों पर लागू करने के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी या वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
लेखकों ने कंफोकल माइक्रोस्कोप के साथ सहायता के लिए लुइसविले विश्वविद्यालय में डॉ सूसी पेट्रीसिया और बेट्टी नन को धन्यवाद दिया। इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (1456884 से एमपीआर) और एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन सहकारी समझौते (1849213 से एमपीआर) द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
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