Summary
맥락막 신경총(CP)은 신경과학에서 충분히 연구되지 않은 조직으로 중추신경계의 건강과 질병에 중요한 역할을 합니다. 이 프로토콜은 CP를 분리하기 위한 미세 해부 기술과 세포 구조의 전체 보기를 얻기 위한 주사 전자 현미경의 사용을 설명합니다.
Abstract
맥락막 신경총(CP)은 뇌의 심실로 돌출된 고도로 혈관화된 구조로 신경과학에서 가장 잘 연구되지 않은 조직 중 하나입니다. 이 작은 구조가 중추신경계(CNS)의 건강과 질병에 중요한 역할을 한다는 것이 점점 더 분명해짐에 따라 기능적 분석에서 구조적 분석에 이르기까지 다운스트림 처리가 가능한 방식으로 뇌실에서 CP를 적절하게 해부하는 것이 가장 중요합니다. 여기서, 특수 도구 또는 장비를 필요로 하지 않는 외측 및 제4 뇌실 마우스 CP의 분리가 설명된다. 이 분리 기술은 CP 내에서 세포의 생존력, 기능 및 구조를 보존합니다. 높은 혈관 형성으로 인해 CP는 쌍안경 현미경을 사용하여 뇌의 심실 구멍 내부에 떠 있는 것을 시각화할 수 있습니다. 그러나, 다운스트림 분석에 필요한 경심 관류는 CP 조직의 식별을 복잡하게 할 수 있다. 추가 처리 단계(예: RNA 및 단백질 분석)에 따라 브로모페놀 블루를 사용한 경심 관류를 통해 CP를 시각화하여 해결할 수 있습니다. 분리 후 RNA, 단백질 또는 단일 세포 분석을 포함한 여러 기술을 사용하여 CP를 처리하여 이 특별한 뇌 구조의 기능에 대한 추가 이해를 얻을 수 있습니다. 여기서, 전체 마운트 CP의 주사 전자 현미경 (SEM)은 구조의 전체보기를 얻는 데 사용됩니다.
Introduction
단단한 장벽은 혈액-뇌 장벽(BBB)과 혈액-뇌척수액(CSF) 장벽을 포함하여 중추신경계(CNS)를 말초와 분리합니다. 이러한 장벽은 CNS를 외부 손상으로부터 보호하고 균형 잡히고 통제 된 미세 환경 1,2,3을 보장합니다. BBB는 시간이 지남에 따라 광범위하게 연구되었지만 맥락막 신경총(CP)에 위치한 혈액-CSF 장벽은 지난 10년 동안 연구 관심이 증가했습니다. 이 후자의 장벽은 뇌의 4 심실에서 발견 될 수 있으며 (그림 1A, B) 중심 간질, 새는 모세 혈관, 섬유 아세포, 림프 및 골수 세포 집단 (그림 1C)을 둘러싼 맥락막 신경총 상피 (CPE) 세포의 단일 층을 특징으로합니다 (그림 1C) 4,5,6. CPE 세포는 긴밀한 접합부로 단단히 연결되어 있어 밑에 있는 천공 혈액 모세혈관에서 뇌척수액과 뇌로 누출되는 것을 방지합니다. 또한, CPE 세포를 통한 수송은 혈액에서 CSF로의 유익한 화합물 (예 : 영양소 및 호르몬)의 유입과 다른 방향으로의 유해 분자 (예 : 대사 폐기물, 과도한 신경 전달 물질)의 유출을 관리하는 여러 내부 및 외부 수송 시스템에 의해 조절됩니다 1,6. 능동적 수송 기능을 발휘하기 위해 CPE 세포는 세포질에 수많은 미토콘드리아를 함유하고 있다7. 또한, CP는 뇌척수액의 주요 공급원이며 상주하는 염증 세포의 존재에 의해 뇌의 문지기 역할을 한다1. 혈액과 뇌 사이의 독특한 위치 때문에 CP는 면역 감시를 수행하기에 완벽한 위치에 있습니다8.
그림 1: 맥락막 신경총(CP)의 위치와 구성에 대한 개략도. (A,B) CP 조직은 (A) 인간 및 (B) 마우스 뇌의 두 측면, 제3 및 제4 뇌실 내에서 발견됩니다. (C) CP 조직은 천공된 모세혈관, 느슨한 결합 조직, 림프 및 골수 세포를 둘러싸고 있는 밀접하게 연결된 입방체 CP 상피(CPE) 세포의 단일 층으로 구성되며 혈액-뇌척수액 장벽을 형성합니다(참고문헌 23에서 적응 및 변형됨). Biorender.com 로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지난 10 년 동안 우리 연구 그룹의 여러 보고서를 포함하여 CP가 건강과 질병 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18에서 중심적인 역할을한다는 증거가 증가하고 있습니다. 예를 들어, 노화된 혈액-CSF 장벽은 다른 것들 중에서도 핵, 미세융모 및 기저막에서 형태학적 변화를 나타내는 것으로 알려져 있다 1,19. 또한, 알츠하이머 병의 맥락에서, 전반적인 장벽 무결성이 손상되고 이러한 모든 연령 관련 변화는 훨씬 더 두드러지는 것으로 보인다 1,8,20. 형태학적 변화 이외에도, CP의 전사체, 프로테옴 및 세크레톰은 질병 12,21,22,23 동안 변경된다. 따라서 CP에 대한 고급 지식은 신경계 질환에서의 역할을 더 잘 이해하고 잠재적으로 새로운 치료 전략을 개발하는 데 필수적입니다.
뇌실에서 CP를 정확하게 미세 해부하는 효율적인 방법은 이 작은 뇌 구조를 적절하게 조사할 수 있는 첫 번째 귀중한 단계입니다. 혈관이 많이 발달된 특성(그림 2B)으로 인해 뇌의 심실 구멍 내부에 떠 있는 CP는 양안 현미경을 사용하여 식별할 수 있습니다. 그러나 다운스트림 분석에는 종종 경심 관류가 필요하므로 CP 조직의 적절한 식별 및 분리가 복잡해집니다(그림 2C). 추가 처리 단계가 허용하는 경우(예: RNA 및 단백질 분석의 경우) 브로모페놀 블루를 사용한 경심 관류를 통해 CP를 시각화할 수 있습니다(그림 2A). 몇몇 출판물은 이미 쥐24 와 쥐 강아지 뇌25에서 CP의 분리를 설명합니다. 여기서, 성체 마우스로부터 CP를 단리하기 위한 미세해부 분리 기술이 기재되어 있다. 중요하게도, 이 분리 기술은 CP 내에서 세포의 생존력, 기능 및 구조를 보존합니다. 제 4 심실과 외측 심실에 떠있는 CP의 격리가 여기에 설명되어 있습니다. 요컨대, 마우스는 말기 마취되고, 필요하다면 경심으로 관류된다. 그러나, 관류는 CP 내의 세포의 구조를 손상시킬 수 있다는 것에 유의해야 한다. 따라서 투과 전자 현미경(TEM), 직렬 블록 면 주사 전자 현미경(SBF-SEM) 또는 집속 이온 빔 SEM(FIB-SEM)을 사용하여 샘플을 분석해야 하는 경우 관류를 수행해서는 안 됩니다. 다음으로, 전체 뇌가 분리되고, 겸자는 뇌를 시상으로 반분해하는 데 사용됩니다. 여기에서 측심실에 떠 있는 CP를 식별하고 해부할 수 있으며, 제4뇌실의 CP는 뇌의 소뇌 쪽에서 분리할 수 있습니다.
그림 2: (A,D) 브로모페놀 블루 관류, (B,E) 무관류 및 (C,F) PBS/헤파린 관류 후 (A-C) 네 번째 및 (D-F) 외측 심실 맥락막 신경총(CP)의 시각화. 이미지는 실체 현미경(8x-32x 배율)으로 촬영됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CP가 뇌실에서 적절하게 해부되면 이 구조의 기능에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 전체 기술 레퍼토리를 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 유세포 분석 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱은 특정 질병 조건 하에서 침윤성 염증 세포를 정량화하고 표현형적으로 분석하기 위해 수행될 수 있다26,27. 세포 조성 이외에도, CP의 분자 조성은 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 면역블롯을 통해 사이토카인 및 케모카인의 존재를 평가하거나, 사이토카인 비드 어레이(28)를 이용한 다중 사이토카인의 동시 분석을 통해 분석될 수 있다. 또한, 전사체, 혈관, 면역 세포 조직학 및 세크레톰 분석은 미세해부된 CP 외식편29에 대해 수행될 수 있다. 여기서, CP 구조의 전체적인 모습을 얻기 위해 전체 마운트 CP에 대한 주사전자현미경(SEM)을 사용한다. SEM은 집중된 전자 빔을 사용하여 표면을 스캔하고 표면의 지형과 구성에 대한 이미지를 만듭니다. 전자의 파장이 빛의 파장보다 훨씬 작기 때문에 SEM의 해상도는 나노미터 범위이며 광학 현미경의 해상도보다 우수합니다. 결과적으로, 세포 내 수준에 대한 형태학적 연구는 SEM을 통해 수행될 수 있습니다. 간단히 말해서, 해부된 CP는 하룻밤 고정을 위해 글루타르알데히드 함유 고정액으로 즉시 옮겨진 다음, 삼투화 및 우라닐 아세테이트 염색이 뒤따릅니다. 그런 다음 샘플을 납 아스파르테이트 염색으로 처리하고 탈수한 다음 궁극적으로 이미징을 위해 매립합니다.
따라서 이 프로토콜은 마우스 뇌실에서 CP의 효율적인 분리를 용이하게 하며, 이는 다양한 다운스트림 기술을 사용하여 추가로 분석하여 구조와 기능을 조사할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
본 연구에 기재된 모든 동물 실험은 국내법(벨기에 법률 1986년 8월 14일 및 2003년 12월 22일, 벨기에 왕실 칙령 06/04/2010) 및 유럽 법률(EU 지침 2010/63/EU, 86/609/EEC)에 따라 수행되었다. 생쥐 및 동물 프로토콜에 대한 모든 실험은 겐트 대학교 윤리위원회의 승인을 받았습니다(허가 번호 LA1400091 및 EC 2017-026).
1. 준비
- 마취제: 말기 마취제를 준비합니다. 예를 들어, 인산염 완충 식염수(PBS)에 펜토바르비탈나트륨(≥100mg/kg) 용액을 제조할 수 있습니다.
- 경심 관류 용액: 0.5% 브로모페놀 블루가 보충된 PBS/헤파린(0.2% 헤파린 함유) 용액 10mL(마우스당)를 준비합니다.
참고: 다운스트림 처리 단계(예: RNA 및 단백질 분석의 경우)가 허용하는 경우 브로모페놀 블루를 사용한 경심 관류를 통해 맥락막 신경총(CP)을 시각화할 수 있습니다. 브로모페놀 블루가 추가 처리 단계(예: 이미징용)와 호환되지 않는 경우 PBS/헤파린을 사용하여 관류합니다. - SEM 분석에 필요한 용액을 준비합니다.
- 0.1 M Na-cacodylate 완충액(pH 7.4)을 준비합니다. 0.1M Na-카코딜레이트 완충액에 2% 파라포름알데히드와 2.5% 글루타르알데히드 용액을 준비합니다. 샘플 당 20mL의이 용액을 만드십시오.
- 0.1M Na-cacodylate 완충액(샘플당 5mL)에 2% 사산화오스뮴을 준비합니다.
- 50%, 70%, 85% 및 100% EtOH 용액을 준비합니다. 시료당 각 EtOH 용액 5mL를 준비합니다.
2. 외측 및 제 4 뇌실에서 맥락막 신경총의 미세 해부
참고: 암컷, 9주령 C57BL/6 마우스가 이 연구에 사용되었습니다. 그러나, 기술된 격리 기술은 성인 마우스의 균주, 성별 및 연령과 무관하다.
- 쥐의 뇌를 분리하십시오.
- 마우스를 말기 마취하기 위해 26G 바늘을 사용하여 속효성 바르비투르산염(>100mg/kg, 1.1단계에서 준비)의 치사량을 복강 주사합니다. 집게로 뒷발을 꼬집어 마우스의 발 반사를 확인하십시오.
- 발 반사가 없을 때, 말기 마취 된 동물을 등쪽 욕창 위치에 놓고 팔다리를 판에 고정시켜 마우스를 고정시킵니다.
참고: 마우스의 경심 관류가 필요하지 않은 경우 다운스트림 분석 방법(예: SEM 이미징)에 따라 2.1.7단계로 진행합니다. 그러나 혈액 내 혈구 또는 기타 구성 요소를 제거하기 위해 관류가 필요한 경우 CP는 브로모페놀 블루 로 관류 하여 뇌실에 떠 있는 파란색 구조로 시각화할 수 있습니다. - 70 % 에탄올을 뿌려 가슴을 소독하십시오. 수술 부위 주위에 멸균 드레이프를 놓습니다. 탄소강 수술용 칼날을 사용하여 횡격막 바로 아래 ~4cm를 절개합니다( 재료 표 참조).
- 피부를 열고 수술 용 가위로 가슴을 노출시킵니다. 다이어프램을 완전히 자릅니다.
- 흉부를 분리하여 폐와 박동하는 심장을 노출시킵니다.
- 관류 펌프를 사용하여 4.5mL/min의 속도로 10mL의 관류 용액으로 마우스를 심장으로 관류합니다( 재료 표 참조). 관류는 ~2분이 소요됩니다. 좌심실에 26G 바늘을 삽입하여 용액을 전신 회로로 펌핑합니다. 또한 혈액이 순환에서 빠져 나갈 수 있도록 우심방에서 수술 용 가위로 자릅니다.
알림: 관류 펌프는 정밀하게 프로그래밍된 속도로 유체를 전달하고 관류로 인한 전단력이 너무 강하지 않도록 하기 때문에 유체의 수동 관리보다 선호됩니다. 과도한 전단력은 CP 내에서 세포의 생존력과 구조를 손상시킵니다. 또한 여기에서 권장되는 관류 유속은 7주 이후 성인 마우스를 관류하는 데 최적입니다. 어린 마우스를 사용하는 경우 더 낮은 유속을 사용해야 합니다. 깨끗한 수술 부위를 보존하기 위해 우심방에서 나오는 혈액을 두드리는 것도 중요합니다. - 마우스의 목을 베십시오.
알림: 뇌 구조를 보존하기 위해 머리를 어깨까지 최대한 낮게 자르도록 주의하십시오. 절단이 너무 높으면 소뇌가 손상 될 수 있습니다. - 참수 후 귀 사이를 눈보다 위쪽으로 절개하여 두피를 잘라냅니다. 피부를 옆으로 당겨 두개골을 노출시킵니다. 그런 다음 편평 봉합사를 따라 코 부분을 향해 두개골을 자릅니다.
알림: 뇌의 무결성을 유지하려면 두개골을 부드럽게 제거하는 것이 중요합니다. - 얼음처럼 차가운 페트리 접시에 뇌를 넣고 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL를 뇌 조직에 추가합니다.
알림: 접시 코팅이 필요하지 않습니다.
- 제 4 심실에 떠있는 CP를 분리하십시오.
- 메스로 대뇌에서 소뇌를 부드럽게 잘라냅니다. 대뇌는 뇌의 가장 큰 부분이고 소뇌는 뇌 뒤쪽의 훨씬 작은 부분입니다. 필요한 경우 소뇌에서 남아있는 뇌간 조직 부분을 제거하십시오.
- 절단선이 위쪽을 향하도록 뇌를 회전시킵니다. 이제 네 번째 심실 공동이 섹션 중앙에 보이고 CP가 등쪽 부위에 떠 있는지 확인합니다. 필요한 경우 날카로운 집게로 결합 조직을 당겨 심실을 약간 엽니 다. 이러한 방식으로 CP가 더 잘 보이고 쉽게 도달할 수 있습니다.
- 작고 날카로운 집게를 사용하여 CP를 심실 벽에서 부드럽게 떼어냅니다.
알림: s를 오염시키지 않기 위해 이 단계에서 CP만 만지고 꺼내는 것이 중요합니다.amp주변 조직으로. 2.2.2 단계에서 설명한대로 심실을 열면 2.2.3 단계가 용이 해집니다.
- 외심실에서 튀어 나온 CP를 분리하십시오.
- 작고 날카로운 집게를 사용하여 뇌를 두 개의 반구로 시상적으로 자릅니다.
- 절단선이 위쪽을 향하도록 뇌를 회전시킵니다. 측면 심실을 드러내려면 시상에서 피질을 부드럽게 잡아 당깁니다.
- 해마를 중간 시상 절단선으로 후퇴시킵니다. 이제 CP가 심실 바닥에 있는 상태에서 측면 심실을 볼 수 있습니다. 필요한 경우 날카로운 집게로 결합 조직을 당겨 심실을 약간 엽니 다. 이러한 방식으로 CP가 더 잘 보이고 쉽게 도달할 수 있습니다.
- 작고 날카로운 집게를 사용하여 CP를 심실 벽에서 부드럽게 떼어냅니다.
알림: s를 오염시키지 않기 위해 이 단계에서 CP만 만지고 꺼내는 것이 중요합니다.amp주변 조직으로. 2.3.4 단계에서 설명한대로 심실을 열면 2.3.5 단계가 용이 해집니다. 이 단계에서 CP의 구조를 최대한 보존하기 위해 필요한 주의를 기울이십시오. 주둥이에서 꼬리 방향으로 CP를 당기는 것이 가장 쉽습니다.
3. 주사전자현미경(SEM)을 이용한 CP 조직의 형태학적 분석
주의 : 독성 용액은 다음 처리 단계에서 사용됩니다. 흄 후드에서 샘플 준비를 수행하는 것이 좋습니다.
- 수행 amp아래에 설명된 대로 SEM을 위한 준비.
- 새로 분리된 CP를 0.1M Na-카코디레이트 완충액(pH 7.4)에 2% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드를 함유하는 새로 만든 고정 용액으로 옮깁니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
참고: CP 조직은 매우 연약하고 얇기 때문에 조직을 작은 표본 바구니( 재료 표 참조)에 넣어 완충액 간에 옮겨야 합니다. 이런 식으로 조직의 구조가 더 잘 보존됩니다. 강력한 카코딜레이트 완충액이 EM 고정제에서 글루타르알데히드의 낮은 pH에 대응할 수 있기 때문에 카코딜레이트 기반 고정액이 PBS 기반 고정제보다 사용됩니다. - 3-5mL의 0.1M Na-카코딜레이트 완충액(pH 7.4)으로 각각 5분 동안 샘플을 3회 세척합니다.
- 샘플을 0.1M Na-cacodylate 완충액의 2% 사산화오스뮴 3-5mL에 30분 동안 후고정합니다. 샘플을 3-5mL의 초순수로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.
- EtOH 농도가 증가하는 일련의 얼음처럼 차가운 용액(50%, 70%, 85%, 100%)에서 EtOH 용액당 15분 동안 샘플을 탈수합니다. 임계점 건조기를 사용하여 샘플을 적절하게 포인트 건조하십시오.
주의사항 액체상에서 기체 상으로의 변화는 표면 장력에 영향을 주어 표면 구조에 손상을 줍니다. 임계점 건조 단계는 표면 구조의 보존을 가능하게 한다. - 샘플을 카본 스티커가 부착된 시편 마운트에 조심스럽게 놓습니다( 재료 표 참조).
- 백금의 얇은 층 (2-5 nm)으로 샘플을 코팅하십시오. 이렇게 하려면 두 개의 고전류 전기 단자 사이의 진공 시스템에 백금 소스를 장착하고 백금을 증발 온도로 가열합니다. 미세한 백금 흐름이 샘플에 증착됩니다.
참고: 이 단계에 대한 보다 상세한 프로토콜은 참조30에 제공된다. 백금 외에도 금 또는 금/팔라듐도 사용할 수 있습니다.
- 새로 분리된 CP를 0.1M Na-카코디레이트 완충액(pH 7.4)에 2% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드를 함유하는 새로 만든 고정 용액으로 옮깁니다. 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- SEM으로 CP 샘플을 시각화합니다( 재료 표 참조). SEM을 통한 CP 조직의 시각화 절차는 다른 유형의 조직과 유사하며 사용된 소프트웨어 및 기기에 따라 다릅니다. 단계별 SEM 프로토콜과 함께 수반되는 비디오는 참고 문헌31 또는 참고 문헌30에서 사용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
설명된 프로토콜은 마우스 뇌 측면(그림 2A-C) 및 제4(그림 2D-F) 심실에서 CP의 효율적인 분리를 용이하게 합니다. 전체 뇌를 분리한 후 겸자를 사용하여 뇌를 시상적으로 반절개하고 외심실에 떠 있는 CP를 식별합니다. 제 4 뇌실의 CP는 뇌의 소뇌 쪽에서 분리 될 수 있습니다. 브로 모 페놀 블루를 사용한 관류는 CP를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 2A, D). 그러나 추가 처리 단계에서 브로모페놀 블루가 허용되지 않는 경우 PBS/헤파린으로 관류하거나(그림 2C, F) 관류하지 않거나(그림 2B, E) 수행할 수 있습니다. 뇌실에서 CP를 분리한 후 조직에 대한 전체 분석 레퍼토리를 수행할 수 있습니다. 여기에는 유전자 발현 프로파일링(RT-qPCR)28, 세포 유형 프로파일링(유세포 분석32, 단일 세포 RNA 시퀀싱 26,27), 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 면역블롯 또는 멀티플렉스 면역분석법을 통한 사이토카인 및 케모카인 28의 검출이 포함됩니다. 또한, 미세해부된 CP를 배양물에 배치하여 CP 외식편을 만들어 기능을 추가로 설명하고, 예를 들어 특정 자극에 대한 반응으로 그의 세크레톰을 연구할 수 있습니다23,28,29. 이 원고에서는 맥락막 신경총 상피(CPE) 세포의 표면을 형태학적으로 분석하기 위해 주사전자현미경(SEM)을 수행하는 방법을 설명합니다. 그림 3은 SEM을 통해 얻은 제4뇌실에서 분리된 CP(그림 3A)와 측심실에서 분리된 CP(그림 3B)의 개요 이미지를 보여줍니다. 이 이미지는 측면 CP의 전형적인 C 자형 형태와 4 심실 CP의 2 팔 구조를 명확하게 보여줍니다.
그림 3: 해부된 맥락막 신경총(CP) 조직의 주사 전자 현미경 (SEM) 이미지 개요. (A,B) 마우스 뇌의 (A) 제4 및 (B) 외측 심실에서 분리된 CP의 대표적인 SEM 이미지. 스케일 바 = 100 μm. 설정: 전자 고압(EHT) = 5.00kV; 작동 거리(WD) = 4.8mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CPE 셀을 확대하면 CPE 셀의 정점 쪽에 있는 다른 셀을 감지할 수 있습니다(그림 4A). 이미지에 포착된 세포는 CP의 정점 표면에 존재하는 대식세포와 유사한 세포인 에피플렉스 세포일 수 있습니다. 그러나 SEM을 통해 이 세포의 특정 특성을 식별하는 것은 불가능합니다. SEM 이미징 외에도 Shipley et al.29에 의해 표시된 바와 같이 살아있는 외식편에서 맥락막 신경총 상피의 이광자 이미징을 수행할 수 있습니다. SEM은 CP의 표면 구조의 시각화를 용이하게 하는 반면, 이광자 이미징은 형광으로 모니터링할 수 있는 한 광범위한 세포 및 세포 과정을 시각화할 수 있습니다. 여기에는 혈관 및 면역 세포의 시각화뿐만 아니라 CP 외식편29의 분비 사건이 포함됩니다.
더 높은 SEM 배율은 CPE 세포의 정점 측면(그림 4B)과 미세 융모(그림 4C)에서 소포와 유사한 구조를 나타냈습니다. 이 미세 융모는 뇌척수액(CSF)으로 돌출되어 세포와 CSF 사이의 CPE 세포 표면적을 증가시킵니다. 이러한 결과는 질병 조건에서 CPE 세포의 형태학적 변화가 SEM을 사용하여 조사될 수 있음을 보여줍니다.
그림 4: 맥락막 신경총(CP) 조직의 상세한 주사 전자 현미경(SEM) 이미지. (A) 맥락막 신경총 상피(CPE) 세포의 정점 쪽에 있는 세포. 스케일 바 = 2 μm. (B) CPE 세포의 정점 쪽에 있는 베시클 유사 구조. 스케일 바 = 10 μm. (C) 미세 융모가 있는 CPE 세포 표면의 시각화. 스케일 바 = 1 μm. 설정: 전자 고압(EHT) = 5.00kV; 작동 거리 (WD) = 4.9 mm; 3,000x 배율. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서는 마우스 뇌의 외측 뇌실과 제4뇌실에서 맥락막 신경총(CP)을 분리하는 방법을 설명합니다. CP의 이러한 전체 장착 방법은 CP 형태, 세포 구성, 전사체, 프로테옴 및 세크레톰의 완전한 보기를 얻기 위해 기술 레퍼토리를 사용하여 추가 분석을 용이하게 합니다. 이러한 분석은 뇌의 심실에서 돌출된 이 놀라운 구조를 더 잘 이해하는 데 중요합니다. CP가 건강과 질병 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18에서 중요한 역할을 한다는 것이 점점 더 분명해지고 있기 때문에 이 지식은 엄청난 연구 관심사입니다.
방법의 중요한 단계, 수정 및 문제 해결
말단 마취가 잘 수행되는지 확인하기 위해 마우스의 발 반사를 확인하는 것이 가장 중요합니다. 윤리적 이유 외에도 실험 절차를 수행하는 동안 마우스가 올바른 위치에 유지되도록 합니다. 목표는 관류시 심장이 뛰는 동안 시술 중에 통증을 느끼지 않도록 동물을 마취시키는 것입니다. 조직의 추가 처리가 혈액 제거를 필요로하는 경우, 경심 관류가 수행 될 수있다. 혈액 응고를 피하기 위해 헤파린을 함유 한 식염수가 여기에 사용됩니다. EDTA는 또한 이 목적을 위해 사용될 수 있습니다, 그러나, 세포 생존율을 보존하기 위하여 필요한 경우에, 헤파린은 EDTA에 더 나은 선택입니다. 과도한 마취로 인해 심장 박동이 멈추면 즉시 관류를 시작해야합니다. 관류 펌프는 유체의 수동 투여보다 바람직한데, 이는 정밀하게 프로그래밍된 속도로 유체를 전달할 수 있고 관류로 인한 전단력이 너무 강하지 않도록 하기 때문입니다. 과도한 전단력은 CP 내에서 세포의 생존력과 구조를 손상시킵니다.
쥐의 뇌실에 떠 있는 CP를 볼 수 있으려면 훈련된 눈이 필요합니다. 그렇기 때문에 연습을 많이 하는 것이 가장 중요합니다. 브로모페놀 블루가 함유된 생쥐에 대한 훈련을 시작하는 것이 권장되는데, 이는 CP를 파란색으로 염색하고 작은 CP 조직을 뇌의 나머지 부분과 더 쉽게 구별할 수 있도록 하기 때문입니다(그림 2A, D). 이후 시험에서 CP는 관류되지 않은 마우스에서 분리될 수 있습니다. 이것은 브로모페놀 블루 관류 마우스에서 CP 분리에 비해 더 어렵지만 CP 조직은 여전히 혈관이 많이 형성된 특성에서 식별할 수 있습니다(그림 2B, E). 광범위한 훈련 후에만 뇌 실질에 의한 오염 없이 관류되지 않은 마우스에서 뇌실에서 CP 조직을 분리할 수 있습니다(그림 2C, F).
CP는 매우 연약하고 얇은 구조로, 그 안에 있는 세포의 생존력, 기능 및 구조를 보존하기 위해 필요한 신중함을 가지고 분리를 수행해야 함을 의미합니다. 따라서 설명된 프로토콜의 여러 단계는 뇌 무결성을 보존하기 위해 필요한 정밀도와 주의를 기울여 수행해야 합니다. 첫째, 어깨 가까이에서 마우스를 참수하는 것이 중요합니다. 절단이 너무 높으면 소뇌가 손상되어 제 4 심실에서 CP의 격리가 복잡해질 수 있습니다. 다음으로 뇌를 손상시키지 않도록 두개골을 조심스럽게 제거해야 합니다. 뇌가 분리되면 뇌가 흐물흐물해지는 것을 방지하기 위해 차갑게 유지하는 것이 중요한데, 이는 CP 격리를 상당히 복잡하게 만들기 때문입니다. 그렇게 하려면 얼음처럼 차가운 페트리 접시에 뇌를 놓고 뇌 위에 얼음처럼 차가운 PBS를 추가하는 것이 중요합니다. 설명된 격리 기술을 수행하려면 일정 수준의 훈련이 필요한데, 이는 마우스의 참수와 CP의 최종 격리 사이의 처리 시간을 크게 단축하기 때문입니다. 짧은 분리 과정은 분리된 조직의 생존력과 구조 보존을 향상시킵니다. 마지막으로, 격리에 사용되는 도구, 특히 겸자는 심실에서 CP를 빠르고 효율적으로 분리할 수 있도록 날카롭고 뾰족해야 합니다. 그러나 격리하는 동안 구조물의 무결성을 손상시키지 않도록 주의해야 합니다.
SEM을 위한 시료 처리 중 조직 무결성을 보존하기 위해 버퍼 사이를 이동할 때 CP를 작은 표본 바구니에 넣어 조직 자체를 만지는 것을 방지할 수 있습니다. 또한 조직을 EtOH 용액 밖으로 옮길 때 임계점 건조를 수행하는 것이 좋습니다. 이것은 미세 융모를 포함한 CP의 표면 구조의 보존을 보장합니다. 액체에서 기체 상태로의 전환으로 인한 표면 장력은 이러한 구조를 손상시킬 수 있습니다.
방법의 한계
앞서 언급했듯이 CP는 작은 구조이며 다운스트림 분석(예: 유세포 분석)에 따라 다른 마우스에서 CP를 풀링해야 할 수도 있습니다. CP 격리의 중요한 장애물은 구조가 여전히 심실에 떠 있을 때 구조를 식별하는 것입니다. CP의 고도로 혈관화 된 특성은 뇌의 심실 구멍 내부에서 올바른 식별 (일부 훈련 후)을 용이하게합니다. 그러나 추가 분석을 위해 혈액 함유 성분을 제거해야 하는 경우 경심 관류가 필수적입니다. 다운스트림 분석에 따라 브로모페놀 블루로 관류를 수행할 수 있으며, 이는 CP 블루를 염색하여 조직의 분리를 용이하게 합니다. 안타깝게도 이 시각화 기술이 항상 가능한 것은 아닙니다(예: 면역조직화학 염색의 경우). 이러한 경우 CP는 맹목적으로 격리되어야 하므로 적절한 교육이 필요합니다. 현미경의 광 회절을 사용하면 심실에 떠 있는 CP를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 원고는 제4심실과 측심실에 떠 있는 CP의 분리를 설명하는 반면, 제3뇌실 CP의 분리는 논의되지 않습니다.
기존 방법에 대한 의의
이 프로토콜에서 CP는 추가 분석이 수행되기 전에 먼저 뇌실에서 해부됩니다. 염색 절차를 후속 판독으로 사용하는 경우 CP가 포함된 뇌 부분을 염색하는 것도 가능합니다. 이 후자의 기술의 부가가치는 심실과 뇌 내의 CP 조직의 방향이 여전히 가시적이라는 것인데, 이는 CP가 먼저 뇌실에서 미세 해부되는 경우에는 그렇지 않습니다. 반면에, CP를 포함하는 뇌 섹션을 염색하는 것은 특정 섹션에서만 정보를 제공하는 반면, 분리된 CP를 염색하면 전체 CP에 대한 정보를 수집하는 데 도움이 될 수 있습니다.
기술된 기술의 장점은 CP 내에서 세포의 생존력, 기능 및 구조를 보존한다는 것이다. 또한, 이 방법은 성인 마우스의 제4 및 측뇌실에 떠 있는 CP의 완전한 분리를 용이하게 합니다. CP를 분리하는 방법(예: 쥐 뇌24 및 마우스 강아지 뇌25)이 이전에 보고되었습니다. 그러나 격리 기술은 종마다, 그리고 젊은 연령과 성인 연령에 따라 다를 수 있다는 점을 고려하는 것이 중요합니다.
기술의 추가 응용
CP 내에서 세포의 생존력, 기능 및 구조를 보존하는 것 외에도 이 분리 기술은 CP 기능에 대한 더 깊은 이해를 얻기 위해 다운스트림 기술의 적용을 용이하게 합니다. 예를 들어, 유세포 분석 또는 단일 세포 RNA 시퀀싱을 수행하여 특정 질병 조건 하에서 CP 세포 및 침윤 세포를 정량화하고 표현형으로 분석할 수 있습니다26,27. 또한, CP의 분자 조성을 조사하여 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 면역블롯 또는 소위 사이토카인 비드 어레이(cytokine bead array)에 의한 다중 사이토카인의 동시 분석을 통해 사이토카인 및 케모카인의 존재를 평가할 수 있습니다. 또한, 전사체, 혈관, 면역 세포 조직학 및 세크레톰 분석은 미세해부된 CP 외식편29에 대해 수행될 수 있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 벨기에 알츠하이머 연구 재단 (SAO, 프로젝트 번호 : 20200032), 플랑드르 연구 재단 (FWO Vlaanderen, 프로젝트 번호 : 1268823N, 11D0520N, 1195021N) 및 Baillet Latour Fund의 지원을 받았습니다. 교육, 지원 및 계기 공원에 대한 액세스를 제공한 VIB BioImaging Core에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 26G x 1/2 needle | Henke Sass Wolf | 4710004512 | |
| Aluminium specimen mounts | EM Sciences | 75220 | |
| Cacodylate buffer | EM Sciences | 11652 | |
| Carbon steel surgial blades | Swann-Morton | 0210 | size: 0.45 mm x 12 mm |
| Carbon adhesive tabs -12 mm | EM Sciences | 77825-12 | |
| Critical point dryer | Bal-Tec | CPD030 | |
| Crossbeam 540 | Zeiss | SEM system | |
| Forceps | Fine Science Tools GmbH | 91197-00 | |
| Glutaraldehyde | EM Sciences | 16220 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H-3125 | |
| Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channel | Metrohm Belgium N.V | CPA-7800160 | |
| Osmium Tetroxide | EM Sciences | 19170 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | |
| Platinum | Quorum | Q150T ES | PBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered |
| Sodium pentobarbital | Kela NV | 514 | |
| Specimen Basket Stainless Steel | EM Sciences | 70190-01 | |
| Stemi DV4 Stereo microscope | Zeiss | ||
| Surgical scissors | Fine Science Tools GmbH | 91460-11 |
References
- Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
- Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31 (4), Springer-Verlag. 497-511 (2009).
- Engelhardt, B., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H. Involvement of the choroid plexus in central nervous system inflammation. Microscopy Research and Technique. 52 (1), 112-129 (2001).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- De Bock, M., et al. A new angle on blood-CNS interfaces: a role for connexins. FEBS Letters. 588 (8), 1259-1270 (2014).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10 (5), 1473-1491 (2013).
- Redzic, Z. B., Segal, M. B. The structure of the choroid plexus and the physiology of the choroid plexus epithelium. Advanced Drug Delivery Reviews. 56 (12), 1695-1716 (2004).
- Kratzer, I., Ek, J., Stolp, H. The molecular anatomy and functions of the choroid plexus in healthy and diseased brain. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1862 (11), 183430 (2020).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Clinical implications of leukocyte infiltration at the choroid plexus in (neuro)inflammatory disorders. Drug Discovery Today. 20 (8), 928-941 (2015).
- Brkic, M., et al. Amyloid βoligomers disrupt blood-CSF barrier integrity by activating matrix metalloproteinases. Journal of Neuroscience. 35 (37), 12766-12778 (2015).
- Vandenbroucke, R. E., et al. Matrix metalloprotease 8-dependent extracellular matrix cleavage at the blood-CSF barrier contributes to lethality during systemic inflammatory diseases. Journal of Neuroscience. 32 (29), 9805-9816 (2012).
- Marques, F., et al. The choroid plexus response to a repeated peripheral inflammatory stimulus. BMC Neuroscience. 10, 135 (2009).
- Marques, F., et al. The choroid plexus in health and in disease: dialogues into and out of the brain. Neurobiology of Disease. 107, 32-40 (2017).
- Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nature Reviews Neuroscience. 16 (8), 445-457 (2015).
- Spector, R., Keep, R. F., Snodgrass, S. R., Smith, Q. R., Johanson, C. E. A balanced view of choroid plexus structure and function: Focus on adult humans. Experimental Neurology. 267, 78-86 (2015).
- Lehtinen, M. K., et al. The choroid plexus and cerebrospinal fluid: emerging roles in development, disease, and therapy. Journal of Neuroscience. 33 (45), 17553-17559 (2013).
- Balusu, S., Brkic, M., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. The choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in Alzheimer's disease: more than just a barrier. Neural Regeneration Research. 11 (4), 534-537 (2016).
- Demeestere, D., Libert, C., Vandenbroucke, R. E. Therapeutic implications of the choroid plexus-cerebrospinal fluid interface in neuropsychiatric disorders. Brain, Behavior, and Immunity. 50, 1-13 (2015).
- Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Basis of Disease. 1862 (3), 442-451 (2016).
- Serot, J. M., Zmudka, J., Jouanny, P. A possible role for CSF turnover and choroid plexus in the pathogenesis of late onset Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 30 (1), 17-26 (2012).
- Marques, F., et al. Altered iron metabolism is part of the choroid plexus response to peripheral inflammation. Endocrinology. 150 (6), 2822-2828 (2009).
- Thouvenot, E., et al. The proteomic analysis of mouse choroid plexus secretome reveals a high protein secretion capacity of choroidal epithelial cells. Proteomics. 6 (22), 5941-5952 (2006).
- Vandendriessche, C., et al. Importance of extracellular vesicle secretion at the blood-cerebrospinal fluid interface in the pathogenesis of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 143 (2021).
- Bowyer, J. F., et al. A visual description of the dissection of the cerebral surface vasculature and associated meninges and the choroid plexus from rat brain. Journal of Visualized Experiments. (69), e4285 (2012).
- Inoue, T., Narita, K., Nonami, Y., Nakamura, H., Takeda, S. Observation of the ciliary movement of choroid plexus epithelial cells ex vivo. Journal of Visualized Experiments. (101), e52991 (2015).
- Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
- Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
- Van Hoecke, L., et al. Involvement of the choroid plexus in the pathogenesis of Niemann-Pick disease type. C. Frontiers in Cell Neuroscience. 15, 757482 (2021).
- Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
- Guerin, C. J., Kremer, A., Borghgraef, P., Lippens, S. Targeted studies using serial block face and focused ion beam scan electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (150), e59480 (2019).
- JoVE.
- Pauwels, M., et al. Choroid plexus derived extracelular vesicles exhibit brain targeting characteristics). Biomaterials. 290, 121830 (2022).
