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Genetics

सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति का उपयोग करके डिम्बग्रंथि कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन की खोज

Published: April 7, 2023 doi: 10.3791/64734
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

Summary

यह लेख एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से गैर-ग्राफ्टेड और ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति के आधार पर दो तरीकों को प्रस्तुत करता है।

Abstract

दुनिया भर में लाखों लोग प्रजनन क्षमता से संबंधित मुद्दों से निपटते हैं। कम प्रजनन क्षमता, या यहां तक कि बांझपन, आनुवंशिक विकारों सहित कई अलग-अलग कारणों से हो सकता है, जिनमें से क्रोमोसोमल असामान्यताएं सबसे आम हैं। फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) मनुष्यों में क्रोमोसोमल विपथन का पता लगाने के लिए एक प्रसिद्ध और अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। फिश का उपयोग मुख्य रूप से संख्यात्मक या संरचनात्मक क्रोमोसोमल विपथन के साथ पुरुषों के शुक्राणुओं में क्रोमोसोमल असामान्यताओं के विश्लेषण के लिए किया जाता है। इसके अलावा, यह तकनीक अक्सर महिलाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन का पता लगाने के लिए भी लागू की जाती है जो डिम्बग्रंथि डिस्जेनेसिस का कारण बनती हैं। हालांकि, लिम्फोसाइटों और / या बुकल कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन के साथ महिलाओं से डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री पर जानकारी अभी भी कमी है।

इस अध्ययन का उद्देश्य डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री की पहचान करने के लिए फिश पर आधारित दो तरीकों को प्रस्तुत करके, महिलाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन के बारे में बुनियादी शोध को आगे बढ़ाना है। सबसे पहले, एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से गैर-ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक में पृथक डिम्बग्रंथि कोशिकाओं (अंडाणुओं, ग्रैनुलोसा कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं) की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। दूसरी विधि को डिम्बग्रंथि के ऊतकों में नवगठित द्वितीयक और सूक्ष्म रोम के डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री का निर्धारण करके कूपिक लोजेनेसिस पर क्रोमोसोमल विपथन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए निर्देशित किया जाता है, जो इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में लंबे समय तक ग्राफ्टिंग के बाद एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से होता है। एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं की प्रजनन क्षमता में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए दोनों विधियां भविष्य के शोध में सहायक हो सकती हैं।

Introduction

बांझपन पुरुष या महिला प्रजनन प्रणाली का एक स्वास्थ्य मुद्दा है,जो दुनिया भर में प्रजनन आयु के लगभग 186 मिलियन व्यक्तियों को प्रभावित करता है। कम से कम 35% जोड़ों में, बांझपन महिलाप्रजनन प्रणाली के विकार के कारण होता है। ऐसे कई कारक हैं जो महिला बांझपन का कारण बन सकते हैं, जैसे आनुवंशिक कारक, जननांग पथ की असामान्यताएं, अंतःस्रावी शिथिलताएं, सूजन संबंधी रोग, और आयनोजेनिक उपचार3।

अनुवांशिक असामान्यताएं लगभग 10% महिलाओं में मौजूद हैं 4,5. सभी आनुवंशिक असामान्यताओं में से, एक्स क्रोमोसोम विपथन डिम्बग्रंथि डिसजेनेसिस2 का सबसे आम कारण है। कई अध्ययनों से पता चला है कि टर्नर सिंड्रोम (टीएस) या ट्रिपल एक्स सिंड्रोम वाली महिलाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन रोगाणु कोशिकाओं के त्वरित नुकसान या बिगड़ा हुआ ओजेनेसिस 6,7,8 के कारण समय से पहले डिम्बग्रंथि की विफलता से जुड़ा हुआ है।

एक्स क्रोमोसोम के विपथन को विभाजित किया जा सकता है: 1) संख्यात्मक विपथन, जिसमें एक्स क्रोमोसोम की संख्या अलग है लेकिन एक्स क्रोमोसोम बरकरार हैं; और 2) संरचनात्मक विपथन, जिसमें एक्स क्रोमोसोम ने आनुवंशिक सामग्री प्राप्त की है या खो दी है 3,9. एक्स क्रोमोसोम के संख्यात्मक विचलन संरचनात्मक असामान्यताओं की तुलना में अधिक आम हैं और अक्सर कोशिका विभाजन 3,9 के दौरान सहज त्रुटियों के कारण होते हैं। जब अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान ऐसी त्रुटि होती है, तो यह एन्यूप्लोइड युग्मकों और अंततः सभी कोशिकाओं में क्रोमोसोमल विपथन के साथ संतान ों को जन्म दे सकती है। जब ऑन्टोजेनेसिस के शुरुआती चरणों में माइटोसिस के दौरान होने वाली त्रुटियों के परिणामस्वरूप दैहिक कोशिकाओं में गुणसूत्र दोष उत्पन्न होते हैं, तो इससे मोज़ेकिज्म हो सकता है। इन व्यक्तियों में, सामान्य एक्स क्रोमोसोमल सामग्री वाली कोशिकाएं और एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली कोशिकाएं मौजूद हैं।

1980 के दशक में, मेटाफ़ेज़ और इंटरफ़ेज़ क्रोमोसोम10,11 पर विशिष्ट न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों की कल्पना और पता लगाने के लिए फ्लोरेसेंस इन सीटू संकरण (फिश) नामक एक साइटोजेनेटिक तकनीक विकसित की गई थी। यह तकनीक क्रोमोसोम में एक विशिष्ट अनुक्रम को बांधने के लिए फ्लोरोसेंट-लेबल डीएनए जांच का उपयोग करती है, जिसे तब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है।

आजकल, फिश का व्यापक रूप से नैदानिक नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है और क्रोमोसोमल विपथनका पता लगाने में स्वर्ण मानक माना जाता है। प्रजनन चिकित्सा के क्षेत्र में, शुक्राणु पर फिश विश्लेषण का उपयोग दैहिक कोशिकाओं12,13,14 में संख्यात्मक या संरचनात्मक क्रोमोसोमल विपथन के साथ पुरुषों में शुक्राणुओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया गया है। इन अध्ययनों से पता चला है कि क्रोमोसोमल विपथन वाले पुरुषों में सामान्य कैरियोटाइप12,13,14 वाले पुरुषों की तुलना में उनके वीर्य में मौजूद एन्यूप्लोइड शुक्राणुओं की उच्च आवृत्ति होने की अधिक संभावना थी।

शुक्राणुओं के विपरीत, क्रोमोसोमल विपथन वाले व्यक्तियों में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं (अंडाणुओं, ग्रैनुलोसा / थेका कोशिकाओं और स्ट्रोमल कोशिकाओं सहित) की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री के बारे में बहुत कम जानकारी है, साथ ही साथ उनकी प्रजनन क्षमता पर इन कोशिकाओं के एन्यूप्लोइडी के संभावित परिणाम भी हैं। शुक्राणुओं की तुलना में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं के कैरियोटाइप पर दुर्लभ जानकारी का एक महत्वपूर्ण कारण यह तथ्य है कि महिलाओं को अंडाणुओं या डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक प्राप्त करने के लिए कूप पंचर या सर्जरी जैसी आक्रामक प्रक्रिया से गुजरना पड़ता है। इसलिए, अनुसंधान उद्देश्यों के लिए महिला युग्मकों को प्राप्त करना मुश्किल है।

वर्तमान में, टीएस15 के साथ युवा महिलाओं में डिम्बग्रंथि ऊतक क्रायोप्रिजर्वेशन की प्रभावकारिता का पता लगाने के लिए नीदरलैंड में एक अवलोकन हस्तक्षेप अध्ययन किया जा रहा है। रोगी के डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक का एक टुकड़ा डिम्बग्रंथि कोशिकाओं16,17 की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री की पहचान करने के लिए उपलब्ध था। अध्ययन के हिस्से के रूप में, यह निर्धारित करने के लिए अलग डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक की फिश के आधार पर एक नई विधि विकसित की गई थी कि क्या गैर-डिम्बग्रंथि दैहिक कोशिकाओं में क्रोमोसोमल विपथन ले जाने वाली महिलाओं में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं में क्रोमोसोमल विपथन मौजूद हैं, जैसे लिम्फोसाइट्स या बुकल कोशिकाएं। इसके अलावा, फॉलिकुलोजेनेसिस पर डिम्बग्रंथि कोशिकाओं में एन्यूप्लोइडी का प्रभाव भी निर्धारित किया गया था। इसके लिए, एक स्थापित फिश प्रोटोकॉल को संशोधित किया गया था जो इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में दीर्घकालिक क्सीनट्रांसप्लांटेशन के दौरान कृत्रिम रूप से प्रेरित फॉलिकुलोजेनेसिस के बाद डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक के हिस्टोलॉजिकल वर्गों के विश्लेषण को सक्षम बनाता है। इस अध्ययन में, हम इस विषय पर बुनियादी विज्ञान में सुधार करने के उद्देश्य से एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं में गैर-ग्राफ्टेड और ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए फिश पर आधारित दो तरीकों को प्रस्तुत करते हैं।

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Protocol

टर्नरफर्टिलिटी अध्ययन प्रोटोकॉल को मानव विषयों से जुड़े अनुसंधान पर केंद्रीय समिति (एनएल 57738.000.16) द्वारा अनुमोदित किया गया है। इस अध्ययन में, टीएस के साथ 93 महिलाओं के डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक प्राप्त किए गए थे। जिन सामग्रियों को सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता होती है, उन्हें तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है।

तालिका 1: सुरक्षा सावधानियां।

भौतिक खतरा
एसीटिक अम्ल गंभीर त्वचा जलन और श्वसन प्रणाली की जलन
कोलेजनेस आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा को परेशान करना
DAPI आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा को परेशान करना
DNase I आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा को परेशान करना
एथनॉल अत्यधिक ज्वलनशील
फ़ॉर्मलडिहाइड (ज़हरीली गैस) साँस लेना, अंतर्ग्रहण और त्वचा के संपर्क के बाद विषाक्त
Formamide
(प्रतिदीप्ति जांच में)		 अजन्मे बच्चे को नुकसान पहुंचा सकता है
लिबेरेस आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा को परेशान करना
मेथनॉल अत्यधिक ज्वलनशील, साँस लेना, अंतर्ग्रहण और त्वचा के संपर्क से विषाक्त
Nonidet P40 त्वचा या आंखों को परेशान करना
पेप्सिन आंखों, श्वसन प्रणाली और त्वचा को परेशान करना
प्रोटीन के साँस लेने के बाद सांस लेने में कठिनाई
ज़ाइलीन अत्यधिक ज्वलनशील, साँस लेना और त्वचा के संपर्क के बाद विषाक्त। आंखों के संपर्क से बचें।

तालिका 1: ऐसी सामग्री जिन्हें सुरक्षा सावधानियों की आवश्यकता होती है।

1. पृथक व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि प्रांतस्था कोशिकाओं पर मछली

  1. व्यक्तिगत कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक का पृथक्करण।
    1. क्रायोप्रिजर्व्ड / पिघले हुए डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक को स्केलपेल का उपयोग करके लगभग 1 मिमी x 1 मिमी x 1 मिमी के छोटे टुकड़ों में काटें।
    2. एंजाइमेटिक रूप से ऊतक के टुकड़ों को 4 मिलीलीटर पूर्व-गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) एल 15 माध्यम में पचाते हैं जिसमें 0.1 मिलीग्राम / एमएल ऊतक पृथक्करण एंजाइम मिश्रण, 10 μg / mL DNase I, और 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजनेस I होता है । हर 15 मिनट में पाचन मिश्रण को ऊपर और नीचे करें।
    3. 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक ठंडे एल 15 के 4 मिलीलीटर जोड़कर एंजाइमेटिक पाचन को रोकें। विघटित ऊतक को 500 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा 8 मिलीलीटर ठंडे L15 माध्यम से एक बार धोएं और कोशिकाओं को नुकसान से बचाने के लिए बिना भंवर के 500 μL L15 माध्यम में फिर से निलंबित करें।
    4. बड़े पैमाने पर अलग-अलग स्ट्रोमल कोशिकाओं और छोटे रोम (ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक परत से घिरे अंडाणु) वाले सेल निलंबन को प्लास्टिक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप (100 x आवर्धन) के तहत सेल निलंबन की जांच करें।
    5. 75 μm प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके मैन्युअल रूप से छोटे रोम (<50 μm) को उठाएं और रोम के एकत्रीकरण को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10% FBS के साथ पूरक L15 माध्यम की एक बूंद में रोम को स्थानांतरित करें। अधिकतम 30 मिनट के लिए कूप पिक-अप करें। फिश विश्लेषण से पहले कूपिक सेल प्रसार में सुधार करने के लिए, शुद्ध रोम को 0.06% ट्रिप्सिन, 1 मिलीग्राम / एमएल एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (ईडीटीए), और 1 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज के घोल में स्थानांतरित करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. छोटे रोम के साथ संदूषण से बचने के लिए विशेष देखभाल करते हुए, 75 μm प्लास्टिक पिपेट का उपयोग करके कॉर्टेक्स सेल निलंबन से डिम्बग्रंथि स्ट्रोमल कोशिकाओं को प्राप्त करें।
  2. व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि कोशिका का मछली विश्लेषण।
    1. उपचारित डिम्बग्रंथि के रोम (अनुशंसित एन = 5-20) को ट्रिप्सिन/ईडीटीए/ग्लूकोज या स्ट्रोमल कोशिकाओं (एन > 1,000) के साथ 0.15 एमएम केसीएल/15 μL की 5 μL की बूंदों में स्थानांतरित करें।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 मिनट के लिए 0.05 एमएम केसीएल / 7.5% एसिटिक एसिड / 22.5% मेथनॉल के 300 μL में स्लाइड को सुखाएं और पूर्व-फिक्स करें। निर्धारण को अंतिम रूप देने के लिए आरटी पर 2 मिनट के लिए मेथनॉल / एसिटिक एसिड (3: 1) के साथ स्लाइड को कवर करें।
    3. 5 लीटर आसुत जल में 876 ग्राम सोडियम क्लोराइड और 441 ग्राम ट्राई-सोडियम साइट्रेट डाइहाइड्रेट मिलाकर 20x मानक सोडियम साइट्रेट (एसएससी) बनाएं। इसके बाद, 2x SSC प्राप्त करने के लिए 20x SSC के 100 mL को 900 mL डिमिनरलाइज्ड (डेमी) पानी में मिलाएं। नमूने को 73 डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी में धोएं, इसे 2% प्रोटीन के 100 μL के साथ कवर करें, और इसे कवरस्लिप के साथ सील करें। संकरण स्टेशन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए स्लाइड ्स को इनक्यूबेट करें।
    4. कवरस्लिप को हटा दें और आरटी पर डीपीबीएस में 5 मिनट के लिए स्लाइड धो लें। आरटी पर 1% फॉर्मलाडेहाइड के साथ 5 मिनट के लिए नमूना फिक्स करें। इस स्तर पर, सामग्री अभी तक ग्लास स्लाइड से पूरी तरह से जुड़ी नहीं है और इसलिए इसे हिलाने वाले मंच पर नहीं रखा जाना चाहिए।
    5. आरटी पर डीपीबीएस में 5 मिनट के लिए स्लाइड धोएं, इसके बाद 70%, 80%, 90%, और 100% इथेनॉल में निर्जलीकरण 2 मिनट के लिए करें। निर्जलित नमूने को हवा से सुखाएं और इसे फ्लोरोसेंटली लेबल वाले प्रोब के साथ संकरित करें।
    6. डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में क्रोमोसोम एक्स के लिए एक सेंट्रोमियर-विशिष्ट जांच और एक अन्य क्रोमोसोम-विशिष्ट सेंट्रोमेरिक जांच का चयन करें। इस मामले में, क्रोमोसोम एक्स (सीईपी एक्स [डीएक्सजेड 1]) के लिए सेंट्रोमियर-विशिष्ट जांच का उपयोग सीधे फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रमग्रीन और क्रोमोसोम 18 (सीईपी 18 [डी 18 जेड 1]) के साथ सीधे फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रम ऑरेंज के साथ लेबल किया जाता है।
    7. नमूने में सीईपी एक्स के 1 μL, CEP 18 के 1 μL, और संकरण बफर के 18 μL जोड़ें और एक कवरस्लिप के साथ सील करें जो संकरण के दौरान जांच के वाष्पीकरण को रोकने के लिए स्लाइड से चिपकाया जाता है। स्लाइड को 3 मिनट के लिए 73 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण के लिए संकरण स्टेशन पर स्थानांतरित करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर की इनक्यूबेशन के दौरान संकरण करें।
    8. संकरण के बाद स्लाइड से कवरस्लिप और किसी भी शेष गोंद को हटा दें। स्लाइड्स को 0.4x SSC/0.3% ट्वीन-20 में 2 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर धोएं, इसके बाद 2x SSC में 1 मिनट के लिए इनक्यूबेशन करें / RT पर 0.1% ट्वीन-20।
    9. 70%, 80%, 90%, और 100% इथेनॉल में 2 मिनट के ऊष्मायन द्वारा स्लाइड्स को निर्जलित करें और अंधेरे में हवा में सूखें। स्लाइड्स को 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (DAPI) युक्त एक बढ़ते माध्यम से कवर करें। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  3. इमेजिंग
    1. एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर से जुड़े प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ एक्स क्रोमोसोम के लिए सिग्नल (ओं) की जांच करें।
      1. सबसे पहले, फ्लोरोक्रोम डीएपीआई का चयन करें।
        1. 630x आवर्धन पर नए सेल > लाइव > कैप्चर का चयन करके एक छवि प्राप्त करें। दहलीज के साथ एक नई विंडो दिखाई देगी। पृष्ठभूमि को कम करने के लिए दहलीज की नीली पट्टी को 0 पर सेट करें और संकेतों को उज्जवल बनाने के लिए लाल पट्टी को अधिकतम (255) पर सेट करें। स्वीकार करें पर क्लिक करें।
        2. वृद्धि के साथ एक नई विंडो गहरे / उज्जवल (12), त्रिज्या (3), और गहराई (1) के सुझाव के साथ दिखाई देगी। सुझाए गए मानों का उपयोग करें या संतुष्ट न होने पर उन्हें समायोजित करें.
      2. दूसरे, फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रमऑरेंज का चयन करें और कैप्चर पर क्लिक करें।
        1. पृष्ठभूमि को कम करने के लिए दहलीज की नीली पट्टी को 0 पर सेट करें और संकेतों को उज्जवल बनाने के लिए लाल पट्टी को अधिकतम (255) पर सेट करें। स्वीकार करें पर क्लिक करें।
        2. वृद्धि के साथ खिड़की गहरे / उज्जवल (-11), त्रिज्या (2.7), और गहराई (0.6) के सुझाव के साथ दिखाई देगी। सुझाए गए मानों का उपयोग करें या संतुष्ट न होने पर उन्हें समायोजित करें.
      3. अंत में, फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रमग्रीन का चयन करें और कैप्चर पर क्लिक करें।
        1. पृष्ठभूमि को कम करने के लिए दहलीज की नीली पट्टी को 0 पर सेट करें और संकेतों को उज्जवल बनाने के लिए लाल पट्टी को अधिकतम (255) पर सेट करें। स्वीकार करें पर क्लिक करें।
        2. वृद्धि के साथ खिड़की गहरे / उज्जवल (0), त्रिज्या (3), और गहराई (0) के सुझाव के साथ दिखाई देगी। सुझाए गए मानों का उपयोग करें या संतुष्ट न होने पर इसे समायोजित करें। छवि को किसी नई बनाई गई फ़ाइल में सहेजें.
          नोट: दैहिक कोशिकाओं का मूल्यांकन केवल तब किया गया था जब नियंत्रण गुणसूत्र 18 के दो संकेत दिखाई दे रहे थे। अधिकांश अंडाणुओं में, प्रत्येक गुणसूत्र के लिए केवल एक संकेत का पता लगाया जा सकता है।
    2. संकेतों के नुकसान को रोकने के लिए विश्लेषण के बाद स्लाइड को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

2. ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक के पैराफिन वर्गों पर मछली

नोट: टीएस के साथ 18 महिलाओं के क्रायोप्रिजर्व्ड / पिघले हुए डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक का एक टुकड़ा 5 महीने के लिए गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (एससीआईडी) चूहों में जेनोग्राफ्ट किया गया था। जेनोग्राफ्टिंग की प्रक्रिया को पहले वर्णित किया गया है और पशु कल्याण के संबंध में पशु अनुसंधान समिति के स्थानीय दिशानिर्देशों (संदर्भ 2014 / यूसीएल / एमडी / 007) 18,19 के बाद यूनिवर्सिटी कैथोलिक डी लौवेन (ब्रुसेल्स, बेल्जियम) में आयोजित किया गया था।

  1. रोम युक्त जेनोग्राफ्ड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक के वर्गों का चयन करना
    1. 4% फॉर्मलाडेहाइड में जेनोग्राफ्ड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक को फिक्स करें और ऊतक को पैराफिन में एम्बेड करें। अतिरिक्त पैराफिन को हटाने के लिए एक स्केलपेल के साथ ब्लॉक को ट्रिम करें और पैराफिन ब्लॉक को रोटेशन माइक्रोटोम पर 4 μm मोटाई तक काटें।
    2. हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एचई) धुंधला होने के लिए पैराफिन रिबन के हर सातवें खंड का चयन करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि किन वर्गों में रोम हैं। अनुभाग को 40-45 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखें और उन्हें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करें।
  2. डिपैराफिनाइजेशन और एचई धुंधलापन।
    1. स्लाइड को 60 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए स्टोव पर रखें, और उसके बाद स्लाइड को 5 मिनट के लिए 100% जाइलीन में डुबोएं। स्लाइड ्स को सीधे स्टोव पर रखना आवश्यक नहीं है। 100% इथेनॉल में 15 सेकंड के लिए वर्गों को हाइड्रेट करें, इसके बाद 96% इथेनॉल में 2 x 15 एस। 2 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड ्स को धो लें।
    2. स्लाइड को 10 मिनट के लिए हेमटोक्सीलिन में दाग दें और उसके बाद नल के पानी में स्लाइड को संक्षेप में धो लें। संक्षेप में स्लाइड्स को बाइकार्बोनेट समाधान (100 ग्राम मैग्नीशियम सल्फेट और 10 ग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट को 5 लीटर आसुत जल में) में डुबोएं। 5 मिनट के लिए नल के पानी में स्लाइड को धो लें।
    3. 4 मिनट के लिए इओसिन के साथ स्लाइड को काउंटरस्टेन करें और स्लाइड को 100% इथेनॉल के साथ तीन बार निर्जलित करें, इसके बाद जाइलिन। स्लाइड्स पर एचई दाग को कवर करें और फॉलिकल्स (100x आवर्धन) वाले अनुभागों का चयन करने के लिए एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एचई अनुभागों का मूल्यांकन करें।
  3. डीएनए फिश के लिए पैराफिन वर्गों का पूर्व-उपचार और संकरण।
    1. पैराफिन रिबन से रोम युक्त अनुभाग के पहले या बाद में रखे गए नए अनुभागों का चयन करें. ग्लास स्लाइड पर एक खंड माउंट करें। पैराफिन अनुभागों को 56 डिग्री सेल्सियस पर स्टोव पर कम से कम 45 मिनट के लिए सुखाएं। स्लाइड ्स को सीधे स्टोव पर रखना आवश्यक नहीं है।
    2. 10 मिनट के लिए जाइलीन में अनुभागों को डिपैराफिन करें। स्लाइड को 99.5% इथेनॉल में डुबोएं और उन्हें नल के पानी में 5 मिनट के लिए कुल्ला करें। 96 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए लक्ष्य पुनर्प्राप्ति समाधान (कम पीएच) के साथ स्लाइड्स का पूर्व-उपचार करें। ठंडा होने के बाद, आसुत पानी में स्लाइड ्स को धो लें।
    3. स्लाइड्स को 0.01 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ 5 मिनट के लिए ट्रीट करें, इसके बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए पेप्सिन पाचन (200 यू / एमएल) लें। स्लाइड को 0.01 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड में फिर से कुल्ला करें और बाद में पीबीएस में।
    4. स्लाइड्स को 5 मिनट के लिए 1% फॉर्मलाडेहाइड / पीबीएस में फिक्स करें। स्लाइड्स को पीबीएस में संक्षेप में कुल्ला करें, और फिर डेमी पानी में फिर से। स्लाइड्स को 99.5% इथेनॉल में निर्जलित करें और उन्हें हवा में सूखने दें।
    5. ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में क्रोमोसोम एक्स के लिए एक सेंट्रोमियर-विशिष्ट जांच और एक अन्य क्रोमोसोम-विशिष्ट सेंट्रोमेरिक जांच का चयन करें। यहां, क्रोमोसोम 18 का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया जाता है।
    6. प्रोब सीईपी 18 (डी 18 जेड 1) के 5 μL को सीधे फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रमग्रीन के साथ लेबल करें और पूर्व-उपचारित स्लाइड्स पर सीधे फ्लोरोक्रोम स्पेक्ट्रमरेड के साथ लेबल किए गए सीईपी एक्स (डीएक्सजेड 1) की जांच करें। एक कवरस्लिप लागू करें और फोटो गोंद के साथ क्षेत्र को सील करें। स्लाइड्स को 10 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर विकृतीकरण और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर संकरण के लिए एक हाइब्रिडाइज़र में रखें।
    7. अगले दिन, 42 डिग्री सेल्सियस पर 2x SSC में 5 मिनट के लिए स्लाइड ्स को धोएं, इसके बाद 73 डिग्री सेल्सियस पर 0.3% नोनिडेट पी 40 में 2 मिनट और 1 मिनट कुल्ला करें। 2x SSC को ताज़ा करें और स्लाइड को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए फिर से धो लें। क्यूवेट को कवर करें ताकि अनुभागों को अंधेरे में रखा जाए।
    8. आसुत जल में स्लाइड ्स को संक्षेप में धो लें। स्लाइड्स को 99.5% इथेनॉल में निर्जलित करें और उन्हें फिर से हवा में सूखने दें। अंत में, स्लाइड्स को DAPI और माउंटिंग माध्यम युक्त समाधान के साथ माउंट करें।
  4. इमेजिंग
    1. 630x आवर्धन पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत परिणामों का विश्लेषण करें। कंप्यूटर पर छवि संसाधन सॉफ़्टवेयर खोलें। प्रोफ़ाइल के रूप में FISH का चयन करें।
    2. जांचें कि क्या डीएपीआई उत्सर्जन 431 एनएम और उत्तेजना 359 एनएम पर सेट है, टेक्सास लाल उत्सर्जन 613 एनएम और उत्तेजना 595 एनएम पर, और एफआईटीसी उत्सर्जन 519 एनएम और उत्तेजना 495 एनएम पर सेट है।
    3. लाइव > कैप्चर सिंगल इमेज का चयन करके एक छवि प्राप्त करें। बाईं ओर छवि मेनू में एक्सपोज़र स्लाइडर और गेन स्लाइडर को स्थानांतरित करके एक्सपोज़र और गेन स्लाइडर को स्थानांतरित करके छवि की गुणवत्ता को अनुकूलित करें (उदाहरण के लिए, एक्सपोज़र: 212 एमएस, और लाभ: 7.9)। आवश्यक प्रदर्शन और लाभ प्रति छवि भिन्न हो सकते हैं; अनुकूलित छवि प्राप्त करने के लिए इस प्रक्रिया के दौरान परिवर्तनों का निरीक्षण करें। छवि को किसी नई बनाई गई फ़ाइल में सहेजें.
    4. संकेतों के नुकसान को रोकने के लिए विश्लेषण के बाद स्लाइड को अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

ग्राफ्टिंग से पहले पृथक डिम्बग्रंथि कोशिकाओं पर मछली
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके परिणामों को चित्रित करने के लिए 45, एक्स / 46, एक्सएक्स (रोगी ए) या 45, एक्स / 46, एक्सएक्स / 47, XXX (रोगी बी) टीएस के साथ महिलाओं से क्रायोसंरक्षित डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक का उपयोग किया गया था। रोगी ए में, लिम्फोसाइटों के 50% में 45,एक्स कैरियोटाइप था और 50% में 46,एक्सएक्स था। रोगी बी में, लिम्फोसाइटों का 38% 45,एक्स था, 28% 46,एक्सएक्स थे, और 34% 47,XXX थे। नियंत्रण (लाल) के रूप में क्रोमोसोम एक्स (हरा) और क्रोमोसोम 18 के लिए सेंट्रोमियर-विशिष्ट जांच का उपयोग टीएस रोगियों के डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक से पृथक व्यक्तिगत ग्रैनुलोसा कोशिकाओं, स्ट्रोमल कोशिकाओं और अंडाणुओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए किया गया था (चित्रा 1)।

Figure 1
चित्रा 1: ग्राफ्टिंग से पहले डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक से पृथक डिम्बग्रंथि कोशिकाओं का मछली विश्लेषण। एकल प्राइमर्डियल फॉलिकल्स (ए, बी) और (सी, डी) से अंडाणुओं (तीर सिर) और ग्रैनुलोसा कोशिकाओं का विश्लेषण क्रोमोसोम एक्स (ग्रीन सिग्नल) और नियंत्रण क्रोमोसोम 18 (लाल संकेत) के लिए फ्लोरोसेंट विशिष्ट जांच के साथ किया गया था। सफेद तीर 45,एक्स सेल लाइनों को इंगित करते हैं, पीले तीर 46,एक्सएक्स सेल लाइनों को इंगित करते हैं, और लाल तीर 47,XXX सेल लाइनों को इंगित करते हैं। सभी फ्लोरोसेंट सिग्नल फोकस के एक ही विमान में नहीं हैं। सलाखों 10 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। फिश सिग्नल का आवर्धन 630x पर सेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

फिश से पहले ट्रिप्सिन के साथ और बिना इलाज किए गए व्यक्तिगत आदिम रोम के बीच अंतर को चित्र 2 में दिखाया गया है। फिश विश्लेषण से पहले ट्रिप्सिन का उपयोग करके, ग्रैनुलोसा सेल द्रव्यमान और अंडाणुओं को कम संकुचित किया गया था, जिससे व्यक्तिगत ग्रैनुलोसा कोशिकाओं और अंडाणुओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री का विश्लेषण किया जा सकता था। अंडाणुओं के डीएनए को अंडाणुओं के अनियमित आकार, आकार और फैलाव के कारण आसपास की ग्रैनुलोसा कोशिकाओं से आसानी से अलग किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक गुणसूत्र के लिए केवल एक मजबूत फिश सिग्नल छोटे रोम के अंडाणुओं में देखा जाता है, क्योंकि इन कोशिकाओं में चार बहन क्रोमैटिड की निकटता होती है। अंडाणुओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को क्रोमोसोम एक्स के लिए फिश सिग्नल के सतह अनुपात का उपयोग करके क्रोमोसोम 18 के लिए निर्धारित किया जा सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: मछली से पहले ट्रिप्सिन के साथ और बिना इलाज किए गए छोटे रोम। (ए) डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक के एंजाइमेटिक पाचन के परिणामस्वरूप बड़े पैमाने पर विघटित कोशिकाओं का निलंबन हुआ, लेकिन आदिम रोम को छोड़ दिया गया, जिसमें ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक परत (पैनल ए में तीर सिर) से घिरा एक बरकरार अंडाणु शामिल था। (बी) छोटे रोम को सेल निलंबन से चुना गया था, लेकिन ग्रैनुलोसा कोशिकाओं (सी) के झुरमुट के कारण फिश के बाद संकेतों की व्याख्या करने में कठिनाइयां प्रदान की गईं। (D, E) फिश से पहले ट्रिप्सिन के साथ पृथक रोम के अतिरिक्त पाचन के परिणामस्वरूप अलग-अलग ग्रैनुलोसा कोशिकाएं रोम की सतह पर एक गोलाकार आकृति विज्ञान में सिकुड़ जाती हैं और फिश विश्लेषण के लिए सुलभ होने के लिए कूप से अलग होने की अधिक संभावना होती है। अंडाणु-व्युत्पन्न मछली संकेतों को तीर द्वारा इंगित किया जाता है। काली पट्टियाँ 100 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं और सफेद सलाखों 10 μm का प्रतिनिधित्व करती हैं। फिश सिग्नल का आवर्धन 630x पर सेट किया गया था। पैनल डी को पीक एट अल से अनुमति के साथ पुन: प्रस्तुत किया गया है।16. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

"ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक के पैराफिन वर्गों पर ग्रैनुलोसा कोशिकाओं का मछली विश्लेषण"।
द्वितीयक और सूक्ष्म रोम एंजाइमेटिक पाचन के लिए कम संवेदनशील पाए गए, जो व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ऊतक पृथक्करण की पहले वर्णित विधि को लंबे समय तक जेनोग्राफ्टिंग के बाद डिम्बग्रंथि के ऊतकों में पाए जाने वाले बढ़ते रोम के लिए उपयुक्त नहीं बनाता है। इसलिए, ग्राफ्टिंग के बाद डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक में द्वितीयक और एंट्रल रोम के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए फिश प्रोटोकॉल को 4 μm हिस्टोलॉजिकल वर्गों का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था (चित्रा 3)। इस सेटिंग में, यह संभावना नहीं है कि बढ़ते रोम में अंडाणुओं के बड़े व्यास के कारण, अंडाणुओं में एक्स क्रोमोसोम या नियंत्रण गुणसूत्र के फिश सिग्नल को एक एकल 4 μm खंड में कैप्चर किया जाएगा।

Figure 3
चित्रा 3: एक्सनोट्रांसप्लांटेशन के बाद डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक वर्गों का हिस्टोलॉजिकल और फिश धुंधलापन। (ए, बी) हेमाटोक्सिलिन/ईओसिन धुंधला पन 5 महीने के जेनोग्राफ्टिंग के बाद डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक में रूपात्मक रूप से सामान्य द्वितीयक और सूक्ष्म रोम दिखाता है। (C, D) इन रोम के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री फिश विश्लेषण द्वारा निर्धारित की गई थी। इस आंकड़े में, क्रोमोसोम एक्स को लाल रंग में और क्रोमोसोम 18 को हरे रंग में दिखाया गया है। पैनल ए में बार 50 μm का प्रतिनिधित्व करता है, पैनल B में बार 20 μm का प्रतिनिधित्व करता है, और पैनल C और D में बार 10 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। फिश सिग्नल का आवर्धन 630x पर सेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पहले चरण के रूप में, ऊतकों की विभिन्न फिक्सिंग तकनीकों के साथ प्रयोग यह निर्धारित करने के लिए किए गए थे कि किस विधि के परिणामस्वरूप सबसे अच्छा फिश सिग्नल होता है। फिश विश्लेषण ग्राफ्टेड ऊतक पर किया गया था जो बौइन के समाधान दोनों में लगाया गया था और बाद में 4% फॉर्मलाडेहाइड में डूबा हुआ था, और ग्राफ्टेड ऊतक पर जो केवल 4% फॉर्मलाडेहाइड में लगाया गया था। ग्राफ्टेड ऊतक जो पहली बार बौइन में लगाया गया था, ने छवि पर एक हरे रंग की धुंध प्रदर्शित की, जिससे फिश संकेतों की संख्या को सटीक रूप से गिनना मुश्किल हो गया (चित्रा 4)।

Figure 4
चित्रा 4: ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक केवल बौइन के समाधान और फॉर्मलाडेहाइड में लगाया गया है। (ए) बोइन के समाधान में ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक को ठीक करने के परिणामस्वरूप हरे रंग की धुंध के कारण कूपिक कोशिकाओं में धुंधली और काफी हद तक अस्पष्ट फ्लोरोसेंट सिग्नल हो गए। (बी) डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक जो फॉर्मलाडेहाइड में लगाया गया था, केवल उत्कृष्ट फ्लोरोसेंट संकेत प्रदान करता था जो व्याख्या करना आसान था। सलाखों 10 μm का प्रतिनिधित्व करते हैं। फिश सिग्नल का आवर्धन 630x पर सेट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हिस्टोलॉजिकल वर्गों में रोम के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए, ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के फिश संकेतों को गिनना संभव नहीं है। ऊतक के विभाजन के कारण, एक व्यक्तिगत ग्रैनुलोसा सेल के गुणसूत्रों का हिस्सा एक निश्चित हिस्टोलॉजिकल खंड में खो सकता है। इसलिए, ऊतक की ग्राफ्टिंग के बाद नवगठित द्वितीयक और सूक्ष्म रोम में एन्यूप्लोइडी के कारण ग्रैनुलोसा सेल आबादी की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री के नुकसान का निर्धारण करने से पहले पहले पहले सेक्शनिंग के कारण खोए गए फिश संकेतों का प्रतिशत निर्धारित करना आवश्यक है।

सेक्शनिंग के कारण खोए हुए फिश संकेतों के प्रतिशत की गणना गैर-एन्यूप्लोइड नियंत्रण गुणसूत्र 18 के प्रति ग्रैनुलोसा सेल में फिश संकेतों की संख्या निर्धारित करके की जा सकती है। यह उम्मीद की जाती है कि सेक्शनिंग के कारण एक्स क्रोमोसोम का समान प्रतिशत खो जाता है। ग्रैनुलोसा सेल आबादी में एक्स क्रोमोसोम फिश संकेतों की संख्या में कोई भी अतिरिक्त कमी एन्यूप्लोइडी के कारण होती है। हालांकि, एन्यूप्लोइडी के कारण एक्स क्रोमोसोमल हानि को निर्धारित करने के लिए एक नियंत्रण गुणसूत्र के फिश संकेतों का उपयोग करने के लिए एक्स क्रोमोसोम के फिश संकेतों की पहचान संवेदनशीलता और नियंत्रण गुणसूत्र बहुत समान होने की आवश्यकता होती है। गैर-एन्यूप्लोइड 46,एक्सएक्स व्यक्तियों के हिस्टोलॉजिकल वर्गों में बढ़ते रोम के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में दोनों फिश जांच की पहचान संवेदनशीलता इसलिए निर्धारित की गई थी। जब क्रोमोसोम एक्स / कंट्रोल क्रोमोसोम फिश संकेतों का अनुपात 1 के करीब होता है, तो यह माना जा सकता है कि दोनों जांचों की पहचान संवेदनशीलता वास्तव में बहुत समान है, और इस प्रकार फिश जांच का उपयोग एक्सनोट्रांसप्लांटेशन के बाद डिम्बग्रंथि ऊतक के हिस्टोलॉजिकल वर्गों में बढ़ते रोम के ग्रैनुलोसा सेल आबादी में एन्यूप्लोइडी के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है।

उदाहरण
46,XX व्यक्ति के अंडाशय से एक कूप के 130 ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में क्रोमोसोम 18 संकेतों की संख्या का विश्लेषण करते समय, यह उम्मीद की जाती है कि 260 संकेत मौजूद हैं। हालांकि, इन कोशिकाओं के 4 μm खंड में, केवल 204 गुणसूत्र 18 संकेत देखे गए थे। यह इंगित करता है कि सेक्शनिंग ((260-204)/260 x 100 = 21.5% के कारण 21.5% सिग्नल खो जाते हैं। इसलिए प्रति ग्रैनुलोसा सेल क्रोमोसोम 18 संकेतों की संख्या सेक्शनिंग के कारण 204/130 = 1.57 तक कम हो जाती है।

इसके बाद, टीएस के साथ एक महिला के डिम्बग्रंथि ऊतक में ग्राफ्टिंग के बाद एक एंट्रल कूप के ग्रैनुलोसा कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोम की संख्या का विश्लेषण किया जाता है। कुल मिलाकर, क्रोमोसोम एक्स के लिए 191 सिग्नल और क्रोमोसोम 18 के लिए 199 सिग्नल गिने गए थे। ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की संख्या क्रोमोसोम 18 के लिए संकेतों की कुल संख्या को क्रोमोसोम 18 प्रति ग्रैनुलोसा सेल (199/1.57 = 127 ग्रैनुलोसा कोशिकाओं) की संख्या से विभाजित करके निर्धारित की जा सकती है। अंत में, 45,एक्स ग्रैनुलोसा कोशिकाओं का प्रतिशत क्रोमोसोम 18 और क्रोमोसोम एक्स संकेतों में अंतर को ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की संख्या के साथ विभाजित करके निर्धारित किया जा सकता है (यानी, [199-191]/127 x 100 = 6% ग्रैनुलोसा कोशिकाएं 45,एक्स हैं, और इनमें से 94% कोशिकाएं 46, एक्सएक्स हैं)।

यह उल्लेखनीय है कि, 47,XXX सेल लाइन वाले रोगियों में, केवल 47,XXX कैरियोटाइप के साथ ग्रैनुलोसा कोशिकाओं का न्यूनतम प्रतिशत निर्धारित करना संभव है, क्योंकि 45,X और 47,XXX ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के मिश्रण में 46,XX ग्रैनुलोसा कोशिकाओं के समान X गुणसूत्र संकेतों की संख्या होती है।

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Discussion

फिश विश्लेषण पुरुषोंऔर महिलाओं दोनों के लिम्फोसाइटों या ब्यूकल कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन का पता लगाने के लिए एक प्रसिद्ध तकनीक है। कई अध्ययनों ने एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाले पुरुषों के युग्मकों पर फिश का वर्णन किया है, लेकिन एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से डिम्बग्रंथि कोशिकाओं पर फिश द्वारा प्राप्त विस्तृत जानकारी में अभी भी14 की कमी है। यह लेख यह निर्धारित करने के लिए फिश पर आधारित नए तरीकों को प्रस्तुत करता है कि एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से गैर-ग्राफ्टेड और ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक की डिम्बग्रंथि कोशिकाओं में एन्यूप्लोइडी मौजूद है या नहीं।

गैर-ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक में व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि कोशिकाओं के अलगाव के लिए प्रोटोकॉल की मुख्य चुनौती ऊतक के एंजाइमेटिक पाचन में निहित है, जिसके लिए पहले से कुछ अभ्यास की आवश्यकता होती है। पर्याप्त डिम्बग्रंथि कोशिकाओं के सटीक मछली संकेत प्राप्त करने के लिए, एंजाइमेटिक पाचन, इनक्यूबेशन बार और संकेतित तापमान के बारे में चरणों का सख्ती से पालन करना महत्वपूर्ण है। प्रोटोकॉल से विचलित होने से प्रक्रिया के दौरान डिम्बग्रंथि कोशिकाओं का पर्याप्त नुकसान हो सकता है, और यह विशेष रूप से उन रोगियों में टाला जाना चाहिए जिनके पास पहले से ही कम डिम्बग्रंथि रिजर्व है। इस विधि में एक और महत्वपूर्ण कदम यह है कि शुद्ध प्राइमर्डियल फॉलिकल्स को ट्रिप्सिन के साथ इलाज किया जाए ताकि अंडाणुओं और ग्रैनुलोसा सेल द्रव्यमान को क्लंपिंग से रोका जा सके, जो व्यक्तिगत कोशिकाओं के विश्लेषण को रोकता है। ट्रिप्सिन के साथ उपचार के बिना, व्यक्तिगत ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की संख्या जिन्हें फिश द्वारा विश्वसनीय रूप से विश्लेषण किया जा सकता है, गंभीर रूप से कम हो जाती है।

लंबी अवधि के ग्राफ्टिंग के बाद पुनर्प्राप्त डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक पर फिश विश्लेषण के लिए एक अलग तकनीक की आवश्यकता होती है, क्योंकि केवल छोटे रोम एंजाइमेटिक पाचन के लिए पर्याप्त रूप से अतिसंवेदनशील पाए गए थे जो व्यक्तिगत डिम्बग्रंथि कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक के ऑटोट्रांसप्लांटेशन के समान, हाइपोक्सिया और पोषक तत्वों की कमी के कारण ग्राफ्टिंग के बाद कई रोम खो जाते हैं, इससे पहले कि ग्राफ्ट को मेजबान20 द्वारा पर्याप्त रूप से पुन: संवहनी किया जाता है। इसलिए ग्राफ्टिंग के बाद रोम की संख्या ग्राफ्टिंग से पहले की तुलना में काफी कम होने की उम्मीद है। हिस्टोलॉजिकल वर्गों के लिए उपयोग की जाने वाली इस फिश तकनीक के लिए, इष्टतम फिश सिग्नल प्राप्त करने के लिए केवल 4% फॉर्मलाडेहाइड में ग्राफ्टेड ऊतक को ठीक करना महत्वपूर्ण है। बौइन के फिक्सेटिव में डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक का निर्धारण नियमित रूप से प्रयोगशाला में उपयोग किया जाता है, और जबकि यह मानक एचई धुंधला होने के साथ संयुक्त होने पर उत्कृष्ट परिणाम देता है, फिश से पहले बौइन के साथ ऊतक को ठीक करने से कमजोर और धुंधले फ्लोरोसेंट संकेत होते हैं जिनकी व्याख्या करना मुश्किल होता है।

यद्यपि यह प्रोटोकॉल डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने में सफल साबित हुआ है, फिर भी इसकी कुछ सीमाएं हैं। एक सीमा यह है कि इन विधियों का उपयोग केवल संख्यात्मक विचलन के साथ महिलाओं की डिम्बग्रंथि कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। दोहराव वाले अनुक्रम21 पर निर्देशित जांच का उपयोग करके संख्यात्मक विचलन का पता लगाया जा सकता है। ये जांच सेंट्रोमियर क्षेत्र में कई दोहराए जाने वाले आधार जोड़ी अनुक्रमों को संकरित करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप मजबूत संकरण संकेत होते हैं। इसके विपरीत, संरचनात्मक विचलन का पता केवल अद्वितीय एकल अनुक्रमों के खिलाफ जांच का उपयोग करके लगाया जा सकता है। ये जांच उन अनुक्रमों को संकरण करती हैं जो केवल अगुणित जीनोम में एक बार होती हैं, जिसके परिणामस्वरूप संख्यात्मक विचलन की तुलना में काफी कम तीव्र फिश सिग्नल होता है। इन अपेक्षाकृत कमजोर फिश संकेतों के कारण, संरचनात्मक विचलन के साथ महिलाओं में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को ठीक से निर्धारित करना मुश्किल है।

दूसरे, अर्धसूत्रीविभाजन I22 के प्रोफ़ेज़ में चार बहन क्रोमैटिड की निकटता के कारण, गैर-ग्राफ्टेड ऊतक में छोटे रोम के अंडाणुओं के मछली संकेतों का विश्लेषण करना मुश्किल है। अंडाणुओं में केवल एक मजबूत संकरण संकेत मौजूद होगा, और इसलिए एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए अंडाणुओं में संकेतों की संख्या की गणना करना संभव नहीं है। इसके बजाय, इन कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए क्रोमोसोम एक्स और 18 फिश संकेतों के सतह अनुपात का उपयोग किया जाना चाहिए। यह केवल तभी विश्वसनीय रूप से निर्धारित किया जा सकता है जब अंडाणुओं में मछली के संकेत स्पष्ट रूप से मौजूद हों।

इसके अलावा, ग्राफ्टेड ऊतक पर फिश का उपयोग केवल द्वितीयक और सूक्ष्म रोम से ग्रैनुलोसा कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, क्योंकि ग्राफ्टेड ऊतक के हिस्टोलॉजिकल वर्गों में छोटे रोम में केवल कुछ ग्रैनुलोसा कोशिकाएं होती हैं जिनका ठीक से विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, अंडाणुओं के बड़े व्यास के कारण इस विधि का उपयोग करके अंडाणुओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री को सटीक रूप से निर्धारित नहीं किया जा सकता है।

अंत में, पुरुष युग्मकों की तुलना में महिला युग्मकों को प्राप्त करना चुनौतीपूर्ण रहता है क्योंकि डिम्बग्रंथि कोशिकाओं या डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक को प्राप्त करने के लिए आक्रामक सर्जरी की आवश्यकता होती है। इसलिए, इन विधियों को एक शोध सेटिंग में लागू किए जाने की सबसे अधिक संभावना है।

अंत में, एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से गैर-ग्राफ्टेड और ग्राफ्टेड डिम्बग्रंथि कॉर्टेक्स ऊतक की डिम्बग्रंथि कोशिकाओं का फिश विश्लेषण इस विशिष्ट समूह में डिम्बग्रंथि कोशिकाओं की एक्स क्रोमोसोमल सामग्री में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक अनूठी और उपयोगी तकनीक है। इन तकनीकों से पता चलता है कि एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं से डिम्बग्रंथि प्रांतस्था ऊतक का क्रायोप्रिजर्वेशन संभव है, और यह कि क्रायोसंरक्षित प्राइमर्डियल फॉलिकल्स माध्यमिक और सूक्ष्म रोम तक बढ़ने में सक्षम हैं। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि दोनों तरीकों का उद्देश्य एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं में भविष्य के शोध को सुविधाजनक बनाना है, और नैदानिक अभ्यास में एक्स क्रोमोसोमल विपथन वाली महिलाओं के प्रजनन परिणामों को स्क्रीन करने के लिए नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने मार्जो वैन ब्रेकल, डोमिनिक स्मीट्स, गिलाउम वैन डी ज़ांडे, पेट्रीसिया वैन क्लीफ और मिलान इंतेजार को उनकी विशेषज्ञता और तकनीकी सहायता के लिए स्वीकार किया। फंडिंग स्रोत: मर्क सेरोनो (ए 16-1395), गुडलाइफ, और फेरिंग।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Biosolve BV 0001070602BS
Centrifuge 1200 Hettich Universal 4140
Collagenase I Sigma 131470
Coverslip VWR 0631-0146
DAPI Vector H-1200
DNase I Roche 10104159001
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Lonza BE17-513Q
EDTA Merck 108421
Eosin-Y Sigma 1159350100
Ethanol EMSURE 1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS) Life technology 10100147
Fluorescence microscope for sections DM4 B Leica Microsystems 
Fluorescence microscope scope A1 Zeiss AXIO
Fluorescent labeled probes for dissociated cells Abbott Diagnostics CEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluorescent labeled probes for tissue sections Abbott Diagnostics CEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
Formaldehyde Sigma 252549
Glucose Merck 108337
Glue (Fixogum) Leica Microsystems LK071A
Hematoxylin Sigma 1159380025
Hybridization buffer Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001
Hybridization Station  Dako S2451
Hydrochloric acid Merck 1003171000
Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) Leica Biosystems
Image processing software on paraffine sections  Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunohitochemistry microscope slides Dako K802021-2
L15 Lonza 12-700Q
Liberase DH Roche 05 401 151 001
Light microscope Zeiss West Germany
Magnesium sulphate Merck A335586
Methanol Honeywell 14262-1L
Mounting medium Vectashield, Vector H-1000
Nonidet P40 Sigma 7385-1L
Paraffin Poth Hile 2712.20.10
Pepsin Sigma P7000-25G
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Gibco 11530546
Plastic pipette CooperSurgical 7-72-4075/1
Potassium chloride  Merck 1049361000
Proteinase K Qiagen 19131
Rotation microtome HM 355S Thermo sceintific
Scalpel Dahlhausen 11.000.00.515
Slide for FISH on dissociated cells Thermo scientific J1810AM1JZ
Sodium bicarbonate Sigma 55761-500G
Standard Sodium Citrate (SSC) Fisher Scientific, Invitrogen 10515203
Stereomicroscope IX 70 Olympus
Target Retrieval Solution    Dako GV80511-2
Trypsin Sigma T4799
Tween-20 ThermoFisher 85113
Xylene BOOM 760518191000

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References

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जेनेटिक्स अंक 194
<em>सीटू</em> संकरण में प्रतिदीप्ति का उपयोग करके डिम्बग्रंथि कोशिकाओं में एक्स क्रोमोसोमल विपथन की खोज
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Nadesapillai, S., van der Velden,… More

Nadesapillai, S., van der Velden, J., Braat, D., Fleischer, K., Peek, R. Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (194), e64734, doi:10.3791/64734 (2023).

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