Summary
Denne artikkelen presenterer to metoder basert på fluorescens in situ hybridisering for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik.
Abstract
Millioner av mennesker over hele verden håndterer problemer knyttet til fruktbarhet. Redusert fruktbarhet, eller til og med infertilitet, kan skyldes mange forskjellige årsaker, inkludert genetiske lidelser, hvorav kromosomale abnormiteter er de vanligste. Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en velkjent og hyppig brukt metode for å oppdage kromosomavvik hos mennesker. FISH brukes hovedsakelig til analyse av kromosomale abnormiteter i spermatozoa hos menn med numeriske eller strukturelle kromosomavvik. Videre er denne teknikken også ofte brukt hos kvinner for å oppdage X-kromosomale avvik som er kjent for å forårsake ovarial dysgenese. Det mangler imidlertid fortsatt informasjon om X-kromosominnholdet i ovarieceller fra hunner med X-kromosomavvik i lymfocytter og/eller bukkalceller.
Målet med denne studien er å fremme grunnforskning angående X-kromosomavvik hos kvinner, ved å presentere to metoder basert på FISH for å identifisere X-kromosominnholdet i eggstokkceller. Først beskrives en metode for å bestemme X-kromosominnholdet i isolerte eggstokkceller (oocytter, granulosaceller og stromale celler) i ikke-podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik. Den andre metoden er rettet mot å evaluere effekten av kromosomale avvik på follikulogenese ved å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller av nydannede sekundære og antralfollikler i eggstokkvev, fra kvinner med X-kromosomale avvik etter langvarig podning i immunkompromitterte mus. Begge metodene kan være nyttige i fremtidig forskning for å få innsikt i reproduksjonspotensialet til kvinner med X-kromosomavvik.
Introduction
Infertilitet er et helseproblem av det mannlige eller kvinnelige reproduktive systemet, som påvirker omtrent 186 millioner individer i reproduktiv alder over hele verden1. I minst 35% av infertile par er infertilitet forårsaket av en lidelse i det kvinnelige reproduktivesystemet. Det er mange faktorer som kan forårsake kvinnelig infertilitet, for eksempel genetiske faktorer, kjønnsorganer, endokrin dysfunksjon, inflammatoriske sykdommer og iatrogen behandling3.
Genetiske abnormiteter er tilstede hos ca 10% av infertile kvinner 4,5. Av alle genetiske abnormiteter er X-kromosomavvik den vanligste årsaken til ovarial dysgenese2. Flere studier har rapportert at X-kromosomavvik hos kvinner med Turners syndrom (TS) eller Triple X-syndrom er assosiert med for tidlig eggstokksvikt på grunn av et akselerert tap av kimceller eller nedsatt oogenese 6,7,8.
Aberrasjoner av X-kromosomet kan deles inn i: 1) numeriske avvik, hvor antall X-kromosomer er forskjellige, men X-kromosomene er intakte; og 2) strukturelle avvik, der X-kromosomet har fått eller mistet genetisk materiale 3,9. Numeriske avvik i X-kromosomet er vanligere enn strukturelle avvik og skyldes ofte spontane feil under celledeling 3,9. Når en slik feil oppstår under meiose, kan det føre til aneuploide gameter og til slutt til avkom med kromosomale avvik i alle celler. Når kromosomdefekter oppstår i somatiske celler som følge av feil som oppstår under mitose i de tidlige stadier av ontogenese, kan det føre til mosaikk. Hos disse individene er både celler med normalt X-kromosominnhold og celler med X-kromosomavvik til stede.
På 1980-tallet ble en cytogenetisk teknikk kalt fluorescens in situ hybridisering (FISH) utviklet for å visualisere og lokalisere spesifikke nukleinsyresekvenser på metafase- og interfasekromosomer10,11. Denne teknikken bruker fluorescerende merkede DNA-prober for å binde seg til en bestemt sekvens i kromosomet, som deretter kan visualiseres ved hjelp av et fluorescensmikroskop.
I dag er FISH mye brukt som et klinisk diagnostisk verktøy og regnes som gullstandarden for å oppdage kromosomavvik10. Innen reproduksjonsmedisin har FISH-analyse på sædceller blitt brukt for å få innsikt i X-kromosominnholdet i spermatozoer hos menn med numeriske eller strukturelle kromosomavvik i somatiske celler12,13,14. Disse studiene viste at menn med kromosomavvik var mer sannsynlig å ha en høyere frekvens av aneuploide spermatozoer tilstede i sæden sammenlignet med menn med normale karyotyper12,13,14.
I motsetning til spermatozoer er svært lite kjent om X-kromosominnholdet i eggstokkceller (inkludert oocytter, granulosa / theca-celler og stromale celler) hos individer med kromosomavvik, samt de mulige konsekvensene av aneuploidi av disse cellene på deres reproduktive potensial. En viktig årsak til den knappe informasjonen om karyotypen av eggstokkceller sammenlignet med spermatozoa er det faktum at kvinner må gjennomgå en invasiv prosedyre som en follikelpunktering eller kirurgi for å oppnå oocytter eller eggstokkvev. Kvinnelige kjønnsceller er derfor vanskelig å få tak i for forskningsformål.
For tiden utføres en observasjonsintervensjonsstudie i Nederland for å undersøke effekten av kryopreservering av eggstokkvev hos unge kvinner med TS15. Ett fragment av ovariecortexvevet til pasienten var tilgjengelig for å identifisere X-kromosominnholdet i eggstokkcellene16,17. Som en del av studien ble det utviklet en ny metode basert på FISH av dissociert ovariecortexvev for å avgjøre om kromosomale avvik er tilstede i eggstokkceller hos kvinner som bærer en kromosomavvik i ikke-ovarie somatiske celler, som lymfocytter eller bukkalceller. I tillegg ble effekten av aneuploidi i eggstokkceller på follikulogenese også bestemt. For dette formål ble en etablert FISH-protokoll modifisert som muliggjør analyse av histologiske seksjoner av ovariecortexvev etter kunstig indusert follikulogenese under langvarig xenotransplantasjon hos immunkompromitterte mus. I denne studien presenterer vi to metoder basert på FISH for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev hos kvinner med X-kromosomavvik, med sikte på å forbedre grunnleggende vitenskap om dette emnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
TurnerFertility-studieprotokollen er godkjent av Central Committee on Research Involving Human Subjects (NL57738.000.16). I denne studien ble ovariecortexvevet hos 93 kvinner med TS oppnådd. Materialer som krever sikkerhetstiltak er listet opp i tabell 1.
Tabell 1: Sikkerhetsregler.
| Materiale | Fare | ||
| Eddiksyre | Alvorlige hudforbrenninger og irritasjon i luftveiene | ||
| Kollagenase | Irriterende for øyne, luftveier og hud | ||
| DAPI | Irriterende for øyne, luftveier og hud | ||
| DNase I | Irriterende for øyne, luftveier og hud | ||
| Etanol | Svært brannfarlig | ||
| Formaldehyd | Giftig etter innånding, inntak og hudkontakt | ||
| Formamid (i fluorescensprober) |
Kan skade det ufødte barnet | ||
| Liberase | Irriterende for øyne, luftveier og hud | ||
| Metanol | Meget brannfarlig, giftig ved innånding, inntak og hudkontakt | ||
| Nonidet P40 | Irriterende for hud eller øyne | ||
| Pepsin | Irriterende for øyne, luftveier og hud | ||
| Proteinase K | Pustevansker etter innånding | ||
| Xylen | Meget brannfarlig, giftig etter innånding og hudkontakt. Unngå kontakt med øynene. | ||
Tabell 1: Materialer som krever sikkerhetstiltak.
1. FISK på isolerte individuelle eggstokkcortexceller
- Dissosiasjon av ovariecortexvev for å oppnå individuelle celler
- Skjær det kryopreserverte/tinte vevet fra eggstokkene i små biter på ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm ved hjelp av en skalpell.
- Fordøy vevsfragmentene enzymatisk i 4 ml forvarmet (37 °C) L15-medium inneholdende 0,1 mg/ml vevsdissosiasjonsenzymblanding, 10 μg/ml DNase I og 1 mg/ml kollagenase I fra C. histolyticum i maksimalt 75 minutter ved 37 °C. Pipett fordøyelsen blandes opp og ned hvert 15. minutt.
- Stopp den enzymatiske fordøyelsen ved å tilsette 4 ml kaldt L15 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS). Vask det dissosierte vevet en gang med 8 ml kaldt L15-medium ved sentrifugering ved 500 x g og resuspender i 500 μL L15 medium uten vortexing for å unngå skade på cellene.
- Overfør cellesuspensjonen som hovedsakelig inneholder individuelle stromale celler og små follikler (oocytter omgitt av et enkelt lag granulosaceller) til en petriskål av plast og undersøk cellesuspensjonen under et stereomikroskop (100x forstørrelse).
- Plukk opp de små folliklene (<50 μm) manuelt ved hjelp av en 75 μm plastpipette og overfør folliklene til en dråpe L15 medium tilsatt 10% FBS ved 4 ° C for å forhindre aggregering av follikler. Utfør follikelopptak i maksimalt 30 minutter. For å forbedre follikkelcellespredningen før FISH-analysen, overfør de rensede folliklene til en oppløsning av 0,06 % trypsin, 1 mg/ml etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og 1 mg/ml glukose og inkuber i 20 minutter ved 37 °C.
- Hent stromale celler fra eggstokkene fra cortex-cellesuspensjonen ved hjelp av en 75 μm plastpipette, og vær spesielt forsiktig for å unngå forurensning med små follikler.
- FISH-analyse av individuelle eggstokkceller
- Overfør de behandlede eggstokkfolliklene (anbefalt n = 5-20) med trypsin/EDTA/glukose eller stromale celler (n > 1000) til dråper på 5 μL 0,15 mM KCl/15 μL Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) på et lysbilde og inkuber i 20 minutter ved 37 °C.
- Tørk og prefikser lysbildene i 300 μL 0,05 mM KCl / 7,5% eddiksyre / 22,5% metanol i 2 minutter ved romtemperatur (RT). Dekk lysbildene med metanol / eddiksyre (3: 1) i 2 min ved RT for å fullføre fiksering.
- Lag 20x standard natriumcitrat (SSC) ved å tilsette 876 g natriumklorid og 441 g tri-natriumcitratdihydrat i 5 liter destillert vann. Deretter tilsettes 100 ml av 20x SSC til 900 ml demineralisert (demi) vann for å oppnå 2x SSC. Vask prøven i 2x SSC ved 73 °C, dekk den med 100 μL 2% proteinase K, og forsegl den med et deksel. Inkuber lysbildene i 10 minutter ved 37 °C i hybridiseringsstasjonen.
- Fjern dekselet og vask lysbildene i 5 min i DPBS ved RT. Fikser prøven i 5 min med 1% formaldehyd ved RT. På dette stadiet er materialet ennå ikke helt festet til glasslysbildene og bør derfor ikke plasseres på en risteplattform.
- Vask lysbildene i 5 min i DPBS ved RT, etterfulgt av dehydrering i påfølgende 70%, 80%, 90% og 100% etanol i 2 minutter hver. Lufttørk den dehydrerte prøven og hybridiser den med fluorescerende merkede sonder.
- Velg en sentromerspesifikk sonde for kromosom X og en annen kromosomspesifikk sentromerisk sonde som en kontroll for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller. I dette tilfellet brukes sentromerspesifikke sonder for kromosom X (CEP X [DXZ1]) direkte merket med fluorokrom SpectrumGreen og kromosom 18 (CEP 18 [D18Z1]) direkte merket med fluorokrom SpectrumOrange.
- Tilsett 1 μL CEP X, 1 μL CEP 18 og 18 μL hybridiseringsbufferen til prøven og forsegle med en dekselslipp som limes til lysbildene for å forhindre fordampning av sonden under hybridisering. Overfør lysbildene til hybridiseringsstasjonen for denaturering ved 73 °C i 3 minutter, etterfulgt av hybridisering under en nattlig inkubasjon ved 37 °C.
- Fjern dekselet og gjenværende lim fra lysbildet etter hybridisering. Vask lysbildene i 0,4x SSC/0,3% Tween-20 ved 72 °C i 2 min, etterfulgt av inkubasjon i 1 min i 2x SSC/0,1% Tween-20 ved RT.
- Dehydrer lysbildene ved påfølgende 2 minutters inkubasjoner i 70%, 80%, 90% og 100% etanol og lufttørk i mørket. Dekk lysbildene med et monteringsmedium som inneholder 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). Oppbevares ved -20 °C i minst 10 minutter før analyse ved fluorescensmikroskopi.
- Imaging
- Undersøk signalet (e) for X-kromosomet med et fluorescensmikroskop koblet til et bildebehandlingsprogram.
- Velg først fluorokrom DAPI.
- Skaff deg et bilde ved å velge Ny celle > Live > Capture ved 630x forstørrelse. Et nytt vindu med terskelen vises. Sett den blå linjen for terskelverdien til 0 for å minimere bakgrunnen og den røde linjen til maksimum (255) for å gjøre signalene lysere. Klikk på Godta.
- Et nytt vindu med forbedring vises med et forslag til mørkere/lysere (12), radius (3) og dybde (1). Bruk de foreslåtte verdiene eller juster dem hvis de ikke er fornøyd.
- For det andre, velg fluorokrom SpectrumOrange og klikk på Capture.
- Sett den blå linjen for terskelverdien til 0 for å minimere bakgrunnen og den røde linjen til maksimum (255) for å gjøre signalene lysere. Klikk på Godta.
- Vinduet med forbedring vises med et forslag til mørkere/lysere (-11), radius (2,7) og dybde (0,6). Bruk de foreslåtte verdiene eller juster dem hvis de ikke er fornøyd.
- Til slutt velger du fluorokrom SpectrumGreen og klikker på Capture.
- Sett den blå linjen for terskelverdien til 0 for å minimere bakgrunnen og den røde linjen til maksimum (255) for å gjøre signalene lysere. Klikk på Godta.
- Vinduet med forbedring vises med et forslag til mørkere/lysere (0), radius (3) og dybde (0). Bruk de foreslåtte verdiene eller juster den hvis den ikke er fornøyd. Lagre bildet i en nyopprettet fil.
MERK: Somatiske celler ble bare evaluert når to signaler fra kontrollkromosom 18 var synlige. I de fleste oocytter kunne bare ett signal detekteres for hvert kromosom.
- Velg først fluorokrom DAPI.
- Oppbevar lysbildene i mørket ved 4 °C etter analyse for å unngå tap av signaler.
- Undersøk signalet (e) for X-kromosomet med et fluorescensmikroskop koblet til et bildebehandlingsprogram.
2. FISK på parafinseksjoner av podet eggstokkcortexvev
MERK: Et fragment av kryopreservert/tint ovariecortexvev fra 18 hunner med TS ble xenografert i alvorlige kombinerte immundefekte (SCID) mus i 5 måneder. Prosedyren for xenografting er beskrevet tidligere og ble utført ved Université Catholique de Louvain (Brussel, Belgia) etter de lokale retningslinjene fra Dyreforskningskomiteen angående dyrevelferd (referanse 2014/UCL/MD/007)18,19.
- Velge seksjoner av xenografted ovarial cortex vev som inneholder follikler
- Fikser xenografted ovarial cortex vev i 4% formaldehyd og legg vevet i parafin. Trim blokkene med en skalpell for å fjerne ekstra parafin og kutt parafinblokken til 4 μm tykkelse på en rotasjonsmikrotom.
- Velg hver syvende del av parafinbåndet for farging av hematoksylin og eosin (HE) for å bestemme hvilke seksjoner som inneholder follikler. Sett seksjonen i et vannbad ved 40-45 °C og monter den på immunhistokjemimikroskoplysbilder.
- Deparaffinisering og HE-farging
- Sett skliene på en komfyr i 10 min ved 60 °C, og senk deretter lysbildene i 100 % xylen i 5 minutter. Det er ikke nødvendig å plassere lysbildene direkte på komfyren. Hydrater seksjonene i 15 s i 100% etanol, etterfulgt av 2 x 15 s i 96% etanol. Skyll skliene i vann fra springen i 2 min.
- Beis lysbildene i hematoksylin i 10 min og skyll deretter lysbildene kort i vann fra springen. Senk lysbildene kort i en bikarbonatløsning (100 g magnesiumsulfat og 10 g natriumbikarbonat i 5 liter destillert vann). Skyll skliene i vann fra springen i 5 min.
- Motflekk lysbildene med eosin i 4 min og dehydrer lysbildene tre ganger med 100% etanol, etterfulgt av xylen. Dekk til HE-flekkene på lysbildene og evaluer HE-seksjonene under et lysmikroskop for å velge seksjonene med follikler (100x forstørrelse).
- Forbehandling og hybridisering av parafinsnitt for DNA FISH
- Velg nye seksjoner som lå før eller etter delen som inneholdt follikler fra parafinbåndet. Monter en seksjon på et glassglass. Tørk parafinseksjonene i minst 45 minutter på komfyr ved 56 °C. Det er ikke nødvendig å plassere lysbildene direkte på komfyren.
- Deparaffiniser seksjonene i xylen i 10 minutter. Dypp lysbildene i 99,5% etanol og skyll dem i 5 minutter i vann fra springen. Forbehandle lysbildene med målopphentingsløsning (lav pH) i 10 minutter ved 96 °C. Etter avkjøling, skyll lysbildene i destillert vann.
- Behandle lysbildene i 5 min med 0,01 M saltsyre, etterfulgt av pepsinfordøyelse (200 U/ml) i 15 minutter ved 37 °C. Skyll lysbildene igjen i 0,01 M saltsyre og deretter i PBS.
- Fikser lysbildene i 1% formaldehyd/PBS i 5 min. Skyll lysbildene kort i PBS, og deretter igjen i demi vann. Dehydrer lysbildene i 99,5% etanol og la dem lufttørke.
- Velg en sentromerspesifikk sonde for kromosom X og en annen kromosomspesifikk sentromerisk sonde som en kontroll for å bestemme X-kromosominnholdet i granulosaceller. Her brukes kromosom 18 som kontroll.
- Påfør 5 μL sonde CEP 18 (D18Z1) direkte merket med fluorokrom SpectrumGreen og sonde CEP X (DXZ1) direkte merket med fluorokrom SpectrumRed på de ferdigbehandlede lysbildene. Påfør et deksel og forsegl området med fotolim. Plasser lysbildene i en hybridisator for denaturering ved 80 °C i 10 minutter og hybridisering over natten ved 37 °C.
- Neste dag, skyll lysbildene i 5 min i 2x SSC ved 42 ° C, etterfulgt av en 2 min og en 1 min skyll i 0,3% Nonidet P40 ved 73 ° C. Oppdater 2x SSC og skyll lysbildene igjen i 5 min ved romtemperatur. Dekk kyvetten slik at seksjonene holdes i mørket.
- Skyll lysbildene kort i destillert vann. Dehydrer lysbildene i 99,5% etanol og la dem lufttørke igjen. Til slutt monterer du lysbildene med en løsning som inneholder DAPI og monteringsmedium.
- Imaging
- Analyser resultatene under et fluorescensmikroskop ved 630x forstørrelse. Åpne bildebehandlingsprogramvaren på datamaskinen. Velg FISH som profil.
- Sjekk om DAPI-utslippet er satt til 431 nm og eksitasjonen ved 359 nm, Texas rød utslipp ved 613 nm og eksitasjon ved 595 nm, og FITC-utslipp ved 519 nm og eksitasjon ved 495 nm.
- Skaff deg et bilde ved å velge Live > Capture Single Image. Optimaliser bildekvaliteten ved å justere eksponeringen og forsterkningen ved å flytte skyvekontrollen for eksponering og glidebryteren for forsterkning i Bilde-menyen til venstre (f.eks. eksponering: 212 ms og forsterkning: 7,9). Den nødvendige eksponeringen og forsterkningen kan variere per bilde. Vær oppmerksom på endringene under denne prosessen for å få et optimalisert bilde. Lagre bildet i en nyopprettet fil.
- Oppbevar lysbildene i mørket ved 4 °C etter analyse for å unngå tap av signaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FISH på isolerte eggstokkceller før poding
Kryopreservert ovariecortexvev fra kvinner med 45,X/46,XX (pasient A) eller 45,X/46,XX/47,XXX (pasient B) TS ble brukt for å illustrere resultatene ved hjelp av denne protokollen. Hos pasient A hadde 50 % av lymfocyttene en 45,X karyotype og 50 % hadde 46,XX. Hos pasient B var 38 % av lymfocyttene 45,X, 28 % var 46,XX og 34 % var 47,XXX. Sentromerspesifikke sonder for kromosom X (grønn) og kromosom 18 som kontroll (rød) ble brukt til å bestemme X-kromosominnholdet i individuelle granulosaceller, stromale celler og oocytter isolert fra ovariecortexvev hos pasienter med Tourettes syndrom uten forutgående xenotransplantasjon (figur 1).
Figur 1 Fish-analyse av isolerte ovarieceller fra ovariecortexvev før poding. Oocytter (pilhoder) og granulosaceller fra enkle primordiale follikler (A,B) og (C,D) de omkringliggende stromale cellene ble analysert med fluorescerende spesifikke prober for kromosom X (grønne signaler) og kontrollkromosom 18 (røde signaler). Hvite piler indikerer 45,X cellelinjer, gule piler indikerer 46,XX cellelinjer, og røde piler indikerer 47,XXX cellelinjer. Ikke alle fluorescerende signaler er i samme fokusplan. Barer representerer 10 μm. Forstørrelsen av FISH-signaler ble satt til 630x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Forskjellene mellom individuelle primordialfollikler som ble behandlet med og uten trypsin før FISH er vist i figur 2. Ved å bruke trypsin før FISH-analysen ble granulosacellemassen og oocytter mindre klumpet, noe som gjorde det mulig å analysere X-kromosominnholdet i individuelle granulosaceller og oocytter. DNA fra oocytter kan lett skilles fra de omkringliggende granulosacellene på grunn av uregelmessig form, størrelse og diffust utseende av DNA fra oocytter. I tillegg observeres bare ett sterkt FISH-signal for hvert kromosom i oocyttene til små follikler, på grunn av nærheten til de fire søsterkromatidene i disse cellene. X-kromosominnholdet i oocytter kan bestemmes ved å bruke overflateforholdet mellom FISH-signalet for kromosom X og kromosom 18.
Figur 2: Små follikler behandlet med og uten trypsin før FISH. (A) Enzymatisk fordøyelse av ovariecortexvev resulterte i en suspensjon av stort sett dissosierte celler, men forlot primordialfolliklene, bestående av en intakt oocytt omgitt av et enkelt lag granulosaceller (pilhoder i panel A). (B) Små follikler ble håndplukket fra cellesuspensjonen, men ga vanskeligheter med å tolke signaler etter FISH på grunn av klumping av granulosacellene (C). (D,E) Ytterligere fordøyelse av de isolerte folliklene med trypsin før FISH resulterte i at individuelle granulosaceller trakk seg sammen til en sfærisk morfologi på overflaten av folliklene og var mer sannsynlig å dissosiere fra follikkelen for å bli tilgjengelig for FISH-analyse. Oocytt-avledede FISH-signaler er indikert med piler. Svarte søyler representerer 100 μm og hvite søyler representerer 10 μm. Forstørrelsen av FISH-signaler ble satt til 630x. Panel D er gjengitt med tillatelse fra Peek et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
FISH-analyse av granulosaceller på parafinsnitt av podet ovariecortexvev
Sekundære og antralfollikler ble funnet å være mindre utsatt for enzymatisk fordøyelse, noe som gjør den tidligere beskrevne metoden for vevsdissosiasjon for å oppnå individuelle eggstokkceller som ikke er egnet for dyrking av follikler funnet i eggstokkvevet etter langvarig xenografting. Derfor ble FISH-protokollen optimalisert ved hjelp av 4 μm histologiske snitt for å bestemme X-kromosominnholdet i granulosaceller i sekundære og antralfollikler i ovariecortexvev etter poding (figur 3). I denne innstillingen er det usannsynlig at FISH-signalet til enten X-kromosomet eller kontrollkromosomet i oocytter vil bli fanget i en enkelt 4 μm seksjon, på grunn av den store diameteren av oocytter i de voksende folliklene.
Figur 3 Histologisk og FISH-farging av vevssnitt fra ovariecortex etter xenotransplantasjon. (A,B) Farging av hematoksylin/eosin viste morfologisk normale sekundær- og antralfollikler i ovariecortexvev etter 5 måneders xenotransplantasjon. (C,D) X-kromosominnholdet i granulosaceller i disse folliklene ble bestemt ved FISH-analyse. I denne figuren er kromosom X vist i rødt og kromosom 18 i grønt. Baren i panel A representerer 50 μm, linjen i panel B representerer 20 μm, og stolpene i panelene C og D representerer 10 μm. Forstørrelsen av FISH-signaler ble satt til 630x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Som et første skritt ble eksperimenter med forskjellige fikseringsteknikker i vevene utført for å bestemme hvilken metode som resulterer i de beste FISH-signalene. FISH-analyse ble utført på podet vev som var fiksert i både Bouins løsning og deretter nedsenket i 4% formaldehyd, og på podet vev som kun var fiksert i 4% formaldehyd. Transplantert vev som først ble fiksert i Bouins viste en grønn dis på bildet, noe som gjorde det vanskelig å telle antall FISH-signaler nøyaktig (figur 4).
Figur 4: Podet vev fra ovariecortex fiksert i Bouins løsning og kun formaldehyd. (A) Fiksering av podet ovariecortexvev i Bouins løsning resulterte i uskarpe og stort sett skjulte fluorescerende signaler i follikulære celler på grunn av en grønn dis. (B) Ovariecortexvev som var fiksert i formaldehyd ga bare gode fluorescerende signaler som var enkle å tolke. Barer representerer 10 μm. Forstørrelsen av FISH-signaler ble satt til 630x. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å bestemme X-kromosominnholdet i granulosaceller i follikler i histologiske seksjoner, er det ikke mulig å bare telle FISH-signalene til granulosaceller. En del av kromosomene til en individuell granulosacelle kan gå tapt i en bestemt histologisk seksjon på grunn av seksjonering av vevet. Derfor er det nødvendig å først bestemme prosentandelen av FISH-signaler som går tapt på grunn av seksjonering før man til slutt bestemmer tapet av X-kromosomalt innhold i granulosacellepopulasjonen på grunn av aneuploidi i nydannede sekundære og antralfollikler etter poding av vevet.
Prosentandelen tapte FISH-signaler på grunn av seksjonering kan beregnes ved å bestemme antall FISH-signaler per granulosa-celle i det ikke-aneuploide kontrollkromosom 18. Det forventes at samme prosentandel av X-kromosomet går tapt på grunn av seksjonering. Enhver ytterligere reduksjon i antall X-kromosom FISH-signaler i granulosacellepopulasjonen skyldes aneuploidi. Bruk av FISH-signaler fra et kontrollkromosom for å bestemme X-kromosomtap på grunn av aneuploidi krever imidlertid deteksjonsfølsomheten til FISH-signalene til X-kromosomet og kontrollkromosomet å være svært lik. Deteksjonssensitiviteten til begge FISH-sondene i granulosaceller fra voksende follikler i histologiske snitt av ikke-aneuploide 46,XX-individer ble derfor bestemt. Når forholdet mellom kromosom X/kontrollkromosom FISH-signaler er nær 1, kan det antas at deteksjonsfølsomheten til begge probene faktisk er svært lik, og at FISH-probene dermed kan brukes til å bestemme nivået av aneuploidi i granulosacellepopulasjonen av voksende follikler i histologiske seksjoner av ovarievev etter xenotransplantasjon.
Eksempel
Ved analyse av antall kromosom 18 signaler i 130 granulosaceller i en follikkel fra en eggstokk av en 46,XX person, forventes det at 260 signaler er tilstede. I en 4 μm del av disse cellene ble det imidlertid bare observert 204 kromosom 18 signaler. Dette indikerer at 21,5% av signalene går tapt på grunn av seksjonering ((260-204)/260 x 100 = 21,5%). Antall kromosom 18 signaler per granulosacelle reduseres derfor til 204/130 = 1,57 på grunn av snitting.
Deretter analyseres antall X-kromosomer i granulosaceller i en antralfollikkel etter podning i eggstokkvev hos en kvinne med TS. Totalt ble det talt 191 signaler for kromosom X og 199 signaler for kromosom 18. Antall granulosaceller kan bestemmes ved å dele det totale antall signaler for kromosom 18 med antall kromosom 18 signaler per granulosacelle (199/1,57 = 127 granulosaceller). Endelig kan prosentandelen av 45,X granulosa celler bestemmes ved å dele forskjellen i kromosom 18 og kromosom X-signaler med antall granulosa celler (dvs. [199-191] / 127 x 100 = 6% av granulosa cellene er 45, X, og 94% av disse cellene er 46, XX).
Det er bemerkelsesverdig at hos pasienter med en 47,XXX cellelinje er det bare mulig å bestemme minimumsprosenten av granulosa-celler med en 47,XXX karyotype, siden en blanding av 45,X og 47,XXX granulosa celler har samme antall X-kromosomsignaler som 46,XX granulosa celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FISH-analyse er en velkjent teknikk for å påvise X-kromosomavvik i lymfocytter eller bukkalceller hos både hanner og hunner10. Flere studier har beskrevet FISH på kjønnsceller fra hanner med X-kromosomavvik, men detaljert informasjon innhentet av FISH på eggstokkceller fra hunner med X-kromosomavvik mangler fortsatt14. Denne artikkelen presenterer nye metoder basert på FISH for å avgjøre om aneuploidi er tilstede i eggstokkceller av ikke-podet og podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik.
Hovedutfordringen i protokollen for isolering av individuelle eggstokkceller i ikke-podet ovariecortexvev ligger i enzymatisk fordøyelse av vevet, noe som krever litt øvelse på forhånd. For å oppnå nøyaktige FISH-signaler om tilstrekkelige eggstokkceller, er det viktig å følge trinnene angående enzymatisk fordøyelse, inkubasjonstider og angitte temperaturer strengt. Avvik fra protokollen kan føre til et betydelig tap av eggstokkceller under prosessen, og dette bør spesielt unngås hos pasienter som allerede har lav eggstokkreserve. Et annet kritisk skritt i denne metoden er å behandle de rensede primordiale folliklene med trypsin for å forhindre at oocytter og granulosa-cellemassen klumper seg, noe som utelukker analysen av individuelle celler. Uten behandling med trypsin reduseres antallet individuelle granulosaceller som kan analyseres pålitelig av FISH kraftig.
FISH-analysen på ovariecortexvev hentet etter langvarig poding krever en annen teknikk, da bare små follikler ble funnet å være tilstrekkelig utsatt for den enzymatiske fordøyelsen som er nødvendig for å oppnå individuelle eggstokkceller. I tillegg, i likhet med autotransplantasjon av ovariecortexvev, går mange follikler tapt etter podning på grunn av hypoksi og mangel på næringsstoffer før transplantatet er tilstrekkelig revaskularisert av verten20. Antall follikler etter poding forventes derfor å være betydelig lavere enn før poding. For denne FISH-teknikken som brukes for histologiske seksjoner, er det viktig å fiksere det podede vevet i 4% formaldehyd bare for å oppnå optimale FISH-signaler. Fiksering av ovariecortexvev i Bouins fiksativ brukes rutinemessig i laboratoriet, og selv om dette gir gode resultater når det kombineres med standard HE-farging, fører fiksering av vev med Bouins før FISH til svake og uskarpe fluorescerende signaler som er vanskelige å tolke.
Selv om denne protokollen har vist seg å være vellykket for å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller, har den fortsatt noen begrensninger. En begrensning er at disse metodene bare kan brukes til å analysere eggstokkceller hos kvinner med numeriske avvik. Numeriske avvik kan detekteres ved hjelp av sonder rettet mot repeterende sekvenser21. Disse sondene hybridiserer flere repeterende baseparsekvenser i sentromerområdet, noe som resulterer i sterke hybridiseringssignaler. I motsetning til dette kan strukturelle avvik bare oppdages ved å bruke sonder mot unike enkeltsekvenser. Disse sondene hybridiserer til sekvenser som bare forekommer en gang i det haploide genomet, noe som resulterer i et betydelig mindre intenst FISH-signal sammenlignet med numeriske avvik. På grunn av disse relativt svake FISH-signalene er det vanskelig å bestemme X-kromosominnholdet i eggstokkceller hos kvinner med strukturelle avvik.
For det andre er FISH-signaler av oocytter av små follikler i ikke-podet vev vanskelig å analysere, på grunn av nærheten til de fire søsterkromatidene i profasen av meiose I22. Bare ett sterkt hybridiseringssignal vil være tilstede i oocyttene, og derfor er det ikke mulig å bare telle antall signaler i oocyttene for å bestemme X-kromosominnholdet. I stedet bør overflateforholdet mellom kromosom X- og 18 FISH-signaler brukes til å bestemme X-kromosominnholdet i disse cellene. Dette kan bare bestemmes pålitelig hvis FISH-signalene i oocytter er tydelig tilstede.
Videre kan FISH på podet vev bare brukes til å bestemme X-kromosominnholdet i granulosaceller fra sekundære og antrale follikler, da små follikler i histologiske seksjoner av podet vev bare har noen få granulosaceller som kan analyseres riktig. I tillegg kan X-kromosominnholdet i oocytter ikke bestemmes nøyaktig ved hjelp av denne metoden på grunn av den store diameteren av oocytter.
Endelig er det fortsatt utfordrende å skaffe kvinnelige gameter sammenlignet med mannlige gameter fordi invasiv kirurgi er nødvendig for å oppnå eggstokkceller eller eggstokkvev. Derfor er disse metodene mest sannsynlig å bli brukt i en forskningsinnstilling.
Avslutningsvis er FISH-analyse av eggstokkceller i ikke-podet og podet ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik en unik og nyttig teknikk for å få innsikt i X-kromosominnholdet i eggstokkceller i denne spesifikke gruppen. Disse teknikkene viser at kryopreservering av ovariecortexvev fra kvinner med X-kromosomavvik er mulig, og at kryopreserverte primordialfollikler er i stand til å vokse til sekundære og antrale follikler. Det bør imidlertid huskes at begge metodene er ment å lette fremtidig forskning hos kvinner med X-kromosomavvik, og er ikke designet for å brukes som et diagnostisk verktøy for å screene reproduktive utfall hos kvinner med X-kromosomavvik i klinisk praksis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef og Milan Intezar for deres ekspertise og tekniske assistanse. Finansieringskilder: Merck Serono (A16-1395), Goodlife og Ferring.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Biosolve BV | 0001070602BS | |
| Centrifuge 1200 | Hettich Universal | 4140 | |
| Collagenase I | Sigma | 131470 | |
| Coverslip | VWR | 0631-0146 | |
| DAPI | Vector | H-1200 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Lonza | BE17-513Q | |
| EDTA | Merck | 108421 | |
| Eosin-Y | Sigma | 1159350100 | |
| Ethanol | EMSURE | 1009832500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technology | 10100147 | |
| Fluorescence microscope for sections DM4 B | Leica Microsystems | ||
| Fluorescence microscope scope A1 | Zeiss AXIO | ||
| Fluorescent labeled probes for dissociated cells | Abbott Diagnostics | CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818 |
|
| Fluorescent labeled probes for tissue sections | Abbott Diagnostics | CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1) 05J10-028 |
|
| Formaldehyde | Sigma | 252549 | |
| Glucose | Merck | 108337 | |
| Glue (Fixogum) | Leica Microsystems | LK071A | |
| Hematoxylin | Sigma | 1159380025 | |
| Hybridization buffer | Abott Diagnostics | 32-804826/06J67-001 | |
| Hybridization Station | Dako | S2451 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 1003171000 | |
| Image processing software individual ovarian cortex cells (Cytovision 7.7) | Leica Biosystems | ||
| Image processing software on paraffine sections | Leica Application Suitex (3.7.5.24914) | ||
| Immunohitochemistry microscope slides | Dako | K802021-2 | |
| L15 | Lonza | 12-700Q | |
| Liberase DH | Roche | 05 401 151 001 | |
| Light microscope | Zeiss West Germany | ||
| Magnesium sulphate | Merck | A335586 | |
| Methanol | Honeywell | 14262-1L | |
| Mounting medium | Vectashield, Vector | H-1000 | |
| Nonidet P40 | Sigma | 7385-1L | |
| Paraffin | Poth Hile | 2712.20.10 | |
| Pepsin | Sigma | P7000-25G | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 11530546 | |
| Plastic pipette | CooperSurgical | 7-72-4075/1 | |
| Potassium chloride | Merck | 1049361000 | |
| Proteinase K | Qiagen | 19131 | |
| Rotation microtome HM 355S | Thermo sceintific | ||
| Scalpel | Dahlhausen | 11.000.00.515 | |
| Slide for FISH on dissociated cells | Thermo scientific | J1810AM1JZ | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | 55761-500G | |
| Standard Sodium Citrate (SSC) | Fisher Scientific, Invitrogen | 10515203 | |
| Stereomicroscope IX 70 | Olympus | ||
| Target Retrieval Solution | Dako | GV80511-2 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | 85113 | |
| Xylene | BOOM | 760518191000 |
References
- Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
- Yatsenko, S. A., Rajkovic, A.
- Yahaya, T. O., et al. Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review. Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65 (2021).
- Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples. European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).
- Heard, E., Turner, J. Function of the sex chromosomes in mammalian fertility. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675 (2011).
- Reynaud, K., et al. Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype. Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).
- Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. Triple X syndrome: a review of the literature. European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).
- Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads. Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH. Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).
- Hu, L., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine. Biomarker Research. 2 (1), 3 (2014).
- Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility. Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).
- Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications. Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).
- Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).
- Schleedoorn, M., et al. TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome. BMJ Open. 9 (12), 030855 (2019).
- Peek, R., et al. Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells. Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).
- Nadesapillai, S., et al. Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary. Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).
- Dolmans, M. M., et al. Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe. Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).
- Dath, C., et al. Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites. Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).
- Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes. Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).
- Bishop, R. Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance. Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).
- Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. The consequences of asynapsis for mammalian meiosis. Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).
