Summary
מוצג כאן פרוטוקול לקביעת בליעה, טרנסלוקציה והפצה של אימידקלופריד בחיטה בתנאים הידרופוניים באמצעות ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה-טנדם נוזלית (LC-MS-MS). התוצאות הראו כי אימידקלופריד יכול להיספג על ידי חיטה, ואימידקלופריד זוהה הן בשורשי החיטה והן בעלים.
Abstract
ניאוניקוטינואידים, סוג של קוטלי חרקים, נמצאים בשימוש נרחב בגלל דרכי הפעולה החדשות שלהם, פעילות קוטלת חרקים גבוהה וספיגת שורשים חזקה. אימידקלופריד, קוטל החרקים הנפוץ ביותר בעולם, הוא ניאוניקוטינואידים מייצגים מהדור הראשון ומשמש להדברת יבולים, ירקות ועצי פרי. עם יישום כה רחב של אימידקלופריד, השאריות שלו בגידולים משכו בדיקה הולכת וגוברת. במחקר הנוכחי, 15 שתילי חיטה הונחו בתווך תרבית המכיל 0.5 מ"ג / ליטר או 5 מ"ג / ליטר אימידקלופריד עבור הידרוקולטור. התוכן של imidacloprid בשורשי חיטה ועלים נקבע לאחר 1 יום, 2 ימים, ו 3 ימים של hydroculture כדי לחקור את ההגירה וההפצה של imidacloprid בחיטה. התוצאות הראו כי אימידקלופריד זוהה הן בשורשים והן בעלים של צמח החיטה, ותכולת האימידקלופריד בשורשים הייתה גבוהה מזו שבעלים. יתר על כן, ריכוז האימידקלופריד בחיטה עלה ככל שזמן החשיפה גדל. לאחר 3 ימים של חשיפה, השורשים והעלים של החיטה בקבוצת הטיפול של 0.5 מ"ג/ליטר הכילו 4.55 מ"ג/ק"ג ±-1.45 מ"ג/ק"ג ו-1.30 מ"ג/ק"ג ±-0.08 מ"ג/ק"ג אימידקלופריד, בהתאמה, בעוד שהשורשים והעלים של קבוצת הטיפול 5 מ"ג/ל' הכילו 42.5 מ"ג/ק"ג ±-0.62 מ"ג/ק"ג ו-8.71 מ"ג/ק"ג ±-0.14 מ"ג/ק"ג אימידקלופריד, בהתאמה. תוצאות המחקר הנוכחי מאפשרות הבנה טובה יותר של שאריות חומרי הדברה בגידולים חקלאיים ומספקות התייחסות לנתונים להערכת סיכונים סביבתיים של חומרי הדברה.
Introduction
באגרונומיה של ימינו, השימוש בחומרי הדברה חיוני להגדלת תנובת היבול. קוטלי חרקים ניאוניקוטינואידים משנים את האיזון הפוטנציאלי של הממברנה על ידי שליטה בקולטני אצטילכולין ניקוטיניים במערכת העצבים של החרקים, ובכך מעכבים את ההולכה הרגילה של מערכת העצבים המרכזית של החרק, מה שמוביל לשיתוק ומוות של החרקים1. בהשוואה לקוטלי חרקים מסורתיים, לנאוניקוטינואידים יש יתרונות כגון דרכי פעולה חדשניות, פעילות קוטלת חרקים גבוהה וספיגת שורשים חזקה, מה שהופך אותם למוצלחים מאוד בשוק חומרי ההדברה 2,3. היקף המכירות של ניאוניקוטינואידים דווח כ-27% משוק חומרי ההדברה העולמי בשנת 2014. שיעור הגידול השנתי הממוצע של ניאוניקוטינואידים היה 11.4% בין השנים 2005 ל -2010, מתוכם כ -7% נרשמו בסין 4,5,6. מסוף 2016 ועד המחצית הראשונה של 2017, מכירות חומרי ההדברה בסין החלו להתאושש לאחר ירידה, ומחירי חומרי ההדברה המשיכו לעלות, ביניהם קוטלי חרקים ניאוניקוטינואידים הראו עליית מחירים משמעותית7. עד כה פותחו שלושה דורות של קוטלי חרקים ניאוניקוטינואידים, שכל אחד מהם מכיל קבוצות ניקוטין פירידין כלוריד, תיאזוליל, וטטרהידרופורן, בהתאמה8.
Imidacloprid מייצג את הדור הראשון של קוטלי חרקים neonicotinoid, אשר הנוסחה המולקולרית שלה היא C9H10ClN5O2, והוא גביש חסר צבע. אימידקלופריד משמש בעיקר להדברת מזיקים, כגון כנימות, פלנטהופרים, תולעי קמח ותריפס9 וניתן ליישם אותו על גידולים כגון אורז, חיטה, תירס, כותנה וירקות כגון תפוחי אדמה, כמו גם עצי פרי. בשל היישום ארוך הטווח, המשמעותי והמתמשך של חומרי הדברה, הן החרקים המועילים והן האויבים הטבעיים של המזיקים צומצמו במהירות, וחלק מהמזיקים החקלאיים הפכו עמידים לחומרי הדברה, וכתוצאה מכך נוצר מעגל קסמים של שימוש מתמשך והולך בכמויות של חומרי הדברה10. בנוסף, היישום הנרחב של חומרי הדברה הביא להידרדרות באיכות הקרקע, לשאריות מתמשכות של חומרי הדברה בתוצרת חקלאית ולבעיות אקולוגיות אחרות, שלא זו בלבד שהן גורמות נזק משמעותי לסביבה האקולוגית החקלאית11 אלא גם מהוות איום חמור על בריאות האדם12. ריסוס חומרי הדברה פוגע קשות בגדילה ובאיכות של מיקרובי קרקע ובעלי חיים בקרקע13. שימוש בלתי סביר או מופרז בחומרי הדברה גרם לסיכונים ביטחוניים משמעותיים לקרקע ולמים, לבעלי חיים ולצמחים ואף לחיי אדם14. בשנים האחרונות החריפה בעיית שאריות היתר של חומרי הדברה בגידולים חקלאיים עם השימוש הנרחב בחומרי הדברה. כאשר השתמשו באימידקלופריד להגדלת תנובת הירקות, שיעור הספיגה של אימידקלופריד בירקות עלה עם העלייה בכמות ובשאריות של אימידקלופריד15. כיבול מזון עיקרי, הן הייצור והן הבטיחות של חיטה הם קריטיים. לכן, יש להבהיר את מדיניות השאריות וההפצה של חומרי הדברה המשמשים לחיטה.
בשנים האחרונות פותחו שיטות רבות למיצוי שאריות אימידקלופריד ממים, אדמה וצמחים. שיטת QuEChERS (מהירה, קלה, זולה, יעילה, מוקשחת ובטוחה) היא שיטה חדשה המשלבת טכנולוגיית מיקרו-מיצוי בשלב מוצק וטכנולוגיית מיצוי שלב מוצק מפוזר וכוללת שימוש באצטוניטריל כממס מיצוי והסרת זיהומים ומים מעורבים בדגימה באמצעות NaCl ו- MgSO4 נטול מים, בהתאמה16. שיטת QuEChERS דורשת מינימום כלי זכוכית וכוללת שלבים ניסיוניים פשוטים, מה שהופך אותה לאחת משיטות מיצוי חומרי ההדברה הפופולריות ביותר17. עבור זיהוי של imidacloprid, מגבלת גילוי נמוכה כמו 1 × 10-9 גרם18 הושגה עם כרומטוגרפיה נוזלית (LC), ו 1 × 10-11 גרם 19 הושג עם כרומטוגרפיית גז (GC). בשל הרזולוציה הגבוהה והרגישות שלהם, LC-MS ו- GC-MS הראו מגבלות זיהוי imidacloprid נמוכות עוד יותר של 1 × 10-13 ל- 1 × 10-14 גרם20,21; טכניקות אלה, אם כן, מתאימות היטב לניתוח של עקבות imidacloprid שאריות.
במחקר הנוכחי, אימידקלופריד נבחר כמזהם המטרה, וחיטה נבחרה כיבול הניסוי לחקר התפלגות שאריות אימידקלופריד בחיטה. פרוטוקול זה מפרט שיטה לניתוח מקיף של העשרה והעברה של חומר ההדברה אימידקלופריד בחיטה על ידי בחינת קליטה ואחסון של אימידקלופריד בחלקים שונים של צמחי חיטה הגדלים בתנאים הידרופוניים. המחקר הנוכחי נועד לספק בסיס תיאורטי להערכת סיכונים של שאריות חומרי הדברה בחיטה, להנחות את היישום הרציונלי של חומרי הדברה בפעילות הייצור החקלאי כדי להפחית את שאריות חומרי ההדברה ולשפר את בטיחות ייצור היבול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. נביטה של זרעי חיטה
- בחר 1,000 זרעי חיטה (ג'ימאי 20) עם גרגירים שלמים, עוברים שלמים וגודל אחיד (אורך: 6 מ"מ ± 0.5 מ"מ).
- להעביר 333.3 מ"ל של 30% H 2 O2 פתרון לבקבוק נפח 1 L ולדלל עם מים deionized להכין 1 L של 10% H 2 O 2פתרון. טבלו את זרעי החיטה בתמיסת 10% H 2O2 למשך 15 דקות כדי לחטא את משטח הזרעים (איור 1).
- שטפו את זרעי החיטה 5 פעמים במים סטריליים זורמים במשך 10 שניות בכל פעם.
- פזרו את זרעי החיטה באופן שווה כשהעוברים מצביעים כלפי מעלה בצלוחית פטרי מזכוכית שהכילה נייר סינון סטרילי לח (איור 2). הניחו את צלחת הפטרי באינקובטור אקלים מלאכותי בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 80%. מקציפים את זרעי החיטה בחושך במשך 3 ימים עד שהם נובטים ומכים שורש.
איור 1: חיטוי זרעי חיטה. זרעי החיטה הושרו בתמיסת 10% H 2 O2(בכד) למשך 15 דקות לחיטוי משטח הזרעים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נביטת זרעי חיטה. זרעי החיטה פוזרו באופן שווה בכלי פטרי מזכוכית שהכיל נייר פילטר סטרילי לח. צלחת הפטרי הונחה באינקובטור אקלימי מלאכותי כדי להנביט את זרעי החיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
2. טיפוח שתילי חיטה
- יש להמיס 551 מ"ג של תערובת מלחי הבסיס של Hoagland ב-1 ליטר מים שעברו דה-יוניזציה להכנת 1/2 תמיסת תזונה של Hoagland (המכילה 0.75 mmol / L K2SO 4, 0.1 mmol / L KCl, 0.6 mmol / L MgSO 4, 4.0 × 10−2 mmol / L FeEDTA, 1.0 × 10−3 mmol / L H 3 BO3, 1.0 × 10−3 mmol / L MnSO4, 1.0 × 10−3 mmol / L ZnSO 4, 1.0 × 10−4 mmol / L CuSO 4, ו- 5.0 × 10−6 mmol / L Na2 MoO 4).
- לאחר שזרעי החיטה (שלב 1.4) נבטו, הניחו 15 שתילי חיטה בציוד הידרופוני (ראו טבלת חומרים) המכילים 100 מ"ל של 1/2 תמיסה תזונתית של Hoagland להידרופוניקה (איור 3). מניחים את כל המנגנון ההידרופוני באינקובטור אקלימי מלאכותי (ראו טבלת חומרים) ודגרים במשך 7 ימים בטמפרטורה של 25°C ו-80% לחות יחסית עם פוטופריוד בהיר/8 שעות כהה.
איור 3: גידול הידרופוני של שתילי חיטה. שתילי החיטה טופחו הידרופונית במשך 0 ימים, 3 ימים ו-7 ימים ב-100 מ"ל של 1/2 תמיסת הזנה של Hoagland. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
3. ניסוי בחשיפת צמחי החיטה לתמיסת אימידקלופריד
- לאחר תקופה הידרופונית של 7 ימים, השתילו את צמחי החיטה לתוך 1/2 תמיסת מזון Hoagland המכילה 0.5 מ"ג / ליטר או 5 מ"ג / ליטר אימידקלופריד כדי לבצע את ניסויי החשיפה לאימידקלופריד. לגדל 15 צמחי חיטה בכל מכשיר הידרופוני. הגדר 15 התקנים הידרופוניים עבור כל קבוצת ריכוז imidacloprid כדי להבטיח כי דגימות נאותות נלקחות במהלך הדגימה.
- הניחו את כל הציוד ההידרופוני באינקובטור אקלימי מלאכותי למשך 3 ימים בטמפרטורה של 25°C ולחות יחסית של 80% עם פוטופריוד כהה של 16 שעות/8 שעות.
- במהלך תקופת החשיפה, יש לאסוף שורשי חיטה (0.2 גרם לצמח חיטה) ועלים (0.5 גרם לצמח חיטה) מדי יום. לשלב את דגימות החיטה מכל מכשיר הידרופוני חמישי כקבוצה מקבילה ולקבוע את תכולת האימידקלופריד של הדגימות.
4. נוהל מיצוי אימידקלופריד מחיטה
- מיצוי אימידקלופריד משורשי חיטה
- כדי למנוע טעויות ניסיוניות, שטפו את שורשי החיטה 4x במים סטריליים זורמים במשך 10 שניות בכל פעם כדי להסיר כל אימידקלופריד שנספג על פני השורש.
- גורסים את שורשי החיטה לחתיכות של כ-1 ס"מ בעזרת מספריים (איור 4). שוקלים 10.00 גרם משורשי החיטה הגרוסים ומניחים בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
- הוסף 10 מ"ל של אצטוניטריל לצינור הצנטריפוגה וסובב את הצינור על מערבולת למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 4 גרם של MgSO4 נטול מים ו 1.5 גרם של NaCl לצינור הצנטריפוגה ולסובב את הצינור מיד במשך 30 שניות. צנטריפוגה את הצינור למשך 5 דקות ב 6,000 x גרם.
- שאפו את הסופרנאטנט עם מזרק חד פעמי והעבירו אותו דרך מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר) כדי לקבל את הדגימה.
- מיצוי אימידקלופריד מעלי חיטה (איור 5)
- גורסים את עלי החיטה הטריים לחתיכות של כ-1 ס"מ בעזרת מספריים (איור 4). שוקלים 10.00 גרם מעלי החיטה הגרוסים ומניחים בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
- מוסיפים 10 מ"ל אצטוניטריל לצינור הצנטריפוגה ומערבלים את הצינור על מערבולת למשך דקה אחת.
- הוסף 4 גרם של MgSO4 נטול מים ו 1.5 גרם של NaCl לצינור הצנטריפוגה ולסובב את הצינור מיד במשך 30 שניות.
- צנטריפוגה את הצינור למשך 5 דקות ב 6,000 x גרם.
- לאחר הצנטריפוגה, יש להוסיף 2 מ"ל של הסופרנאטנט לצינור צנטריפוגה של 5 מ"ל המכיל 50 מ"ג פחמן שחור גרפי (GCB) ו-150 מ"ג של MgSO4 נטול מים (כדי להסיר פיגמנט ולחות מהדגימה), ולסובב את צינור הצנטריפוגה למשך 30 שניות (איור 6). צנטריפוגה את הצינור למשך 5 דקות ב 6,000 x גרם.
- שאפו את הסופרנאטנט עם מזרק חד פעמי והעבירו אותו דרך מסנן מזרק (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר) כדי לקבל את הדגימה.
איור 4: שורשי חיטה ועלים גרוסים. שורשים ועלים מחיטה טרייה נגרסו באמצעות מספריים לחתיכות של כ-1 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מיצוי אימידקלופריד בעלי חיטה. Imidacloprid בדגימות חולץ בשיטת QuEChERS (שלבים 4.2.1-4.2.4 של הפרוטוקול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: טיהור אימידקלופריד בעלי חיטה. המזהם היה 50 מ"ג GCB + 150 מ"ג MgSO4. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
5. כימות של imidacloprid
- כמת את האימידקלופריד במדגם באמצעות ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית טנדם (LC-MS-MS),בהתבסס על עקומה סטנדרטית (y = 696.61x + 56.411, R=1) המתקבלת מריכוזי אימידקלופריד של 0.2-250 מיקרוגרם/ליטר. (איור 7). ספקטרומטר המסות צויד בעמוד C18 (100 מ"מ x 2.1 מ"מ, 3 מיקרומטר) ובמקור יינון אלקטרוספריי (ESI+). הפרמטרים של תוכנית האלוציה ומקור היונים מוצגים בטבלה 1.
איור 7: כרומטוגרמה וספקטוגרמה של מסה של אימידקלופריד בעלי חיטה. הלוח העליון מציג כרומטוגרמה של אימידקלופריד (זמן שמירה = 0.93 דקות). הלוח התחתון מראה את ספקטוגרמה המסה של imidacloprid ב 0.93 דקות, מראה את עוצמת התגובה של הייצור (m/z = 208.8) של imidacloprid. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| טמפרטורת עמודה | 40°C |
| ממס א' | 99.9% מים/0.1% חומצה פורמית (V/V) |
| ממס ב' | אצטוניטריל |
| תוכנית אלוציה | 0–0.5 דקות, A = 20% |
| 0.5–2 דקות, A = 20%–50% | |
| 2-3 דקות, A = 50% | |
| 3–3.1 דקות, A = 50%–20% | |
| 3.1–5 דקות, A = 20% | |
| קצב זרימה (מ"ל/דקה) | 0.3 |
| נפח הזרקה (μL) | 5 |
| טמפרטורה נימי (°C) | 330 |
| טמפרטורת הוופורייזר (°C) | 350 |
| קצב זרימת גז מעטפת (Arb) | 40 |
| קצב זרימת גז aux (Arb) | 20 |
| מתח ריסוס (V) | 3900 |
| לחץ גז התנגשות (mTorr) | 1.5 |
| יון מקדים | 256.1 |
| יון המוצר/אנרגיית התנגשות (eV) | 208.8/16 |
טבלה 1: תוכנית אלוציה ופרמטרי מקור יונים בשיטת ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מגבלת הזיהוי של אימידקלופריד (LOD) הייתה 5.76 ×-10-14 גרם, ו-LOD של אימידקלופריד בשורש החיטה או בעלה היה 0.01 מיקרוגרם/ק"ג; לא נצפה אפקט מטריצה. יבולי ההתאוששות של אימידקלופריד בחיטה מוצגים בטבלה 2. יבולי ההתאוששות של אימידקלופריד משורשי חיטה שנחשפו לריכוזי אימידקלופריד של 0.5 מ"ג/ליטר ו-5 מ"ג/ליטר היו 94.0%-97.6% ו-98.8%-99.2%, בהתאמה; מקדמי השונות היו 1.92% ו-0.20%, בהתאמה. יבולי ההתאוששות של אימידקלופריד מעלי חיטה שנחשפו לריכוזי אימידקלופריד של 0.5 מ"ג/ליטר ו-5 מ"ג/ליטר היו 88.2%-91.4% ו-92.5%-93.4%, בהתאמה; מקדמי השונות היו 1.85% ו-0.53%, בהתאמה.
ריכוזי האימידקלופריד בשורשי החיטה ובעלים מוצגים בטבלה 3. אימידקלופריד זוהה הן בשורשי החיטה והן בעלים, עם תוכן גבוה יותר בשורשים מאשר בעלים. תכולת האימידקלופריד עלתה עם זמן חשיפה ארוך יותר. לאחר 3 ימים של חשיפה, כמויות האימידקלופריד בשורשי החיטה ובעלים היו 4.55 מ"ג/ק"ג ±-1.45 מ"ג/ק"ג ו-1.30 מ"ג/ק"ג ±-0.08 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, בקבוצת הטיפול של 0.5 מ"ג/ליטר ו-42.5 מ"ג/ק"ג ±-0.62 מ"ג/ק"ג ו-8.71 מ"ג/ק"ג ±-0.14 מ"ג/ק"ג, בהתאמה, בקבוצת הטיפול של 5 מ"ג/ליטר. כאשר שורשי החיטה נחשפו לאימידקלופריד במשך יום אחד, אימידקלופריד זוהה הן בשורשים והן בעלים של צמחי החיטה, מה שמצביע על כך ששורשי החיטה יכלו לספוג אימידקלופריד במהירות ממדיום התרבית ולהוביל אותו לתוך צמחי החיטה. התוכן של imidacloprid בעלי חיטה ירד מעט ביום 3 לעומת יום 2. זה נגרם כנראה על ידי השפלה של כמה imidacloprid, בשילוב עם דילול התוכן imidacloprid ליחידת נפח של עלי חיטה עם הארכת תקופת התרבית הידרופונית. שורשי החיטה והעלים הכילו כמויות שונות של אימידקלופריד, דבר המעיד על כך שאימידקלופריד נספג והתנהל באופן שונה בצמחי החיטה ולא הגיע לאתרי פעולתו בו זמנית. ההבדלים בשאריות אימידקלופריד בחלקים שונים של צמח החיטה קשורים קשר הדוק למבנה הפיזיולוגי של צמח החיטה ולתכונות הפיזיקוכימיות של אימידקלופריד.
הפרמטרים הנפוצים להעשרה והעברה של חומרי הדברה הנקלטים בצמחים כוללים את גורם ריכוז השורשים (RCF) וגורם הטרנסלוקציה (TF)22. RCF הוא היחס בין ריכוז האימידקלופריד בשורש הצמח לזה שבמדיום התרבית. RCF > 1 מציין כי אימידקלופריד מועשר בקלות על ידי הצמח, בעוד RCF < 1 מציין כי הצמח אינו מעשיר בקלות imidacloprid. כפי שניתן לראות מטבלה 4, RCF מהמחקר הנוכחי היה >1, מה שמצביע על כך שלחיטה יש השפעה מעשירה על אימידקלופריד. ה-TF מייצג את היכולת של הצמח (כאן, חיטה) להעביר חומר (כאן, אימידקלופריד) בין השורשים, הנבטים והעלים של הצמח. TF > 1 מציין כי imidacloprid הוא translocation בקלות על ידי הצמח, בעוד TF < 1 מציין כי הצמח אינו בקלות translocate imidacloprid. ה- TF מחושב כיחס בין הריכוז השיורי של אימידקלופריד בחלקים שונים של החיטה לריכוז האימידקלופריד בשורשים:עלה TF = עלה C /שורש C. עלה TF > 1 מציין שאימידקלופריד מועבר בקלות משורשי הצמח לעלים, בעודשעלה TF < 1 מציין את ההפך. כפי שניתן לראות מטבלה 4,עלה ה-TF במחקר הנוכחי היה <1, מה שמצביע על כך שאימידקלופריד לא הועבר בקלות משורשי החיטה לעלים.
מצב הצמיחה של צמחי חיטה לאחר חשיפה לאימידקלופריד מוצג באיור 8. לאחר 3 ימים של חשיפה, לא 0.5 מ"ג / ליטר ולא 5 מ"ג / ליטר אימידקלופריד יצרו כל עיכוב נראה לעין של צמיחת צמח החיטה.
מערך הנתונים המשויך למחקר זה זמין בכתובת https://doi.org/10.5281/zenodo.7022287.
איור 8: צמחי חיטה שנחשפו לאימידקלופריד במשך יום, יומיים ושלושה ימים. CK = קבוצת ביקורת; 0.5 = 0.5 מ"ג / ליטר קבוצת imidacloprid; 5 = 5 מ"ג / ליטר קבוצת imidacloprid. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
| לדוגמה | ריכוז אימידקלופריד (מ"ג/ליטר) | התאוששות (%) | RSD (%) | |||
| טיפול 1 | טיפול 2 | טיפול 3 | ממוצע | |||
| שורש חיטה | 0.5 | 94.00 | 97.60 | 95.20 | 95.60 | 1.92 |
| 5 | 99.00 | 98.80 | 99.20 | 99.00 | 0.20 | |
| עלה חיטה | 0.5 | 88.20 | 91.40 | 90.60 | 90.10 | 1.85 |
| 5 | 93.30 | 93.40 | 92.50 | 93.10 | 0.53 | |
טבלה 2: התאוששות וסטיית תקן יחסית (RSD) של אימידקלופריד בשורשי החיטה ובעלים (n = 3). ריכוזי האימידקלופריד מבוססים על המשקל הטרי של שורשי החיטה או העלים.
| לדוגמה | ריכוז אימידקלופריד בתמיסה (מ"ג/ליטר) | תוכן Imidacloprid (מ"ג / ק"ג) | ||
| 1 ד | 2 ד | 3 ד | ||
| שורש חיטה | 0.5 | 2.11 ± 0.05 | 3.18 ± 0.48 | 4.55 ± 1.45 |
| 5 | 14.83 ± 0.50 | 26.86 ± 1.38 | 68.4 ± 0.62 | |
| עלה חיטה | 0.5 | 0.34 ± 0.03 | 1.43 ± 0.60 | 1.30 ± 0.08 |
| 5 | 2.10 ± 0.18 | 9.81 ± 0.70 | 8.71 ± 0.14 | |
טבלה 3: תכולת אימידקלופריד בשורשים ובעלים של החיטה לאחר יום, יומיים ושלושה ימי חשיפה. הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (n = 2). ריכוזי האימידקלופריד מבוססים על המשקל הטרי של שורשי החיטה או העלים.
| קבוצה | RCF | עלה TF | ||||
| יום 1 | 2 ימים | 3 ימים | יום 1 | 2 ימים | 3 ימים | |
| 0.5 מ"ג/ליטר קבוצת imidacloprid | 4.22 | 6.36 | 9.10 | 0.16 | 0.45 | 0.29 |
| 5 מ"ג / ליטר קבוצת imidacloprid | 2.97 | 5.37 | 8.50 | 0.14 | 0.37 | 0.20 |
טבלה 4: גורמי ריכוז שורשים (RCF) וגורמי טרנסלוקציה של עלים (עלה TF) של חיטה לאימידקלופריד. RCF הוא היחס בין ריכוז האימידקלופריד בשורש החיטה לזה שבתווך התרבית ההידרופונית. עלה TF הוא היחס בין הריכוז השיורי של אימידקלופריד בעלה החיטה לזה שבשורש החיטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשנים האחרונות דווחו לעתים קרובות שיטות לטיפול מקדים ואיתור שאריות של חומר ההדברה אימידקלופריד. Badawy et al.23 השתמשו בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים כדי לקבוע את התוכן של אימידקלופריד בפרי עגבניות שגדל בתנאי חממה ודיווחו על ליניאריות טובה עבור אימידקלופריד בטווח 0.0125-0.15 מיקרוגרם / מ"ל. Zhai et al.24 השתמשו ב- LC-MS-MS כדי לחקור את שאריות האימידקלופריד בעירית סינית. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשיטת QuEChERS כדי לחלץ אימידקלופריד משורשי חיטה ועלים. כשיטה מהירה ויעילה, שיטת QuEChERS מתאימה היטב ונמצאת בשימוש נרחב למיצוי אימידקלופריד מאדמה 25 ולשתילתדגימות 20,26 (כגון צ'ילי, עגבניה, כרוב וחיטה). מטרת המחקר הנוכחי הייתה לקבוע האם ההתאוששות של אימידקלופריד הייתה עקבית ועמדה בדרישות הקביעה. שיעור ההתאוששות ומקדם השונות של אימידקלופריד בחיטה עמדו בדרישות לקביעת שאריות, מה שמצביע על כך ששיטה זו הייתה ישימה להפקת אימידקלופריד מחיטה. תכולת האימידקלופריד נקבעה על ידי LC-MS-MS במחקר הנוכחי, ומגבלת הזיהוי האינסטרומנטלית של אימידקלופריד עמדה בדרישות לניתוח כמותי של שאריות חומרי הדברה. עם זאת, ייתכן ששיטה זו לא תוכל לזהות אימידקלופריד כלשהו כאשר התוכן בדגימה נמוך מ- 0.01 מיקרוגרם/ק"ג. במקרים כאלה, הדגימה צריכה להיות מרוכזת, או כמות גבוהה יותר יש להזריק עבור LC-MS-MS. שיטת המיצוי והגילוי של אימידקלופריד בה נעשה שימוש במחקר הנוכחי היא בעלת מאפיינים של מהירות, פשטות, אמינות, נוחות ודיוק גבוה והיא מתאימה לניתוח שאריות חומרי הדברה. הצלחתה של מתודולוגיה זו, כפי שהודגמה במחקר הנוכחי, מצביעה על הפוטנציאל שלה לשימוש בהערכת בטיחות המזון של אימידקלופריד בחיטה. השלבים הקריטיים בפרוטוקול כוללים תוספת של MgSO4, NaCl ו- GCB נטול מים. MgSO4 נטול מים ו- NaCl מתווספים כדי להסיר מים מתמיסת הדגימה, בעוד GCB מתווסף כדי להסיר פיגמנט מתמיסת הדגימה. שיטת המיצוי בה נעשה שימוש במחקר זה מוגבלת על ידי הדרישה לכמות מדגם גדולה מספיק (10 גרם), מה שהופך אותה לפחות מתאימה להערכת גודל מדגם קטן.
נוכחותו של אימידקלופריד בשורשי החיטה ובעלים מדגימה כי חיטה יכולה לספוג ולהעביר אימידקלופריד במהירות. ההעשרה וההובלה של תרכובות אורגניות בצמחים קשורות קשר הדוק לערך Kow שלהן, שהוא היחס בין ריכוז שיווי המשקל של תרכובות אורגניות בפאזה N-אוקטאנול ומים תחת שיווי משקל27. על פי ערך ה-log K שלהם, ניתן לחלק את המזהמים האורגניים למזהמים אורגניים הידרופוביים, מזהמים אורגניים הידרופיליים ומזהמים אורגניים הידרופיליים במידה בינונית. מזהמים אורגניים הידרופוביים (log Kow > 3) יכולים להיספג בחוזקה על ידי פני השטח של השורש ואינם נודדים בקלות כלפי מעלה. מצד שני, מזהמים אורגניים הידרופיליים (log Kow < 0.5) אינם נספגים בקלות על ידי שורשים או עוברים דרך קרום התא של צמחים. מזהמים אורגניים מימיים (log Kow = 0.53) נספגים בקלות על ידי צמחים, מועשרים ומועברים. ערך ה-log Kow (0.57) של אימידקלופריד מצביע על כך שמדובר בחומר אורגני הידרופילי במידה בינונית, אשר נספג, מועשר ומועבר בקלות על ידי צמחים.
לרקמות שונות של צמחים יש יכולות שונות לספוג ולהעביר חומרי הדברה שונים לאורך זמן תחת אותה סביבה28. המחקר הנוכחי מצא כי התפלגות האימידקלופריד השתנתה בחלקים שונים של צמח החיטה. באופן ספציפי, המחקר זיהה הבדל גדול בספיגת אימידקלופריד בין שורשי החיטה לעלים. שורשי חיטה הם בעלי יכולת חזקה לספוג ולהעביר אימידקלופריד ויכולים לצבור אימידקלופריד בריכוזים גדולים פי כמה מהריכוז הסביבתי, ובכך לאפשר העברת אימידקלופריד בסביבה לעלי החיטה. מחקר שנערך על ידי יואן ואחרים על התפלגות אימידקלופריד בחיטה לאחר החלת אימידקלופריד בשחרור מבוקר גילה כי הצטברות אימידקלופריד בשורשי החיטה הייתה פי 5-10 מאשר בעלים, מה שעולה בקנה אחד עם תוצאות המחקר הנוכחי.
למרות שהמחקר הנוכחי תורם להבנה הכוללת של שאריות חומרי הדברה של אימידקלופריד בגידולים, יש לו כמה מגבלות. לדוגמה, רק חיטה שגדלה בתנאים הידרופוניים נבחרה כצמח הבדיקה במחקר הנוכחי. לכן, מחקר עתידי על מנגנוני הקליטה, הנדידה וההפצה של חומרי הדברה בירקות, עצי פרי וצמחים אחרים הגדלים בקרקע כמו גם במים הוא מוצדק. במחקרים נוספים, ריכוזים שונים של אימידקלופריד ומגוון צמחים ייחקרו כדי לחקור בפירוט רב יותר את הספיגה, ההובלה וההצטברות של אימידקלופריד בצמחים כדי להבין טוב יותר את הסיכון הסביבתי הנשקף מאימידקלופריד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים. כל המחברים קראו ואישרו את כתב היד. עבודה זו לא פורסמה בעבר, והיא גם לא נשקלת על ידי אף כתב עת אחר שעובר ביקורת עמיתים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '42277039).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | 01-06-1995 | Suitable for HPLC, gradient grade, >99.9% |
| Analytical balance | Sartorius Lab Instruments Co.Ltd. | GL124-1SCN | |
| Artificial climate incubator | Shanghai Badian Instrument Equipment Co. Ltd. | HK320 | |
| Centrifuge | Eppendorf China Co. Ltd. | Centrifuge5804 | |
| Disposable syringe | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | Z116866 | Capacity 5 mL, graduated 0.2 mL, non-sterile |
| Formic acid | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | Y0001970 | European pharmacopoeia reference standard |
| Graphitized carbon black (GCB) | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | V900058 | 45 μm |
| H2O2 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | 31642 | 30% (w/w) |
| Hoagland’s Basal Salt Mixture | Shanghai Yu Bo Biotech Co. Ltd. | NS1011 | Anhydrous, reagent grade |
| Hydroponic equipment | Jiangsu Rongcheng Agricultural Science and Technology Development Co.Ltd. | SDZ04BD | |
| Hypersil BDS C18 column | Thermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd. | 28103-102130 | |
| Imidacloprid | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | Y0002028 | European pharmacopoeia reference standard |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd. | 208094 | Anhydrous, reagent grade, >97% |
| NaCl | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | S9888 | Reagent grade, 99% |
| pH meter | Shanghai Thunder Magnetic Instrument Factory | PHSJ-3F | |
| Phytotron box | Harbin Donglian Electronic Technology Co. Ltd. | HPG-280B | |
| Pipettes | Eppendorf China Co. Ltd. | Research plus | |
| Syringe filter | Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd. | SLGV033N | Nylon, 0.22 µm pore size, 33 mm, non-sterile |
| Ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry | Thermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd. | UltiMate 3000 | |
| TSQ Quantum Access MAX | |||
| Vortex mixer | Shanghai Yetuo Technology Co. Ltd. | Vortex-2 | |
| Wheat seed | LuKe seed industry | Jimai 20 |
References
- Lin, P. C., Lin, H. J., Liao, Y. Y., Guo, H. R., Chen, K. T. Acute poisoning with neonicotinoid insecticides: A case report and literature review. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. 112 (4), 282-286 (2013).
- North, J. H., et al. Value of neonicotinoid insecticide seed treatments in Mid-South corn (Zea mays) production systems. Journal of Economic Entomology. 111 (1), 187-192 (2018).
- Simon-Delso, N., et al. Systemic insecticides (neonicotinoids and fipronil): Trends, uses, mode of action and metabolites. Environmental Science and Pollution Research. 22 (1), 5-34 (2015).
- Bass, C., Denholm, I., Williamson, M. S., Nauen, R. The global status of insect resistance to neonicotinoid insecticides. Pesticide Biochemistry and Physiology. 121, 78-87 (2015).
- Craddock, H. A., Huang, D., Turner, P. C., Quiros-Alcala, L., Payne-Sturges, D. C. Trends in neonicotinoid pesticide residues in food and water in the United States, 1999-2015. Environmental Health. 18 (1), 7 (2019).
- Shao, X. S., Liu, Z. W., Xu, X. Y., Li, Z., Qian, X. H. Overall status of neonicotinoid insecticides in China: Production, application and innovation. Journal of Pesticide Science. 38 (1-2), 1-9 (2013).
- Zhao, Y., et al. Urinary neonicotinoid insecticides in children from South China: Concentrations, profiles and influencing factors. Chemosphere. 291, 132937 (2022).
- Kurwadkar, S., Evans, A. Neonicotinoids: Systemic insecticides and systematic failure. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 97 (6), 745-748 (2016).
- Sadaria, A. M., et al. Passage of fiproles and imidacloprid from urban pest control uses through wastewater treatment plants in northern California, USA. Environmental Toxicology and Chemistry. 36 (6), 1473-1482 (2017).
- Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators. International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).
- Hayes, T. B., et al. Demasculinization and feminization of male gonads by atrazine: Consistent effects across vertebrate classes. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 127 (1-2), 64-73 (2011).
- Rani, L., et al. An extensive review on the consequences of chemical pesticides on human health and environment. Journal of Cleaner Production. 283, 124657 (2021).
- Xu, Y. Q., et al. Ecotoxicity evaluation of azoxystrobin on Eisenia fetida in different soils. Environmental Research. 194, 110705 (2021).
- Yavari, S., Malakahmad, A., Sapari, N. B. Biochar efficiency in pesticides sorption as a function of production variables-A review. Environmental Science and Pollution Research. 22 (18), 13824-13841 (2015).
- Delcour, I., Spanoghe, P., Uyttendaele, M. Literature review: Impact of climate change on pesticide use. Food Research International. 68, 7-15 (2015).
- Zhang, C. Y., et al. The application of the QuEChERS methodology in the determination of antibiotics in food: A review. TrAC-Trends in Analytical Chemistry. 118, 517-537 (2019).
- Wiilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the QuEChERS methodology. Food Chemistry. 125 (3), 803-812 (2011).
- Ishii, Y., et al. HPLC determination of the new insecticide imidacloprid and its behavior in rice and cucumber. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 42 (12), 2917-2921 (1994).
- Ko, A. Y., et al. Development of a simple extraction and oxidation procedure for the residue analysis of imidacloprid and its metabolites in lettuce using gas chromatography. Food Chemistry. 148, 402-409 (2014).
- Yuan, W. L., et al. Application of imidacloprid controlled-release granules to enhance the utilization rate and control wheat aphid on winter wheat. Journal of Integrative Agriculture. 19 (12), 3045-3053 (2020).
- Phugare, S. S., Kalyani, D. C., Gaikwad, Y. B., Jadhav, J. P. Microbial degradation of imidacloprid and toxicological analysis of its biodegradation metabolites in silkworm (Bombyx mori). Chemical Engineering Journal. 230, 27-35 (2013).
- Li, Y., et al. Uptake, translocation and accumulation of imidacloprid in six leafy vegetables at three growth stages. Ecotoxicology and Environmental Safety. 164, 690-695 (2018).
- Badawy, M. E. I., Ismail, A. M. E., Ibrahim, A. I. H. Quantitative analysis of acetamiprid and imidacloprid residues in tomato fruits under greenhouse conditions. Journal of Environmental Science and Health Part B-Pesticides Food Contaminants and Agricultural Wastes. 54 (11), 898-905 (2019).
- Zhai, R. Q., et al. Residue, dissipation pattern, and dietary risk assessment of imidacloprid in Chinese chives. Frontiers in Nutrition. 9, 846333 (2022).
- Aria, M. M., et al. Uptake and translocation monitoring of imidacloprid to chili and tomato plants by molecularly imprinting extraction - ion mobility spectrometry. Microchemical Journal. 144, 195-202 (2019).
- Chen, Y., et al. Translocation and metabolism of imidacloprid in cabbage: Application of C-14-labelling and LC-QTOF-MS. Chemosphere. 263, 127928 (2021).
- Wild, S., Jones, K. Organic chemicals entering agricultural soils in sewage sludges: Screening for their potential to transfer to crop plants and livestock. Science of the Total Environment. 119, 85-119 (1992).
- Gong, W. W., et al. Uptake and dissipation of metalaxyl-M, fludioxonil, cyantraniliprole and thiamethoxam in greenhouse chrysanthemum. Environmental Pollution. 257, 113499 (2020).
