Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

विट्रो और कोशिकाओं में अनुक्रमण के साथ डाइमिथाइल सल्फेट म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग के साथ आरएनए संरचना की जांच

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64820
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Harvard Medical School

Summary

प्रोटोकॉल म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग प्रयोगों के लिए डाइमिथाइल सल्फेट के साथ आरएनए को संशोधित करने के लिए निर्देश प्रदान करता है। इसमें दो वैकल्पिक पुस्तकालय तैयारी विधियों के साथ इन विट्रो और विवो जांच शामिल है।

Abstract

वस्तुतः किसी भी जैविक प्रक्रिया में आरएनए संरचना की भूमिका तेजी से स्पष्ट हो गई है, खासकर पिछले दशक में। हालांकि, आरएनए संरचना को हल करने के लिए शास्त्रीय दृष्टिकोण, जैसे कि आरएनए क्रिस्टलोग्राफी या क्रायो-ईएम, तेजी से विकसित क्षेत्र और उच्च-थ्रूपुट समाधान की आवश्यकता के साथ रहने में विफल रहे हैं। डाइमिथाइल सल्फेट (डीएमएस) एमएपीसेक का उपयोग करके अनुक्रमण के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग डीएमएस के साथ आधार की प्रतिक्रिया से आरएनए संरचना का अनुमान लगाने के लिए एक अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण है। डीएमएस एडेनोसिन में एन 1 नाइट्रोजन और साइटोसिन में एन 3 को उनके वाटसन-क्रिक चेहरे पर मिथाइलेट करता है जब आधार अप्रकाशित होता है। थर्मोस्टेबल समूह II इंट्रॉन रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (टीजीआईआरटी-III) के साथ संशोधित आरएनए को रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट करने से मिथाइलेटेड बेस को सीडीएनए में उत्परिवर्तन के रूप में शामिल किया जाता है। परिणामी सीडीएनए को अनुक्रमित करते समय और इसे संदर्भ प्रतिलेख में वापस मैप करते समय, प्रत्येक आधार के लिए सापेक्ष उत्परिवर्तन दर आधार की "स्थिति" को युग्मित या अप्रकाशित के रूप में इंगित करती है। भले ही डीएमएस प्रतिक्रियाओं में विट्रो और कोशिकाओं दोनों में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है, यह विधि हैंडलिंग प्रक्रियाओं में पूर्वाग्रह के प्रति संवेदनशील है। इस पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, यह पेपर कोशिकाओं में डीएमएस के साथ और इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड आरएनए के साथ आरएनए उपचार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है।

Introduction

इस खोज के बाद से कि आरएनए में संरचनात्मक 1,2 और उत्प्रेरक3 गुण दोनों हैं, जैविक प्रक्रियाओं की अधिकता में आरएनए और इसके नियामक कार्य के महत्व को धीरे-धीरे उजागर किया गया है। दरअसल, जीन विनियमन पर आरएनए संरचना के प्रभाव ने बढ़ते ध्यान को प्राप्तकिया है। प्रोटीन की तरह, आरएनए में प्राथमिक, द्वितीयक और तृतीयक संरचनाएं होती हैं, जो क्रमशः न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम, बेस-पेयरिंग इंटरैक्शन के 2 डी मैपिंग और इन बेस-युग्मित संरचनाओं के 3 डी फोल्डिंग का उल्लेख करती हैं। जबकि तृतीयक संरचना का निर्धारण आरएनए-निर्भर प्रक्रियाओं के पीछे सटीक तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, द्वितीयक संरचना आरएनए फ़ंक्शन के बारे में भी अत्यधिक जानकारीपूर्ण है और आगे 3 डी फोल्डिंग5 का आधार है।

हालांकि, आरएनए संरचना का निर्धारण पारंपरिक दृष्टिकोणों के साथ आंतरिक रूप से चुनौतीपूर्ण रहा है। जबकि प्रोटीन के लिए, क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर), और क्रायोजेनिक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) ने संरचनात्मक रूपांकनों की विविधता को निर्धारित करना संभव बना दिया है,अकेले अनुक्रम 6 से संरचना की भविष्यवाणी की अनुमति देता है, ये दृष्टिकोण आरएनए पर व्यापक रूप से लागू नहीं होते हैं। दरअसल, आरएनए बिल्डिंग ब्लॉक (न्यूक्लियोटाइड) के साथ लचीले अणु होते हैं जिनके पास अपने अमीनो एसिड समकक्षों की तुलना में बहुत अधिक संवहन और घूर्णी स्वतंत्रता होती है। इसके अलावा, बेस-पेयरिंग के माध्यम से बातचीत अमीनो एसिड अवशेषों की तुलना में अधिक गतिशील और बहुमुखी है। नतीजतन, शास्त्रीय दृष्टिकोण केवल अच्छी तरह से परिभाषित, अत्यधिक कॉम्पैक्ट संरचनाओं के साथ अपेक्षाकृत छोटे आरएनए के लिए सफल रहेहैं।

आरएनए संरचना को निर्धारित करने का एक और तरीका अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एनजीएस) के साथ संयुक्त रासायनिक जांच के माध्यम से है। यह रणनीति एक आरएनए अनुक्रम (यानी, इसकी द्वितीयक संरचना) में प्रत्येक आधार की बाध्यकारी स्थिति के बारे में जानकारी उत्पन्न करती है। संक्षेप में, एक आरएनए अणु में आधार जो बेस-पेयरिंग में संलग्न नहीं हैं, उन्हें छोटे रासायनिक यौगिकों द्वारा अलग-अलग संशोधित किया जाता है। विशेष रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस (आरटी) के साथ इन आरएनए को रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट करने से उत्परिवर्तन के रूप में पूरक डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक एसिड (सीडीएनए) में संशोधन शामिल होते हैं। इन सीडीएनए अणुओं को पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) द्वारा प्रवर्धित किया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है। बाध्य या अनबाउंड के रूप में उनकी "स्थिति" के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए, रुचि के आरएनए में प्रत्येक आधार पर उत्परिवर्तन आवृत्तियों की गणना की जाती है और बाधाओं के रूप में संरचना पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर में दर्जकिया जाता है। निकटतम पड़ोसी नियम9 और न्यूनतम मुक्त ऊर्जा गणना10 के आधार पर, यह सॉफ्टवेयर संरचना मॉडल उत्पन्न करता है जो प्राप्त प्रयोगात्मक डेटा11,12 को सबसे अच्छा फिट करता है।

डीएमएस-मासेक डीएमएस का उपयोग करता है, जो एडेनोसिन में एन 1 नाइट्रोजन और साइटोसिन में एन 3 नाइट्रोजन कोउनके वाटसन-क्रिक चेहरे पर अत्यधिक विशिष्ट तरीके से मिथाइलेट करता है। रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में थर्मोस्टेबल ग्रुप II इंट्रॉन रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (टीजीआईआरटी-III) का उपयोग अभूतपूर्व सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइल बनाता है, यहां तक कि दो या दो से अधिक वैकल्पिक अनुरूपता14,15 द्वारा उत्पन्न ओवरलैपिंग प्रोफाइल के डीकन्वोल्यूशन की अनुमति देता है। इसके अलावा, डीएमएस कोशिका झिल्ली और पूरे ऊतकों में प्रवेश कर सकता है, जिससे शारीरिक संदर्भों के भीतर जांच संभव हो जाती है। हालांकि, अच्छी गुणवत्ता वाले डेटा की पीढ़ी चुनौतीपूर्ण है, क्योंकि हैंडलिंग प्रक्रिया में भिन्नता परिणामों को प्रभावित कर सकती है। इसलिए, हम पूर्वाग्रह को कम करने और नए लोगों को उन कठिनाइयों के माध्यम से विधि के लिए मार्गदर्शन करने के लिए इन विट्रो और इन-सेल डीएमएस-एमएपीसेक दोनों के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। विशेष रूप से हाल ही में सार्स-सीओवी 2 महामारी के प्रकाश में, आरएनए वायरस पर उच्च गुणवत्ता वाला डेटा जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सीय खोजने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, सॉफ्टवेयर, अभिकर्मकों, उपकरणों और कोशिकाओं से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. जीन-विशिष्ट इन विट्रो डीएमएस-एमएपी

  1. आरएनए इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन
    1. डबल-स्ट्रैंडेड (डीएस) डीएनए (उदाहरण के लिए, पहले से मौजूद / जीनोमिक डीएनए से डीएनए टुकड़े, प्लास्मिड या पीसीआर के रूप में) के रूप में रुचि के आरएनए के अनुक्रम को प्राप्त करें। यदि डीएनए अनुक्रम में पोलीमरेज़ प्रोमोटर होता है, तो चरण 3 पर जाएं।
    2. वांछित डीएनए टुकड़े के ऊपर एक आरएनए पोलीमरेज़ प्रोमोटर को संलग्न करने के लिए ओवरलैप पीसीआर करें (टी 7 पोलीमरेज़ के लिए फॉरवर्ड प्राइमर: 5 'टीएएटीएसीजीएसीटीएटीएजी + लक्ष्य अनुक्रम 3 का पहला आधार)।।
    3. इन विट्रो डीएनए टुकड़े को आरएनए में स्थानांतरित करता है। आरएनए को हमेशा बर्फ पर रखें।
    4. DNase का उपयोग करके डीएनए को पचाएं।
    5. कॉलम-आधारित दृष्टिकोण (चरण 2.4) या इथेनॉल वर्षा (चरण 2.5) का उपयोग करके आरएनए को अलग करें। एक उपयुक्त मात्रा में, ~ 50 μg की उपज की उम्मीद है।
    6. इसे अगारोस जेल पर चलाकर आरएनए अखंडता सुनिश्चित करें; चलाने से पहले 70 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 मिनट के लिए आरएनए को डिनेचर करें।
      नोट: बफर और अगारोस में आरएनएस हो सकते हैं जो आरएनए को नीचा दिखाते हैं और आरएनए नमूने को दूषित कर सकते हैं। प्रीकास्ट अगारोस जैल पहले इस प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है; परिणाम (विशेष रूप से आरएनए के साथ) कई बार अस्पष्ट रहे हैं। सबसे अच्छे परिणाम अगारोस या पेज जैल के साथ प्राप्त किए गए थे।
    7. आरएनए को कई महीनों तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने का सीधा उपयोग करें जब तक कि पिघलने के बाद गिरावट दिखाई न दे।
  2. इन विट्रो DMS संशोधन (105 mM DMS पर)
    1. पर्याप्त मात्रा में रिफोल्डिंग बफर तैयार करें (0.4 एम सोडियम कैकोडाइलेट, पीएच 7.2, जिसमें 6 एमएम एमजीसीएल2 होता है)।
      नोट: प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए (100 μL की अंतिम मात्रा), रिफोल्डिंग बफर के 89 μL जोड़ें।
    2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, एक निर्दिष्ट 1.5 एमएल ट्यूब में रिफोल्डिंग बफर के 89 μL स्थानांतरित करें, और एक रासायनिक हुड के नीचे रखे थर्मोशेकर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म करें।
      नोट: डीएमएस अत्यधिक विषाक्त है और इसे हमेशा एक रासायनिक हुड के नीचे रखा जाना चाहिए जब तक कि कम करने वाले एजेंट द्वारा बुझाया न जाए।
    3. न्यूक्लियस-मुक्त पानी (एनएफ एच 2 ओ) के 10 μL में आरएनए का एल्यूट1-10pmol; पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. आरएनए को डिनेचर करने के लिए 1 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर थर्मोसाइक्लर में इनक्यूबेट करें।
    5. मिसफोल्डिंग से बचने के लिए तुरंत एक बर्फ ब्लॉक पर रखें।
    6. आरएनए नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस पर रिफोल्डिंग बफर के साथ निर्दिष्ट ट्यूब में जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और आरएनए को फिर से मोड़ने के लिए 10-20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: अधिकांश आरएनए मिलीसेकंड से सेकंड के क्रम में फोल्ड होंगे, हालांकि अपवाद16 मौजूद हैं।
    7. आरएनए नमूने में 100% (10.5 एम) डीएमएस का 1 μL जोड़ें, और 800-1,400 रोटेशन प्रति मिनट (आरपीएम) पर हिलाते हुए 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस चरण में हिलाना (या मिश्रण के अन्य साधन) महत्वपूर्ण है क्योंकि डीएमएस हाइड्रोफोबिक है और रिफोल्डिंग बफर में पूरी तरह से भंग नहीं हो सकता है। प्रतिक्रिया समय में विचलन डीएमएस प्रतिक्रियाओं की प्रजनन क्षमता को प्रभावित कर सकता है। पाइपिंग त्रुटि को कम करने के लिए, डीएमएस को नमूने में जोड़ने से पहले 100% इथेनॉल में भंग किया जा सकता है यदि 1% (105 एमएम) डीएमएस की अंतिम एकाग्रता बनाए रखी जाती है। अनुपचारित नियंत्रण के लिए, डीएमएस को डाइमिथाइल सल्फोक्साइड (डीएमएसओ) या पानी द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।
    8. प्रतिक्रिया समय के 5 मिनट के बाद, 100% β-मर्काप्टोएथेनॉल (बीएमई) के 60 μL के साथ बुझाएं, अच्छी तरह से मिलाएं, और तुरंत बर्फ पर आरएनए रखें।
      नोट: आरएनए को साफ करने के लिए बीएमई के साथ प्रतिक्रिया को बुझाने के बाद हुड से सुरक्षित रूप से हटाया जा सकता है। हालांकि, इसकी मजबूत गंध और परेशान करने वाले गुणों के कारण परिवेश के लिए बीएमई के प्रत्यक्ष संपर्क से बचा जाना चाहिए।
    9. सोडियम एसीटेट-इथेनॉल वर्षा (चरण 2.5 देखें) या कॉलम-आधारित दृष्टिकोण (चरण 2.6 देखें) द्वारा आरएनए को साफ करें, और 10 μL पानी में एल्यूट करें।
    10. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके आरएनए की मात्रा निर्धारित करें।
    11. -80 डिग्री सेल्सियस पर संशोधित आरएनए को स्टोर करने का सीधा उपयोग।
      नोट: दीर्घकालिक भंडारण से बचा जाना चाहिए, क्योंकि डीएमएस उपचार के बाद आरएनए कम स्थिर है।
  3. संशोधित आरएनए के जीन-विशिष्ट आरटी-पीसीआर
    नोट: डीएमएस-उपचारित टुकड़ों के आरटी-पीसीआर सेटअप के लिए चित्रा 1 देखें।
    1. न्यूक्लियस-मुक्त (एनएफ) एच2ओ के 10 μL में संशोधित आरएनए के 100 एनजी को पीसीआर ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. ट्यूब में, 5x फर्स्ट स्ट्रैंड बफर (FSB) का 4 μL, dNTP मिश्रण का 1 μL (प्रत्येक 10 mM), 1 μL 0.1 M dithiothrichol (DTT) (फ्रीज-पिघलाव चक्र से बचें), RNase अवरोधक का 1 μL, 10 μM रिवर्स प्राइमर (एकल प्राइमर या प्राइमरों का एक पूल), और TGIRT III का 1 μL जोड़ें।
      नोट: प्राइमरों के पूल के लिए, प्रत्येक प्राइमर के 10 μM का 1 μL सीधे RT में न जोड़ें; इसके बजाय, प्राइमरों को पहले मिलाएं, और मिश्रण से 1 μL जोड़ें (10 μM कुल प्राइमर एकाग्रता पर)।
    3. थर्मोसाइक्लर में 30 मिनट से 1.5 घंटे के लिए 57 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (आमतौर पर, 30 मिनट 500 एनटी उत्पाद बनाने के लिए पर्याप्त है)।
    4. 4 M NaOH का 1 μL जोड़ें, पाइप द्वारा मिलाएं, और आरएनए को नीचा दिखाने के लिए 3 मिनट के लिए 95 °C पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: यह कदम महत्वपूर्ण है क्योंकि यह आरएनए को नीचा दिखाकर सीडीएनए से टीजीआरटी जारी करता है। यदि छोड़ दिया जाता है, तो डाउनस्ट्रीम पीसीआर प्रभावित हो सकता है।
    5. कॉलम-आधारित दृष्टिकोण (चरण 2.6 देखें) का उपयोग करके सफाई करें जो प्राइमरों को पर्याप्त रूप से हटा देता है, और एनएफ एच2ओ के 10 μL में एल्यूट करता है।
    6. पीसीआर-उपज और निष्ठा को संतुलित करने के लिए डिज़ाइन की गई पीसीआर किट के साथ प्रतिक्रिया के प्रति 25 μL रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पाद के 1 μL का उपयोग करके सीडीएनए को बढ़ाएं।
      नोट: प्राइमरों में ~ 60 डिग्री सेल्सियस का पिघलने का तापमान होना चाहिए।
    7. पीसीआर की सफलता को सत्यापित करने के लिए एक अगारोस जेल या प्रीकास्ट अगारोस जेल पर पीसीआर उत्पाद का 2 μL चलाएं।
    8. आदर्श रूप से, पीसीआर के बाद केवल एक बैंड दिखाया जाना चाहिए। यदि हां, तो कॉलम-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रतिक्रिया को साफ करें। यदि वैकल्पिक बैंड मौजूद हैं, तो जेल से सही बैंड को एक्साइज करने के लिए शेष पीसीआर प्रतिक्रिया का उपयोग करें। पर्याप्त रूप से छोटी मात्रा में एल्यूट (उदाहरण के लिए, 10 μL)।
    9. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके निकाले गए टुकड़ों की मात्रा निर्धारित करें।
    10. वांछित अनुक्रमण मंच के अनुकूल दृष्टिकोण का उपयोग करके अनुक्रमण के लिए डीएसडीएनए टुकड़ों को इंडेक्स करें।

Figure 1
चित्रा 1: बड़े डीएमएस-उपचारित टुकड़ों के आरटी-पीसीआर के लिए प्रायोगिक सेटअप। एक संशोधित आरएनए पर रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन करते समय, प्राइमर द्वारा किए गए अनुक्रम पर संशोधन दर्ज नहीं किए जाएंगे। इस प्रकार, जब टुकड़े लंबाई में 400-500 बीपी से अधिक होते हैं, तो प्राइमर क्षेत्रों में अतिव्यापी टुकड़े डिजाइन करने की आवश्यकता होती है, जैसा कि यहां उदाहरण दिया गया है। टुकड़ों की लंबाई अनुक्रमण आवश्यकताओं पर निर्भर करती है। युग्मित-अंत 150 चक्र अनुक्रमण का उपयोग करते समय, टुकड़े 300 बीपी से अधिक नहीं होने चाहिए। संक्षेप: आरटी-पीसीआर = रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; डीएमएस = डाइमिथाइल सल्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. वायरस से संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग करके पूरे जीनोम डीएमएस-एमएपी

नोट: कोशिकाओं में, डीएमएस उपचार को ऊपर वर्णित जीन-विशिष्ट प्रवर्धन दृष्टिकोण के साथ भी जोड़ा जा सकता है। पूरे जीनोम लाइब्रेरी को एक जीन पर पूर्ण कवरेज प्राप्त करने के लिए भारी अनुक्रमण गहराई की आवश्यकता होती है। हालांकि, यदि वायरल आरएनए निष्कर्षण के बाद राइबोडेलेटेड आरएनए का एक महत्वपूर्ण अंश बनाते हैं, तो पूरे जीनोम अनुक्रमण उपयुक्त होगा। इसके अलावा, अन्य संवर्धन विधियों को पूरे जीनोम लाइब्रेरी पीढ़ी विधि के साथ जोड़ा जा सकता है।

  1. डीएमएस उपचार
    1. संक्रमण के वांछित चरण तक वायरस से संक्रमित कोशिकाओं को विकसित करें।
    2. सेल कंटेनर को एक समर्पित फ्यूम हुड में स्थानांतरित करें जो आवश्यक जैव सुरक्षा स्तर पर दोनों वायरस और डीएमएस जैसे एजेंटों द्वारा उत्पन्न रासायनिक धुएं को संभालने के लिए उपयुक्त है।
    3. संस्कृति माध्यम में डीएमएस की 2.5% मात्रा जोड़ें, और पैराफिल्म के साथ कंटेनर (आमतौर पर 10 सेमी प्लेट) को सील करें।
      नोट: डीएमएस के साथ अंडर-मॉडिफाई और ओवर-मॉडिफाई करना आसान है। कोशिकाओं में सीधे डीएमएस जोड़ते समय, अच्छी तरह से मिश्रण करना बहुत महत्वपूर्ण है। वैकल्पिक रूप से, 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में नए माध्यम को प्रीवार्म करें, और डीएमएस को सीधे जोर से हिलाते हुए जोड़ें। कोशिकाओं पर खर्च किए गए माध्यम को निर्धारित करें, और धीरे-धीरे डीएमएस युक्त माध्यम में पिपेट करें।
    4. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
      नोट: इनक्यूबेटर के बाहर डीएमएस को संभालने में लगने वाले समय की मात्रा के आधार पर, यह संभव है कि 5 मिनट से अधिक संशोधन होगा। डीएमएस को जोड़ने से लेकर इनक्यूबेटिंग तक का समय ≤1 मिनट रखें। यदि पहली बार प्रयोग कर रहे हैं, तो डीएमएस अनुमापन करने और इष्टतम संशोधन दर खोजने के लिए इनक्यूबेशन समय (3 मिनट और 10 मिनट के बीच) को बदलने की सिफारिश की जाती है और यह सुनिश्चित किया जाता है कि परिणाम सांद्रता की खिड़की में मजबूत हैं।
    5. डीएमएस युक्त माध्यम (उचित रासायनिक अपशिष्ट में) को ध्यान से बाहर निकालें और धीरे से 10 एमएल स्टॉप बफर (30% बीएमई के साथ पीबीएस [उदाहरण के लिए, 3 एमएल बीएमई और 7 एमएल पीबीएस] जोड़ें।
      नोट: डीएमएस और बीएमई के अलावा प्लेट से कोशिकाओं को उठा सकते हैं यदि कोशिकाएं दृढ़ता से अनुयायी नहीं हैं। यदि कोशिकाएं उठा रही हैं, तो उन्हें निलंबन कोशिकाओं के रूप में माना जा सकता है- डीएमएस युक्त माध्यम को हटाने के बजाय, स्टॉप बफर को सीधे जोड़ें, और डीएमएस और बीएमई के साथ कोशिकाओं को 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्क्रैप करें। 3,000 × ग्राम पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा कोशिकाओं को गोली मार दें; किसी भी अवशिष्ट डीएमएस से छुटकारा पाना सुनिश्चित करें, जो बड़ी बूंदों में कोशिकाओं के नीचे पेलेट कर सकता है। यदि डीएमएस माध्यम को शुरू में नहीं हटाया जा सकता है तो 30% बीएमई में एक अतिरिक्त वॉश स्टेप की सिफारिश की जाती है।
    6. कोशिकाओं को खुरचें, और उन्हें 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    7. 3 मिनट के लिए 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा गोली।
    8. सतह पर तैरने वाला निकालें और 10 एमएल पीबीएस के साथ 2x धो लें।
    9. जितना संभव हो उतना अवशिष्ट पीबीएस को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    10. आरएनए अलगाव अभिकर्मक की उचित मात्रा में गोली को भंग करें (उदाहरण के लिए, टी 75 कल्चर फ्लास्क के लिए 3 एमएल, 10 सेमी प्लेट के लिए 1 एमएल)।
      नोट: अभिकर्मक की अपर्याप्त मात्रा आरएनए उपज को प्रभावित कर सकती है।
  2. आरएनए निष्कर्षण और राइबोसोमल आरएनए (आरआरएनए) की कमी
    1. आरएनए अलगाव अभिकर्मक में 1 एमएल होमोजिनाइज्ड कोशिकाओं में, 200 μL क्लोरोफॉर्म जोड़ें, चमकीले गुलाबी होने तक 15-20 सेकंड के लिए भंवर, और फिर चरण पृथक्करण दिखाई देने तक 3 मिनट तक इनक्यूबेट करें।
      नोट: गुलाबी लिपिड चरण को नीचे बसना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो भंवर समय अपर्याप्त होने की संभावना थी।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए अधिकतम गति (~ 20,000 × ग्राम) पर स्पिन करें।
    3. ऊपरी जलीय चरण को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. सोडियम एसीटेट-इथेनॉल वर्षा (चरण 2.5 देखें) या कॉलम-आधारित दृष्टिकोण (चरण 2.6 देखें) द्वारा आरएनए को साफ करें, और एनएफ एच2ओ की पर्याप्त मात्रा में एल्यूट करें।
    5. एक अगारोस जेल पर आरएनए अखंडता की जांच करें। दो राइबोसोमल सबयूनिट्स के अनुरूप दो बैंड की तलाश करें।
    6. पसंदीदा दृष्टिकोण का उपयोग करके आरआरएनए को कम करें, औरएनएफ एच 2ओ की पर्याप्त मात्रा (आमतौर पर 20-50 μL) में प्रवेश करें।
      नोट: डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, कुल आरएनए के ~ 500 एनजी को 8 μL की मात्रा में सुझाया जाता है। गैर-राइबोसोमल आरएनए आमतौर पर कुल आरएनए का केवल 5% -10% बनाते हैं।
    7. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित करें।
  3. पुस्तकालय निर्माण
    1. पुस्तकालय 15 उत्पन्न करने के लिए जीन-विशिष्ट आरटी-पीसीआर या अन्यदृष्टिकोणों का उपयोग करें। यदि प्राइमिंग के लिए यादृच्छिक हेक्सामर्स का उपयोग कर रहे हैं, तो हेक्सामर एनीलिंग की अनुमति देने के लिए कम टीएम (37-42 डिग्री सेल्सियस) पर एक इनक्यूबेशन चरण जोड़ें।
      नोट: मानक लाइब्रेरी जनरेशन किट का उपयोग आरटी एंजाइम को टीजीआईआरटी के साथ बदलकर और आरटी तापमान को 57 डिग्री सेल्सियस तक बदलकर भी किया जा सकता है।
  4. आरएनए क्लीन एंड कंसंट्रेटर कॉलम का उपयोग करके कॉलम-आधारित आरएनए क्लीनअप
    नोट: सभी चरणों को कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाना चाहिए।
    1. इसे 50 μL की मात्रा में लाने के लिए नमूना ट्यूब में NF H2O जोड़ें।
    2. नमूने में 100 μL बाइंडिंग बफर और 150 μL 100% इथेनॉल जोड़ें।
    3. एक स्पिन कॉलम में मिलाएं और स्थानांतरित करें।
    4. 30 सेकंड के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन; प्रवाह को छोड़ दें।
    5. आरएनए प्रेप बफर के 400 μL जोड़ें।
    6. 30 सेकंड के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन; प्रवाह को छोड़ दें।
    7. आरएनए वॉश बफर के 700 μL जोड़ें।
    8. 30 सेकंड के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन; प्रवाह को छोड़ दें।
    9. आरएनए वॉश बफर के 400 μL जोड़ें।
    10. 30 सेकंड के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन; प्रवाह को छोड़ दें।
    11. (वैकल्पिक) कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 2 मिनट के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन करें।
    12. कॉलम को एक साफ आरएनएस-मुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें और एनएफ एच2ओ की उचित मात्रा जोड़ें।
    13. 1 मिनट के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन करें।
  5. एसिड फिनोल-क्लोरोफॉर्म आरएनए निष्कर्षण।
    1. एसिड फिनोल की एक समान मात्रा जोड़ें: क्लोरोफॉर्म: आइसोएमिल अल्कोहल।
    2. भंवर पूरी तरह से, और 5 मिनट के लिए 14,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज।
    3. यदि कोई चरण पृथक्करण नहीं है, तो 2 M NaCl का 20 μL जोड़ें, और सेंट्रीफ्यूजेशन दोहराएं।
    4. जलीय चरण को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. आइसोप्रोपेनॉल के 500 μL और सह-प्रीसिपेटेंट के 2 μL जोड़ें।
    6. 3 मिनट के लिए आरटी पर मिलाएं और इनक्यूबेट करें; फिर, रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए अधिकतम गति (~ 20,000 × ग्राम) पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा आरएनए को पेलेट करें।
    8. पेलेट को 200 μL बर्फ-ठंडा 70% इथेनॉल के साथ धोएं।
    9. 5 मिनट के लिए अधिकतम गति (~ 20,000 × ग्राम) पर स्पिन करें; प्रवाह को छोड़ दें।
    10. एनएफ एच2ओ की उचित मात्रा में गोली को पुन: निलंबित करें।
  6. ओलिगो क्लीन और कंसंट्रेटर कॉलम का उपयोग करके कॉलम-आधारित सीडीएनए क्लीनअप
    नोट: सभी चरणों को कमरे के तापमान पर आयोजित किया जाना चाहिए।
    1. इसे 50 μL की मात्रा में लाने के लिए नमूना ट्यूब में NF H2O जोड़ें।
    2. बाइंडिंग बफर का 100 μL और 100% इथेनॉल का 400 μL जोड़ें।
    3. एक स्पिन कॉलम में मिलाएं और स्थानांतरित करें।
    4. 30 सेकंड के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन; प्रवाह को छोड़ दें।
    5. डीएनए वॉश बफर के 750 μL जोड़ें।
    6. 30 सेकंड के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन; प्रवाह को छोड़ दें।
    7. (वैकल्पिक) कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें और 2 मिनट के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन करें।
    8. कॉलम को एक साफ आरएनएस-मुक्त ट्यूब में स्थानांतरित करें, और एनएफ एच2ओ की उचित मात्रा जोड़ें।
    9. 1 मिनट के लिए 10,000-16,000 × ग्राम पर स्पिन करें।

3. अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण

नोट: DMS-MaP अनुक्रमण डेटा से RNA द्वितीयक संरचना मॉडल बनाने के लिए, परिणामी .fastq फ़ाइलों को कई अलग-अलग चरणों द्वारा संसाधित किया जाना चाहिए। इन चरणों को स्वचालित रूप से निम्न का उपयोग करके निष्पादित किया जा सकता है

  1. ट्रिमगलोर या कटएडाप्ट के साथ एडाप्टर अनुक्रमों को ट्रिम करें।
  2. Bowtie2 का उपयोग करके संदर्भ अनुक्रमों (.fasta प्रारूप) में रीड को मैप करें।
  3. विशेष आरएनए संरचना सॉफ्टवेयर (जैसे, DREEM14, RNA-Framework17, या इसी तरह) के साथ रीड की गणना करें, और प्रतिक्रियाशीलता प्रोफाइल बनाएं।
  4. (वैकल्पिक) DREEM14, DRACO17, DANCE-MaP18, या इसी तरह का उपयोग करके वैकल्पिक आरएनए अनुरूपता खोजने के लिए क्लस्टर करें।
  5. आरएनएस्ट्रक्चर12, वियना, या इसी तरह का उपयोग करके प्रतिक्रियाशीलता प्रोफाइल के आधार पर न्यूनतम मुक्त ऊर्जा संरचना की भविष्यवाणी करें।
  6. VARNA (https://varna.lri.fr/) या इसी तरह का उपयोग करके आरएनए11 संरचना की कल्पना करें।
    नोट: व्यावहारिकता के लिए, DREEM (www.rnadreem.org) और RNA-Framework19 जैसे सॉफ़्टवेयर अपनी पाइपलाइनों में चरण 1-5 को काफी हद तक शामिल करते हैं, जो विश्लेषण प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करता है। हालांकि, किसी भी संरचना की भविष्यवाणी को सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, डेटा20 के साथ संरचना के समझौते को सत्यापित करके)।

Representative Results

जीन-विशिष्ट इन विट्रो डीएमएस-एमएपी
सार्स2 के 5'यूटीआर का अध्ययन करने के लिए, वायरस के पहले 300 बीपी को तीन प्राइमरों के साथ जीब्लॉक अनुक्रम के रूप में आदेश दिया गया था। इनमें पीसीआर के माध्यम से टुकड़े ("एफडब्ल्यू" और "आरवी") का प्रचार करने के लिए दो प्राइमर शामिल थे, साथ ही टी 7 प्रोमोटर ("एफडब्ल्यू-टी 7") को संलग्न करने के लिए एक। इन अनुक्रमों को तालिका 1 में देखा जा सकता है।

नाम अनुक्रम (5'->3')
परिवार कल्याण ATTAAAGGTTTACCCCCCGGTAAC
RV GCAAACTGAGTTGGACGTGTGT
FW-T7 TAATACACTACTAGG ATTAAAGGTTTATACCCCGGTAAC

तालिका 1: सार्स-सीओवी2 5'यूटीआर के डीएमएस-एमएपी आरटी-पीसीआर के लिए प्राइमर अनुक्रम। यहां, इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन के लिए डीएनए टेम्पलेट उत्पन्न करने के लिए एफडब्ल्यू-टी 7 और आरवी की आवश्यकता होती है, आरवी का उपयोग रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन में किया जाता है और एफडब्ल्यू-आरवी प्राइमर-जोड़ी का उपयोग सीडीएनए के बाद के पीसीआर प्रवर्धन में किया जाता है। प्राइमर सार्स-सीओवी2 जीनोम (एफडब्ल्यू) की शुरुआत और रुचि के क्षेत्र के ठीक नीचे के क्रम को दर्शाते हैं। संक्षेप: डीएमएस-एमएपी = डाइमिथाइल सल्फेट का उपयोग करके अनुक्रमण के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग; आरटी-पीसीआर = रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; सार्स-सीओवी2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम-कोरोनावायरस 2; यूटीआर = अअनुवादित क्षेत्र; आरवी = रिवर्स प्राइमर; एफडब्ल्यू = फॉरवर्ड प्राइमर।

जीबीलॉक टुकड़े से आरएनए उत्पन्न करने के लिए, टी 7 पोलीमरेज़ प्रोमोटर के अनुक्रम को चित्रा 2 ए में देखी गई योजना के अनुसार पीसीआर प्रीमिक्स का उपयोग करके ओवरलैप पीसीआर का उपयोग करके संलग्न किया गया था। लम्बी टुकड़े से, टी 7 ट्रांसक्रिप्शन किट का उपयोग करके आरएनए उत्पन्न किया गया था। डीएनए टेम्पलेट को बाद में आरएनए क्लीन एंड कंसंट्रेटर कॉलम का उपयोग करके अलग किए गए डीएनए और आरएनए का उपयोग करके पचाया गया था।

इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन का गुणवत्ता नियंत्रण आरएनए उत्पाद को एसएसआरएनए सीढ़ी के साथ 1% अगारोस जेल पर चलाकर किया गया था। चूंकि केवल एक बैंड दिखाई दे रहा था, इन विट्रो डीएमएस जांच और आरटी-पीसीआर का प्रदर्शन किया गया (चित्रा 2 बी देखें)।

पीसीआर प्रतिक्रिया की सफलता को सत्यापित करने के लिए, नमूना डीएसडीएनए सीढ़ी का उपयोग करके 2% अगारोस जेल पर चलाया गया था। इंडेक्सिंग के बाद, बैंड को एक ही जेल पर ~ 150 बीपी अधिक चलना चाहिए, जो इंडेक्सिंग प्राइमरों के आकार के लिए जिम्मेदार है।

Figure 2
चित्रा 2: डीएनए टेम्पलेट का इन विट्रो ट्रांसक्रिप्शन। (ए) इन विट्रो में एक डीएनए टेम्पलेट को स्थानांतरित करने के लिए जिसमें अभी तक आंतरिक आरएनए पोलीमरेज़ प्रोमोटर नहीं है, टेम्पलेट को पहले ओवरलैप पीसीआर द्वारा संलग्न किया जाना चाहिए। यह एक फॉरवर्ड प्राइमर का उपयोग करके किया जाता है, जिसमें वांछित टुकड़े के साथ अतिव्यापी पहले बेस के ऊपर अनुक्रम TAATACGACTATAGG (T7 आरएनए पोलीमरेज़ के मामले में) शामिल है। यहां रेखांकित आधार पोलीमरेज़ की प्रतिलेखन प्रारंभ साइट का प्रतीक है। एक बार प्रमोटर डीएसडीएनए टुकड़े से जुड़ जाता है, तो इसे टी 7 पोलीमरेज़ द्वारा स्थानांतरित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, पोलीमरेज़ टेम्पलेट (नीले) के रूप में उल्लिखित प्रमोटर अनुक्रम के विपरीत स्ट्रैंड का उपयोग करता है, प्रभावी रूप से संकेतित प्रमोटर अनुक्रम (लाल) के तुरंत नीचे अनुक्रम के समान आरएनए बनाता है। (बी) एसएसआरएनए लैडर (लेन 1) के साथ एक 1% अगारोस जेल और 300 एनटी (लेन 2) पर इन विट्रो ट्रांसक्रिप्टेड आरएनए उत्पाद। (सी) जीनरूलर 1 केबी प्लस लैडर (लेन 1) के साथ 2% अगारोस जेल, आरटी-पीसीआर के बाद पीसीआर उत्पाद 300 बीपी (लेन 2) पर चल रहा है, और लाइब्रेरी तैयारी के बाद अनुक्रमित टुकड़ा 470 बीपी (लेन 3) पर चल रहा है। संक्षेप: आरटी-पीसीआर = रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन; डीएमएस = डाइमिथाइल सल्फेट; एनटी = न्यूक्लियोटाइड; डीएसडीएनए = डबल-फंसे हुए डीएनए; एसएसआरएनए = एकल-फंसे आरएनए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वायरस-संक्रमित कोशिकाओं का उपयोग करके विवो डीएमएस-एमएपी में संपूर्ण जीनोम
डीएमएस उपचार से पहले, एचसीटी -8 कोशिकाएं ओसी 43 से संक्रमित थीं। जब संक्रमण (डीपीआई) के 4 दिन बाद साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) देखा गया था (जैसा कि चित्रा 3 ए में देखा गया है), तो इन कोशिकाओं का इलाज किया गया था, और आरएनए को निकाला गया था और राइबोडेल किया गया था। एक अगारोस जेल पर कुल आरएनए चलाते समय, दो उज्ज्वल बैंड दिखाई दे रहे थे, जो राइबोसोम के 40 एस और 60 एस सबयूनिट्स के लिए जिम्मेदार थे, जो कुल आरएनए द्रव्यमान का लगभग 95% बनाते हैं ( चित्रा 3 बी देखें)। जब आरएनए निष्कर्षण असफल रहा या अवक्रमित हो गया (उदाहरण के लिए, कई फ्रीज-पिघलाव चक्रों द्वारा), आरएनए अवक्रमण उत्पाद जेल के तल पर दिखाई दे रहे थे ( चित्रा 3 सी, दूसरी लेन देखें)। इसके अलावा, आरआरएनए की कमी के बाद, दो उज्ज्वल बैंड गायब हो गए, जिससे लेन में एक धब्बा रह गया ( चित्रा 3 सी, तीसरी लेन देखें)। अंत में, पुस्तकालय की तैयारी के बाद, नमूनों में अलग-अलग आकार का वितरण था और अंतिम पेज जेल पर स्मीयर के रूप में दिखाया गया था। इन पुस्तकालयों का विश्लेषण करने के लिए नियोजित 150 x 150 युग्मित-अंत अनुक्रमण रन के साथ समझौते में बैंड को 200 न्यूक्लियोटाइड (एनटी) और 500 एनटी के बीच उत्पादित किया गया था। सबसे महत्वपूर्ण बात, ~ 150 एनटी पर चलने वाले एडाप्टर डिमर को अलग कर दिया गया था ( चित्रा 3 डी देखें)।

Figure 2
चित्रा 3: वायरस संक्रमित कोशिकाओं के साथ विवो डीएमएस-एमएपी की चौकियां। (ए) वायरस से संक्रमित एचसीटी -8 कोशिकाओं की प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि, 4 दिन डीपीआई। सेल मृत्यु के कारण प्रतिकूल प्रभावों को कम करते हुए कुल आरएनए से वायरल आरएनए की उच्चतम संभव उपज प्राप्त करने के लिए, डीएमएस को सीपीई शुरू होने पर या उससे पहले भी जोड़ा जाना चाहिए, जैसा कि छवि में देखा गया है। (बी) कुल आरएनए के 1 μg के छह नमूनों के साथ एक 1% अगारोस जेल। प्रत्येक लेन में, दो उज्ज्वल बैंड, जो 40 एस और 60 एस सबयूनिट्स के लिए जिम्मेदार हैं, दिखाई देते हैं, क्योंकि राइबोसोमल आरएनए कुल आरएनए का ~ 95% बनाता है। नोट: इन-सेल डीएमएस उपचार कुछ आरएनए विखंडन और स्मीयरिंग का कारण बनता है, लेकिन दो आरआरएनए बैंड अभी भी दिखाई देने चाहिए। संशोधन के बाद हल्के विखंडन को सहन किया जाता है क्योंकि मिथाइलेशन चिह्न युक्त जानकारी उत्पन्न होती है और डीएमएस के दौरान आरएनए संरचना पर रिपोर्ट की जाती है इनक्यूबेशन जबकि कोशिकाएं अभी भी जीवित हैं। (सी) जीनरूलर 1 केबी प्लस लैडर डीएनए मार्कर (लेन 1) कुल आरएनए का 1% अगारोस जेल पहले 6 महीने (लेन 2) के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था और राइबोडेलेटेड आरएनए (लेन 3)। कई फ्रीज-पिघलाव चक्रों के साथ लंबे समय तक आरएनए को संग्रहीत करते समय, आरएनए खराब होने लगता है और संभवतः प्रयोगों की जांच के लिए उपयोग नहीं किया जाना चाहिए। इसके अलावा, कुल आरएनए को रिबोड करने के बाद, राइबोसोम के 40 एस और 60 एस सबयूनिट्स के लिए जिम्मेदार दो उज्ज्वल बैंड, फीके हो जाते हैं, और अवशिष्ट आरएनए का एक धब्बा दिखाई देने लगता है। (डी) जीनरूलर 1 केबी प्लस लैडर डीएनए मार्कर (लेन 1) का एक पेज जेल और पूरे जीनोम तैयार आरएनए का एक पुस्तकालय नमूना। अनुक्रमण आवश्यकताओं के आधार पर जेल का उत्पादन किया जाना चाहिए। दोनों तरफ से 150 चक्रों में फैले युग्मित-अंत अनुक्रमण रन के लिए, जेल को 300 बीपी और 500 बीपी के बीच उत्पादित किया जाना चाहिए। एडाप्टर डिमर (170 बीपी पर चल रहे) को अलग किया जाना चाहिए। संक्षेप: डीएमएस-एमएपी = डाइमिथाइल सल्फेट का उपयोग करके अनुक्रमण के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग; डीपीआई = संक्रमण के बाद के दिन; सीपीई = साइटोपैथिक प्रभाव। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुक्रमण के बाद, .fastq फ़ाइलों का विश्लेषण DREEM वेबसर्वर (http://rnadreem.org/) को एक नौकरी सबमिट करके किया गया था, साथ में .fasta संदर्भ फ़ाइल के साथ। सर्वर द्वारा उत्पन्न आउटपुट में फास्टक्यूसी (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) और ट्रिमगलोर (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/) द्वारा उत्पन्न गुणवत्ता नियंत्रण फाइलें शामिल हैं, साथ ही जनसंख्या औसत उत्परिवर्तन आवृत्तियों वाली अन्य आउटपुट फाइलें भी शामिल हैं। एक इंटरैक्टिव .html (चित्रा 4 ए देखें) प्रारूप के साथ उत्परिवर्तन आवृत्तियों को दिखाने वाले आरेख के अलावा और प्रति बेस कच्चे प्रतिक्रियात्मक और एक struct_constraint.txt फ़ाइल के साथ एक .csv फ़ाइल, जो कई आरएनए संरचना भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर द्वारा पठनीय है, इसमें बाय-रीड म्यूटेशन पर एक बिटवेक्टर.txt फ़ाइल रिपोर्टिंग भी शामिल है। इनमें से, जनसंख्या औसत संरचनाओं की गणना .fasta और struct_constraint.txt फ़ाइलों को RNAफोल्ड वेबसर्वर (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi) में जमा करके की गई थी। यह न्यूनतम मुक्त ऊर्जा के आधार पर संरचना भविष्यवाणियां उत्पन्न करने के लिए वियनाआरएनए सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है, जिसे सीटी या वियना प्रारूप में ऑनलाइन देखा या डाउनलोड किया जा सकता है। आरएनए संरचना मॉडल उत्पन्न करने के लिए, इन डाउनलोड करने योग्य फ़ाइलों को VARNA (https://varna.lri.fr/, चित्रा 4B देखें) को प्रस्तुत किया गया था। अंत में, वैकल्पिक आरएनए अनुरूपता की खोज के लिए डीआरईईएम (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) के स्थिर संस्करण द्वारा बिटवेक्टर.txt फ़ाइलों का उपयोग किया जा सकता है। DREEM का उपयोग करके अच्छी संरचना मॉडल प्राप्त करने के लिए, प्रति आधार 10,000 रीड का कवरेज प्राप्त किया जाना चाहिए; क्लस्टरिंग के लिए, प्रति आधार 100,000 रीडिंग की आवश्यकता हो सकती है। पूरे वर्कफ़्लो का अवलोकन चित्रा 4 सी में पाया जा सकता है।

Figure 4
चित्र 4: सार्स-सीओवी2 5'यूटीआर के रासायनिक जांच प्रयोगों से प्राप्त अनुकरणीय डेटा (ए) सार्स-सीओवी2 जीनोम के पहले 300 बेस की प्रतिक्रियाशीलता प्रोफाइल आधार (ए: लाल, सी: नीला, यू: हरा, जी: पीला) द्वारा रंगीन है। कच्ची प्रतिक्रियाओं की गणना कवरेज द्वारा विभाजित पूर्ण उत्परिवर्तन आवृत्ति के रूप में की जाती है। खुले अनुरूपता वाले आधारों में उच्च प्रतिक्रिया मूल्य होते हैं; बेस-पेयरिंग में संलग्न बेस में कम प्रतिक्रियाशीलता मान होते हैं। आप और जी डीएमएस द्वारा संशोधित नहीं होते हैं और पोलीमरेज़ बेवफाई से उत्पन्न होने वाले कम प्रतिक्रियाशीलता मान होते हैं। भविष्यवाणियां DREEM वेबसर्वर के साथ की गई थीं। (ख) सार्स-सीओवी2 5'यूटीआर के संरचना मॉडल की भविष्यवाणी वीएआरएनए के साथ किए गए प्रतिक्रियाशीलता मूल्यों से की गई है। उच्च प्रतिक्रिया मूल्यों वाले आधार लाल रंग में रंगीन होते हैं; कम प्रतिक्रियाशीलता मूल्यों वाले आधार सफेद रंग में रंगीन होते हैं। (सी) अनुक्रमण से प्राप्त .fastq फ़ाइलों से शुरू होने वाले DMS-MaP विश्लेषण का वर्कफ़्लो। इन्हें फास्टक्यूसी का उपयोग करके गुणवत्ता-नियंत्रित किया जा सकता है; एडाप्टर अनुक्रमों को TrimGalore का उपयोग करके छंटनी की जाती है और फिर Bowtie2 का उपयोग करके एक संदर्भ अनुक्रम में वापस मैप किया जाता है। प्राप्त .bam फ़ाइलों से, DREEM प्रत्येक पठन में उत्परिवर्तन की गणना करता है, जिससे उत्परिवर्तन मानचित्र या .bitvector.txt फ़ाइल बनती है। ये प्रत्येक रीड के उत्परिवर्तन को स्थिति-निर्भर तरीके से रिपोर्ट करते हैं, जिसके आधार पर जनसंख्या औसत प्रतिक्रिया प्रोफाइल बनाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वैकल्पिक आरएनए अनुरूपता की खोज के लिए डीआरईईएम का उपयोग करके बिटवैक्टर को क्लस्टर किया जा सकता है। अंत में, प्राप्त संरचना मॉडल को सॉफ्टवेयर (जैसे, VARNA) का उपयोग करके कल्पना की जाती है। संक्षेप: डीएमएस-एमएपी = डाइमिथाइल सल्फेट का उपयोग करके अनुक्रमण के साथ म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग; सार्स-सीओवी2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम-कोरोनावायरस 2. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यहां प्रोटोकॉल बताता है कि डीएमएस म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग प्रयोगों का उपयोग करके विट्रो और कोशिकाओं में आरएनए की जांच कैसे करें। इसके अलावा, यह जीन-विशिष्ट डेटा उत्पन्न करने और प्राप्त .fastq फ़ाइलों का विश्लेषण करने के लिए इलुमिना अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों को तैयार करने के निर्देश देता है। इसके अतिरिक्त, जीनोम-वाइड लाइब्रेरी दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, जीन-विशिष्ट आरटी-पीसीआर उच्चतम गुणवत्ता और सबसे मजबूत डेटा का उत्पादन करता है। इसलिए, यदि नमूनों के बीच तुलना की जाती है, तो यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि वे समान अनुक्रमण रणनीतियों के साथ तैयार हैं, क्योंकि पुस्तकालय पीढ़ी कुछ पूर्वाग्रह का कारण बनती है। प्रजनन क्षमता को हमेशा प्रतिकृति का उपयोग करके मापा जाना चाहिए।

कई सावधानियां
आरएनए एक अस्थिर अणु है जो ऊंचे तापमान और आरएनएस दोनों के माध्यम से गिरावट के प्रति संवेदनशील है। इसलिए, विशेष उपायों - व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई), आरएनएस-मुक्त सामग्री और आरएनएस अवरोधकों का उपयोग - की सिफारिश की जाती है। सबसे महत्वपूर्ण बात, आरएनए को जब भी संभव हो बर्फ पर रखा जाना चाहिए। यह विशेष रूप से मिथाइलेटेड आरएनए पर लागू होता है, जो उच्च तापमान के प्रति और भी अधिक संवेदनशील है।

यह पुष्टि करना महत्वपूर्ण है कि ब्याज की आरएनए संरचना डीएमएस एकाग्रता और बफर स्थितियों के प्रति संवेदनशील नहीं है। पीएच 7-7.5 पर 100 एमएम ट्राइस, 100 एमएम एमओपीएस और 100 एमएम एचईपीईएस जैसे बफर एक उच्च संकेत देते हैं लेकिन प्रतिक्रिया21 के दौरान पीएच को बनाए रखने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकते हैं। जैसा कि डीएमएस पानी में हाइड्रोलाइज करता है, जो पीएच को कम करता है, संशोधन प्रतिक्रिया के दौरान तटस्थ पीएच बनाए रखने के लिए एक मजबूत बफर महत्वपूर्ण है। बाइसीन के अतिरिक्त पीएच को थोड़ा बुनियादी 21 के रूप में बनाए रखने में मदद करने के लिए दिखाया गया है, लेकिनइसके परिणामस्वरूप जीएस और यूएस पर कम डीएमएस संशोधन होता है, जो सूचनात्मक हो सकता है लेकिन एएस और सीएस की तुलना में बहुत कम सिग्नल के उत्पादन के कारण अलग से विश्लेषण किया जाना चाहिए और इस प्रोटोकॉल में आगे चर्चा नहीं की गई है।

जीन-विशिष्ट आरटी-पीसीआर में, संशोधित आरएनए को डीएनए में रिवर्स-ट्रांसक्रिप्ट किया जाता है और पीसीआर द्वारा टुकड़ों में प्रवर्धित किया जाता है। जबकि आरएनए का आकार सैद्धांतिक रूप से असीमित हो सकता है, इन पीसीआर टुकड़ों को रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रतिक्रिया के दौरान पूर्वाग्रह को रोकने के लिए 400-500 बेस जोड़े (बीपी) की लंबाई से अधिक नहीं होना चाहिए। आदर्श रूप से, टुकड़े अनुक्रमण रन के दायरे में होने चाहिए (यानी, यदि अनुक्रमण 150 x 150 चक्र युग्मित-अंत अनुक्रमण कार्यक्रम का उपयोग करके आयोजित किया जाता है, तो एक एकल टुकड़ा 300 बीपी से अधिक नहीं होना चाहिए)। कम चक्रों के साथ अनुक्रमण कार्यक्रमों का उपयोग करते समय, पीसीआर उत्पादों को डीएसडीनेस का उपयोग करके खंडित किया जा सकता है। इसके अलावा, चूंकि प्राइमर अनुक्रमों के भीतर अनुक्रम कोई संरचनात्मक जानकारी नहीं रखते हैं, इसलिए जब जांच किए गए आरएनए में >1 टुकड़ा होता है तो टुकड़े ओवरलैप होना चाहिए। आरटी प्रतिक्रियाओं में विभिन्न टुकड़ों (10 अलग-अलग आरटी प्राइमरों तक) के लिए कई आरटी प्राइमर हो सकते हैं। अनुक्रमों के आधार पर, आरटी प्राइमरों को पूल करना रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन को कम कुशल बना सकता है लेकिन आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है। प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया अलग से आयोजित की जानी चाहिए।

डीएमएस के साथ आरएनए की जांच करते समय, प्रयोगात्मक स्थितियां एक अतिरिक्त भूमिका निभाती हैं, क्योंकि कई आरएनए थर्मोडायनामिक रूप से अस्थिर होते हैं और तापमान जैसे पर्यावरणीय कारकों के आधार पर अपनी रचना को बदलते हैं। अनियमितताओं से बचने के लिए, प्रयोगात्मक स्थितियों को यथासंभव स्थिर रखा जाना चाहिए, प्रतिक्रिया समय के संबंध में भी। बफर स्थितियां 17,20,22,23 की एक निश्चित डिग्री तक विनिमेय प्रतीत होती हैं जब बुनियादी स्थितियों को बनाए रखा जाता है - बफरिंग क्षमता और मोनोवेलेंट (एनए) और डाइवेलेंट आयनों (एमजी) की उपस्थिति - आरएनए24 की उचित तह सुनिश्चित करने के लिए।

संशोधित आरएनए की पुस्तकालय तैयारी के संबंध में, कई पहलुओं को ध्यान में रखा जाना चाहिए। सबसे पहले, जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, संशोधित आरएनए अपने असंशोधित समकक्षों की तुलना में कम स्थिर हैं, जिसका अर्थ है कि उन्हें इष्टतम टुकड़ा आकार वितरण के लिए विखंडन समय के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, कुछ आरएनए लाइब्रेरी तैयारी किट, साथ ही कई अन्य आरएनएसेक दृष्टिकोण, रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन किट में यादृच्छिक प्राइमरों का उपयोग करते हैं। इससे संदर्भ का कम कवरेज हो सकता है, विशेष रूप से जीन के 3 ' में, और, अंततः, अपर्याप्त कवरेज गहराई तक। यदि किसी निश्चित क्षेत्र का कवरेज बहुत कम है, तो संरचना की भविष्यवाणी से उन आधारों को हटाना आवश्यक हो सकता है। आरटी-पीसीआर और पूरे जीनोम आरएनएसेक किट के अलावा, अन्य पुस्तकालय तैयारी दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल जिसमें आरएनए के लिए 3 ' और / या 5 ' एडाप्टर का बंधाव शामिल है, आरएनए के छोटे टुकड़ों का उपयोग करते समय फायदेमंद होते हैं या जब प्राइमर क्षेत्रों में जांच जानकारी के नुकसान से बचा जाना चाहिए।

अंत में, रासायनिक जांच प्रयोगों के विश्लेषण को हमेशा सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए। वर्तमान में, ऐसा कोई सॉफ्टवेयर नहीं है जो उच्च सटीकता के साथ अकेले अनुक्रम से किसी भी आरएनए की आरएनए संरचना की भविष्यवाणी करता है। यद्यपि रासायनिक जांच बाधाएं सटीकता में काफी सुधार करती हैं, लंबे आरएनए (>500 एनटी) के लिए अच्छे मॉडल उत्पन्न करना अभी भी चुनौतीपूर्ण है। इन मॉडलों को अन्य दृष्टिकोणों और / या म्यूटेनेसिस द्वारा आगे परीक्षण किया जाना चाहिए। आरएनए पूर्वानुमान सॉफ्टवेयर बेस जोड़े की अधिकतम संख्या के लिए अनुकूलन करता है, इस प्रकार खुले अनुरूपण को काफी दंडित करता है, जो आरएनए फोल्डिंग5 का सटीक प्रतिनिधित्व नहीं कर सकता है। इस प्रकार, प्राप्त संरचना मॉडल का परीक्षण अंतर्निहित रासायनिक जांच डेटा (जैसे, AUROC द्वारा) और प्रतिकृतियों (जैसे, एमएफएमआई द्वारा) के साथ भविष्यवाणी समझौते को निर्धारित करके किया जाना चाहिए, जैसा कि लैन एट अल.20 द्वारा उदाहरण दिया गया है।

आदर्श रूप से, प्राप्त संरचना मॉडल को चुनौती देने के लिए विभिन्न प्रणालियों में कई प्रयोगों का उपयोग किसी की परिकल्पना को मजबूत करने के लिए किया जाना चाहिए। इनमें इन विट्रो और इन-सेल दृष्टिकोण, प्रतिपूरक उत्परिवर्तन और विभिन्न सेल लाइनों और प्रजातियों का उपयोग शामिल हो सकता है। इसके अलावा, कच्ची प्रतिक्रियाएं अक्सर संरचना की भविष्यवाणियों की तुलना में अधिक या अधिक जानकारीपूर्ण होती हैं, क्योंकि वे आरएनए फोल्डिंग पहनावा के "जमीनी सच्चाई" स्नैपशॉट को रिकॉर्ड करते हैं। जैसे, विभिन्न स्थितियों के बीच संरचना परिवर्तनों की तुलना करने के लिए कच्ची प्रतिक्रियाएं बहुत उपयुक्त और सूचनात्मक हैं। महत्वपूर्ण रूप से, कम्प्यूटेशनल भविष्यवाणी के साथ रासायनिक जांच बाधाओं का उपयोग करके गणना की गई सबसे कम मुक्त ऊर्जा संरचनाओं का उपयोग केवल एक पूर्ण संरचना मॉडल की ओर एक प्रारंभिक परिकल्पना के रूप में किया जाना चाहिए।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

कोई नहीं

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 Kb Plus DNA Ladder 10787018 Thermo
2-mercaptoethanol M6250-250ML Sigma
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 AM9720 Thermo
Advantage PCR 639206 Takara
CloneAmp HiFi PCR Premix 639298 Takara
DMS D186309
 		 Sigma
dNTPs 10 mM each U151B Promega
E-Gel EX Agarose Gels, 2% G402022 Thermo precast agarose gels
Ethanol (200 proof) E7023-4X4L Sigma
Falcon tubes, 15 mL, 50 mL
GlycoBlue co-precipitant
HCT-8 cells  ATCC #CCL-244
Invitrogen MgCl2 (1 M) AM9530G fisherscientific
Isopropanol 278475 Sigma
Megascript T7 transcription AM1334 Thermo
NanoDrop spectrophotometer
Novex TBE Gels, 8%, 10 well EC6215BOX Thermo
OC43  ATCC #VR-1558
RiboRuler Low Range RNA Ladder SM1831 Thermo
RNAse H M0297L NEB
Sodium Cacodylate, 0.4 M, pH 7.2 102090-964 VWR
Sodium hydroxide solution S8263-150ML Sigma
SuperScript II Reverse Transcriptase for FSB and DTT 18064014 Thermo
TGIRT-III Enzyme TGIRT50 Ingex
The Oligo Clean & Concentrator D4060 Genesee
The RNA Clean & Concentrator kits are RNA clean up kits R1016 Genesee
TRIzol Reagents 15596018 Thermo RNA isolation reagent
Water, (For RNA Work) (DEPC-Treated, DNASE, RNASE free/Mol. Biol.) BP561-1 fisherscientific
xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn 10009865 IDT
Zymo RNA clean and concentrator columns

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, S. H., et al. Three-dimensional tertiary structure of yeast phenylalanine transfer RNA. Science. 185 (4149), 435-440 (1974).
  2. Robertus, J. D., et al. Structure of yeast phenylalanine tRNA at 3 Å resolution. Nature. 250 (467), 546-551 (1974).
  3. Zaug, A. J., Cech, T. R. In vitro splicing of the ribosomal RNA precursor in nuclei of Tetrahymena. Cell. 19 (2), 331-338 (1980).
  4. Zhao, Y., et al. NONCODE 2016: An informative and valuable data source of long non-coding RNAs. Nucleic Acids Research. 44, D203-D208 (2016).
  5. Vandivier, L. E., Anderson, S. J., Foley, S. W., Gregory, B. D. The conservation and function of RNA secondary structure in plants. Annual Review of Plant Biology. 67, 463 (2016).
  6. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  7. Das, R. RNA structure: A renaissance begins. Nature Methods. 18 (5), 439-439 (2021).
  8. Smola, M. J., Rice, G. M., Busan, S., Siegfried, N. A., Weeks, K. M. Selective 2′-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis. Nature Protocols. 10 (11), 1643-1669 (2015).
  9. Mathews, D. H., et al. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7287-7292 (2004).
  10. Zuker, M., Stiegler, P. Optimal computer folding of large RNA sequences using thermodynamics and auxiliary information. Nucleic Acids Research. 9 (1), 133-148 (1981).
  11. Lorenz, R., et al. ViennaRNA Package 2.0. Algorithms for Molecular Biology. 6, (2011).
  12. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11, (2010).
  13. Wells, S. E., Hughes, J. M. X., Igel, A. H., Ares, M. Use of dimethyl sulfate to probe RNA structure in vivo. Methods in Enzymology. , 479-493 (2000).
  14. Tomezsko, P. J., et al. Determination of RNA structural diversity and its role in HIV-1 RNA splicing. Nature. 582 (7812), (2020).
  15. Zubradt, M., et al. DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo. Nature Methods. 14 (1), (2017).
  16. Woodson, S. A. Compact intermediates in RNA folding. Annual Reviews in Biophysics. 39, (2010).
  17. Morandi, E., et al. Genome-scale deconvolution of RNA structure ensembles. Nature Methods. 18 (3), 249-252 (2021).
  18. Olson, S. W., et al. Discovery of a large-scale, cell-state-responsive allosteric switch in the 7SK RNA using DANCE-MaP. Molecular Cell. 82 (9), 1708-1723 (2022).
  19. Incarnato, D., Morandi, E., Simon, L. M., Oliviero, S. RNA Framework: An all-in-one toolkit for the analysis of RNA structures and post-transcriptional modifications. Nucleic Acids Research. 46 (16), (2018).
  20. Lan, T. C. T., et al. Secondary structural ensembles of the SARS-CoV-2 RNA genome in infected cells. Nature Communications. 13 (1), 1128 (2022).
  21. Homan, P. J., et al. Single-molecule correlated chemical probing of RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (38), 13858-13863 (2014).
  22. Yang, S. L., et al. Comprehensive mapping of SARS-CoV-2 interactions in vivo reveals functional virus-host interactions. Nature Communications. 12 (1), 5113 (2021).
  23. Manfredonia, I., et al. Genome-wide mapping of SARS-CoV-2 RNA structures identifies therapeutically-relevant elements. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12436-12452 (2020).
  24. Fischer, N. M., Polěto, M. D., Steuer, J., vander Spoel, D. Influence of Na+ and Mg2+ ions on RNA structures studied with molecular dynamics simulations. Nucleic Acids Research. 46 (10), 4872-4882 (2018).

Tags

जैव रसायन अंक 190
विट्रो और कोशिकाओं <em>में</em> अनुक्रमण के साथ डाइमिथाइल सल्फेट म्यूटेशनल प्रोफाइलिंग के साथ आरएनए संरचना की जांच
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dülk, S. L., Rouskin, S.… More

Dülk, S. L., Rouskin, S. Probing RNA Structure with Dimethyl Sulfate Mutational Profiling with Sequencing In Vitro and in Cells. J. Vis. Exp. (190), e64820, doi:10.3791/64820 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter