Summary
편광된 단일 세포의 세포 내 역학을 분석하는 현재의 방법은 종종 수동이며 표준화가 부족합니다. 이 원고는 사용자 친화적인 온라인 인터페이스에서 단일 편광 세포의 정중선 추출을 자동화하고 시간 경과로 인한 시공간 거동을 정량화하기 위한 새로운 이미지 분석 파이프라인을 소개합니다.
Abstract
세포 극성은 공간적으로 집중된 분자와 구조의 집합에 의해 확립된 거시적 현상으로, 세포 내 수준에서 특수 영역의 출현으로 절정에 이릅니다. 이는 세포 분열, 성장 및 이동과 같은 주요 생물학적 기능의 기초가 되는 비대칭 형태학적 구조 개발과 관련이 있습니다. 또한 세포 극성의 파괴는 암 및 위 이형성증과 같은 조직 관련 장애와 관련이 있습니다.
개별 편광 세포에서 형광 리포터의 시공간 역학을 평가하는 현재 방법은 종종 세포의 장축을 따라 정중선을 추적하는 수동 단계를 포함하며, 이는 시간이 많이 걸리고 강한 편향이 발생하기 쉽습니다. 또한 비율계량 분석은 두 개의 형광 채널을 사용하여 리포터 분자의 불균일한 분포를 보정할 수 있지만 배경 빼기 기술은 종종 임의적이며 통계적 지원이 부족합니다.
이 원고는 세포 극성 모델(꽃가루관/뿌리 모발 성장 및 세포질 이온 역학)을 사용하여 단일 세포의 시공간 거동을 자동화하고 정량화하는 새로운 계산 파이프라인을 소개합니다. 비율계량 이미지를 처리하고 세포 내 역학 및 성장의 정량적 표현을 추출하기 위해 3단계 알고리즘이 개발되었습니다. 첫 번째 단계는 배경에서 셀을 분할하여 픽셀 강도 공간에서 임계값 기술을 통해 이진 마스크를 생성합니다. 두 번째 단계는 스켈레톤화 작업을 통해 셀의 정중선을 통과하는 경로를 추적합니다. 마지막으로, 세 번째 단계는 처리된 데이터를 비율계량 타임랩스로 제공하고 비율계량 카이모그래프(즉, 시간 경과에 따른 1D 공간 프로파일)를 생성합니다. 성장하는 꽃가루 튜브에서 유전적으로 인코딩된 형광 리포터로 획득한 비율계량 이미지의 데이터를 사용하여 이 방법을 벤치마킹했습니다. 이 파이프라인은 편광된 세포의 정중선을 따라 시공간 역학을 더 빠르고 덜 편향되고 정확하게 표현할 수 있도록 하여 세포 극성을 조사하는 데 사용할 수 있는 정량적 툴킷을 발전시킵니다. AMEBaS Python 소스 코드는 다음에서 사용할 수 있습니다 https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
세포 극성(cell polarity)은 공간적으로 집중된 분자 및 구조의 집합체의 일치된 작용이 특화된 형태학적 세포 내 도메인(subcellular domain)의 확립으로 절정에 이르는 기본적인 생물학적 과정이다1. 세포 분열, 성장 및 이동은 이러한 극성 부위에 의존하며, 그 손실은 상피 조직 관련 질환에서 암과 관련이 있습니다2.
정점으로 성장하는 세포는 극성의 극적인 예로, 끝부분의 극성 부위가 일반적으로 세포외 신호로 방향을 바꾼다3. 여기에는 신경돌기, 곰팡이 균사, 뿌리 털 및 꽃가루 튜브가 발달하는 것이 포함되며, 여러 세포 과정이 세포 끝에서 정강이를 향해 뚜렷한 차이를 보입니다. 특히 꽃가루 튜브에서는 액틴 중합, 소포 이동, 이온 농도가 현저하게 분극되어 팁에 초점을 맞춘 구배를 나타낸다4. 꽃가루 튜브는 현화 식물의 수컷 생식 식물이며 단일 세포로 알려진 가장 빠른 성장 속도 중 하나로 세포의 정점에서만 성장하여 정자 세포를 난자에 전달하는 역할을합니다. 칼슘 5 (Ca2 +) 및 양성자 6 (H +)과 같은 이온의 팁 중심 구배는 꽃가루 튜브 성장을 유지하는 데 중요한 역할을하며, 이는 이중 수정으로 절정에 이르는 주요 생물학적 기능을 달성하는 데 필수적입니다 5,6. 따라서, 정점으로 성장하는 세포의 정중선을 따라 시공간 역학을 분석하는 정량적 방법은 편광 성장의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 데 필수적입니다 7,8,9. 연구자들은 종종 kymographs, 즉 시간(예: 행)에 따른 세포 정중선(예: 열)의 픽셀 강도를 나타내는 행렬을 사용하여 대각선에서 세포 성장과 이동을 시각화할 수 있습니다(그림 1). 유용함에도 불구하고 카이모그래프는 정중선을 수동으로 추적하여 추출하는 경우가 많으며 편향과 인적 오류가 발생하기 쉽고 다소 힘들기도 합니다. 이를 위해서는 AMEBaS라고 명명된 파이프라인의 첫 번째 특징인 정중선 추출의 자동화된 방법이 필요합니다: 편광 단일 셀의 비율계량 형광 타임 랩스의 자동 Midline Extraction 및 Background Subtraction.
실험 절차의 관점에서, 단일 세포에서 관심있는 이온/분자/종의 정량적 이미징은 유전적으로 인코딩된 형광 프로브(10)를 사용하여 달성할 수 있습니다. 계속 확장되고 있는 선택의 폭에서, 비율계량 프로브는 관심 분자에 결합/결합되지 않을 때 서로 다른 형광 파장을 방출하기 때문에 가장 정확한 것중 하나입니다 11. 이를 통해 프로브의 세포 내 농도에서 공간적 이질성을 보정할 수 있으며, 채널 특이적 배경을 뺀 두 채널의 비율을 사용할 수 있습니다. 그러나 각 채널 및 시점에 대한 배경 임계값을 추정하는 것은 이미지의 모서리가 중심에 비해 광도 변화가 있는 음영과 같은 효과와 형광단의 페이딩(광표백)으로 인한 시간에 따라 공간에 따라 달라지는 경우가 많기 때문에 복잡한 작업이 될 수 있습니다12. 여러 가지 가능한 방법이 있지만, 이 원고는 Isodata 알고리즘(13)으로 얻은 분할 임계값을 사용하여 배경 강도를 자동으로 결정한 다음 다항식 회귀를 표준으로 하여 프레임에 걸쳐 평활화하는 것을 제안합니다. 그러나12에서 제거된 표적 세포와 관련이 없는 형광 이질성에서 비롯된 공간 구성 요소는 이 방법에 의해 무시되었습니다. 자동 이진화는 여러 가지 방법으로 수행할 수 있지만 경험적으로 Isodata 알고리즘이 최상의 결과를 생성했습니다. 따라서 자동 배경 값 빼기 및 비율계량 계산은 AMEBaS의 두 번째 주요 기능(그림 1)으로, 이를 종합하면 이중 채널 형광 현미경 이미지 스택을 입력으로 수신하고, 셀의 정중선과 채널별 배경을 추정하고, 배경 빼기, 평활화 및 이상치 제거 후 두 채널의 카이모그래프와 비율(주 출력 #1)을 출력합니다. 비율계량 이미지 스택(주 출력 #2)과 함께.
AMEBaS는 꽃가루 특이적 LAT52 프로모터로 발현된 Ca2+ (CaMeleon)8 또는 pH(pHluorin)6 비율계량 센서를 사용하여 현미경으로 얻은 성장하는 애기장대 꽃가루 튜브의 형광 타임 랩스로 테스트되었습니다. 각 채널의 이미지는 도립 현미경, 전면 조명 카메라(2560픽셀 × 2160픽셀, 픽셀 크기 6.45μm), 형광 조명기 및 침수 대물 렌즈 63x, 1.2NA에 연결하여 4초마다 촬영되었습니다. CaMeleon에 사용된 필터 설정은 여기 426-450nm(CFP) 및 505-515nm(YFP), 방출 458-487nm(CFP) 및 520-550nm(YFP)이며, pHluorin의 경우 여기 318-390nm(DAPI) 및 428-475nm(FITC), 방출 435-448nm(DAPI) 및 523-536nm(FITC)입니다. Zenodo(DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14에서 테스트하기 위해 완전한 데이터 세트가 추가되었습니다.
또한, 파이프라인은 뿌리 모발 데이터로 시험하였고, 여기서 이미징은 UBQ10 프로모터(17)의 제어 하에 유전적으로 인코딩된 Ca2+ 리포터 NES-YC3.6을 발현하는 애기장대 뿌리 모발로 앞서 기술된 바와 같이 광시트 현미경(SPIM)으로 수행되었다(15,16). 광시트 현미경의 카메라 획득, 샘플 변환 및 셔터를 제어하는 자체 제작 LabView 소프트웨어를 통해 두 개의 cpVenus 및 CFP 채널을 관찰할 수 있을 뿐만 아니라 비율을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 타임랩스의 모든 비율 이미지는 3μm 간격으로 배치된 샘플의 15개 슬라이스에서 얻은 cpVenus 및 CFP 형광 채널 이미지 사이의 최대 강도 투영(MIP)을 나타냅니다. MIP의 타임랩스 cpVenus/CFP 비율이 저장되어 AMEBaS 분석에 직접 사용되었습니다.
이 파이프라인은 여러 유형의 성장 및 이동 세포와 함께 작동할 수 있지만, 프레임 간에 성장하지 않는 세포질 영역이 일치하는 꽃가루 튜브, 뿌리 털 및 곰팡이 균사와 같이 끝부분에서만 자라는 성장 세포를 분석하도록 특별히 설계되었습니다. 이러한 대응이 없는 경우 사용자는 1.3.1.1단계에서 complete_skeletonization 옵션을 선택해야 합니다(자세한 내용은 토론 섹션 참조).
그림 1: 파이프라인 워크플로의 개요. AMEBaS 파이프라인은 단일 세포 분할(Single-Cell Segmentation), 정중선 추적(Midline Tracing), 카이모그래프 생성(Kymograph Generation)의 세 가지 주요 단계로 미세한 타임 랩스를 분석하고 처리합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Protocol
1. 대화형 노트북 프로토콜
Jupyter Notebook은 아래 지침의 기반이 된 https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb 에서 Google Colab을 사용하여 웹에서 직접 사용할 수 있습니다. 또는 Jupyter Notebook을 https://github.com/badain/amebas 에서 사용할 수 있으며, 여기에서 다운로드하여 Jupyter에서 로컬로 실행하도록 구성할 수 있습니다(Anaconda는 쉬운 플랫폼 간 설치 프로세스를 제공할 수 있음). 완전한 테스트 데이터는 pH 또는 Ca2+ 리포터14를 발현하는 애기장대 꽃가루 튜브의 단일 및 이중 채널 데이터를 포함하는 Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350)에서 찾을 수 있습니다. 파이프라인은 여러 부분으로 나뉘어 있으며, 사용자별 옵션을 설정한 후 재생 버튼을 클릭하여 모든 단계를 실행할 수 있습니다. 이 연구에 필요한 파일은 AMEBaS- 기본 zip 폴더(보충 코딩 파일 1)에서 사용할 수 있습니다.
- Jupyter Notebook을 열고 타임랩스 파일을 읽습니다.
- 위에서 언급한 Google Colab의 대화형 노트북 홈페이지로 이동하거나 GitHub에서 AMEBaS_Local.ipynb 노트북을 다운로드하여 엽니다.
- 입력 및 출력 데이터에 대한 디렉터리 설정을 준비합니다.
- 로컬 버전을 사용하는 경우 형광 타임랩스를 프로그램의 루트 폴더에 있어야 하는 data 라는 폴더 안에 TIFF 파일 또는 DV 파일로 배치합니다. 생성된 데이터를 수신하려면 명명된 폴더를 만들어야 합니다. 그런 다음 설치 코드 블록을 실행합니다.
- Google Colab에서 노트북을 사용하는 경우 설정 코드 블록을 실행하여 데이터 및 출력 폴더를 자동으로 생성합니다.
- 파일 입력 코드 블록을 실행하고 재생 버튼을 클릭하여 타임랩스 데이터를 읽습니다. Google Colab 버전의 노트북을 사용하는 경우 파일 선택 버튼을 클릭하여 타임랩스 파일을 데이터 폴더에 직접 업로드합니다.
알림: 채널 수는 이미지의 크기에 따라 자동으로 감지됩니다. - 'verbose' 파라미터를 True 또는 False로 설정하여 각 단계의 추가 출력을 생성할지 여부를 선택합니다.
- 배경에서 메인 셀과 세그먼트를 감지합니다(그림 2).
- 단일 셀 분할(Single Cell Segmentation) 코드 블록을 실행하면 재생 버튼을 클릭하여 관심 있는 셀을 배경에서 자동으로 분리할 수 있습니다.
참고: 중앙값 및 가우스 필터는 원치 않는 노이즈를 제거하기 위한 전처리 단계로 적용되며, Isodata 임계값 설정을 통해 배경에서 전경을 분할하고 원하지 않는 아티팩트를 제거하기 위해 가장 큰 영역의 영역을 격리합니다.- 'sigma' 변수에서 가우스가 사용하는 시그마 값을 조정하여 분할 마스크의 매끄러움을 미세 조정합니다. 기본값은 2.0입니다.
- 변수 estimate 를 False 로 설정하여 Isodata에서 추정된 임계값을 직접 저장하거나, True로 설정하여 LOESS(Local Polynomial Regression)를 사용하여 인접 프레임에 걸쳐 평활화합니다. n_points 변수를 변경하여 기능을 미세 조정합니다. 기본값은 40입니다.
- 단일 셀 분할(Single Cell Segmentation) 코드 블록을 실행하면 재생 버튼을 클릭하여 관심 있는 셀을 배경에서 자동으로 분리할 수 있습니다.
- 셀 확장을 따라 정중선을 추적합니다(그림 3).
- 재생 버튼을 클릭하여 셀 정중선 추적 코드 블록을 실행하면 Lee의 방법18을 사용하여 셀을 자동으로 골격화하고 선형 외삽을 통해 마지막 골격의 끝을 확장합니다.
- 마지막 프레임에서만 중간선을 추적하거나 complete_skeletonization 인수를 조정하여 프레임당 한 번씩 추적하도록 선택합니다.
참고: 모든 프레임이 스켈레톤화되면 외삽을 건너뜁니다. - interpolation_fraction 변수를 조정하여 외삽 중에 보간할 골격의 점 비율을 설정합니다. 기본값은 0.25입니다.
- 변수 extrapolation_length를 변경하여 중간선 외삽의 길이를 선택합니다. 기본값은 -1로, 골격을 가장 가까운 가장자리까지 확장합니다.
- 마지막 프레임에서만 중간선을 추적하거나 complete_skeletonization 인수를 조정하여 프레임당 한 번씩 추적하도록 선택합니다.
- 재생 버튼을 클릭하여 셀 정중선 추적 코드 블록을 실행하면 Lee의 방법18을 사용하여 셀을 자동으로 골격화하고 선형 외삽을 통해 마지막 골격의 끝을 확장합니다.
- 각 채널에 대한 카이모그래프를 생성합니다( 그림 4).
- 재생 버튼을 클릭하여 첫 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하면 두 채널에 대한 카이모그래프가 자동으로 생성됩니다.
- 변수 kymograph_kernel를 조정하여 평활화에 사용되는 가우스 커널의 크기를 선택합니다.
참고: 픽셀 강도가 평균화되는 이웃의 크기(픽셀 단위)에 해당합니다. 기본값은 3픽셀 x 3픽셀입니다. - 확장되지 않은 스켈레톤은 캡이 있는 Kymograph를 생성하며, 이 Kymograph는 강도를 적절하게 표시하기 위해 사용자 지정 컬러맵을 사용해야 합니다. 배경색에 할당될 강도의 분수 백분율인 검은색을 선택하고 shift_fraction 변수를 조정합니다. 기본값은 0.7입니다.
- 변수 kymograph_kernel를 조정하여 평활화에 사용되는 가우스 커널의 크기를 선택합니다.
- 재생 버튼을 클릭하여 첫 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하면 두 채널에 대한 카이모그래프가 자동으로 생성됩니다.
- 채널 간 비율을 계산합니다(그림 5).
- 재생 버튼을 클릭하여 두 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하면 비율계량 카이모그래프와 비율계량 타임랩스가 자동으로 생성됩니다(그림 6).
참고: 이 단계는 듀얼 채널 타임랩스를 사용하는 경우에만 사용할 수 있습니다. 1.2.1.2단계에서 저장된 배경 강도 임계값은 각 채널에서 뺍니다.- switch_ratio 변수를 조정하여 비율 계산 중에 분자와 분모로 사용되는 채널의 순서를 전환합니다. 기본값은 False입니다.
- smooth_ratio 변수를 조정하여 중앙값 필터 패스로 비율 타임랩스를 더 평활화해야 하는지 여부를 선택합니다. 기본값은 False입니다.
- reject_outliers 변수를 조작하여 분모 채널의 낮은 신호에 의해 생성된 이상값을 제거할지 여부를 선택합니다. 기본값은 True이며 이상값을 세 번째 사분위수(값의 75%가 있는 위치) 위의 사분위수 범위의 1.5배 값으로 정의합니다.
- 변수 background_ratio를 조정하여 비율계량 출력의 배경을 내보내야 하는지 여부를 선택합니다. 기본값은 False이며 0으로 바뀝니다.
- 재생 버튼을 클릭하여 두 번째 데이터 시각화 코드 블록을 실행하면 비율계량 카이모그래프와 비율계량 타임랩스가 자동으로 생성됩니다(그림 6).
그림 2: 단일 세포 분할 단계. 필터링, 임계값 설정 및 영역 레이블링과 같은 이미지 처리 기술은 관심 신호를 분리하는 데 사용됩니다(1.2단계). 이 특정 데이터의 최저 강도 값은 2556, 중앙값은 3441, 최고 강도는 32125입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 정중선 추적 개요 - 단일 셀의 정중선은 골격(흰색)을 계산하여 얻습니다. 팁(자홍색)은 골격 끝의 마지막 점에서 선형으로 외삽됩니다(1.3단계). 이 구성에서 정중선과 그 끝은 모두 원래 셀 위에 겹쳐집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 타임랩스의 카이모그래프 - 'complete_skeletonization'를 끈 상태에서 생성된 각 채널의 카이모그래프 비교(1.4단계). 세로축은 시간의 경과를 나타내고, 가로축은 외삽된 정중선 경로와 단일 셀의 평균 강도를 표시합니다. 이 특정 데이터의 경우, 컬러맵은 채널 1 최저 명암에 대해 2886, 중위수: 3167, 최고 명암: 21021 값을 나타냅니다. 채널 2 최저 강도: 3030, 중앙값: 3400, 최고 강도: 29688. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 배경 임계값 평활화 - 배경 분할 임계값은 isodata 알고리즘을 통해 추정된 다음 국소 다항식 회귀를 통해 평활화됩니다(1.5단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 비율계량 결과 - (A) 비율계량 타임랩스의 마지막 프레임과 세그먼트화된 원본 첫 번째 채널 간의 비교. (B) 비율계량 타임랩스(단계 1.5)에서 생성된 카이모그래프. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. 배치 모드 프로토콜
- AMEBaS GitHub 리포지토리에서 파일 pipeline.py 다운로드하여 데이터와 동일한 디렉터리에 배치합니다.
- 명령줄에서 프로그램 파일 뒤의 파일 위치를 입력합니다.
- 원하는 경우 파이프라인의 내부 단계를 표시하는 위치 인수로 --v 를 포함합니다.
- 세포 분할을 준비하기 위해 가우스 필터 전처리 단계에서 사용되는 시그마 값에 선택하려면 - -s 를 포함시킵니다. 기본값은 2입니다.
- --a를 포함하여 시간 경과의 각 프레임에 대한 중간선을 추적합니다. 기본적으로 파이프라인은 마지막 프레임만 사용합니다.
- --f를 포함하여 보간에 사용할 골격의 비율 [0,1]을 선택합니다. 기본값은 0.25입니다.
- -e를 포함하여 외삽된 골격의 길이(픽셀)를 선택합니다. 기본값은 -1로, 골격을 가장 가까운 가장자리까지 확장합니다.
- --sf를 포함하여 외삽되지 않은 카이모그래프에서 배경으로 이동할 색상 범위의 비율을 선택합니다. 기본값은 0.7입니다.
- - -k 를 포함하여 키모그래프 가우스 필터링에 사용되는 커널의 크기를 결정합니다. 기본값은 3입니다.
- 프레임별 배경 임계값 강도의 LOESS 다항식 회귀를 통해 전역 배경 임계값 강도를 추정하려면 - -eb 를 포함합니다.
- 매개변수 - -n을 수정하여 배경 임계값의 LOESS 평활화에 사용되는 점 수를 사용자 지정합니다. 기본값은 40입니다.
- 타임랩스에 두 개의 채널이 있는 경우 - r 또는 --switch_ratio를 포함하여 비율 계산 중에 분자와 분모로 사용되는 채널을 전환합니다. 기본적으로 두 번째 채널은 분자이고 첫 번째 채널은 분모입니다.
- --sm 인수와 함께 중앙값 필터 패스를 사용하여 비율 타임랩스를 더 매끄럽게 해야 하는지 여부를 선택합니다. 기본값은 False입니다.
- 비율계량 타임랩스 생성 중에 비정상적인 강도를 가진 픽셀을 거부하려면 -o 를 포함합니다.
- 비율계량 출력의 배경을 --b 인수를 사용하여 내보내야 하는지 여부를 선택합니다. 기본값은 False이며 0으로 바뀝니다.
- Enter 키를 눌러 실행합니다. 출력은 프로그램 파일과 동일한 디렉토리에 생성됩니다.
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Representative Results
AMEBaS 파이프라인은 형광 현미경 이미지 스택에서 편광 단일 셀의 정중선 역학 추출을 자동화하여 시간 소모를 줄이고 인적 오류를 발생시킬 가능성이 적습니다. 이 방법은 성장하는 단일 세포에서 키모그래프와 비율계량 이미지 스택(그림 1)을 생성하여 이러한 시간 경과를 정량화합니다. 단일 세포 이동에 대해 작동하도록 조정할 수 있지만 추가 실험이 필요합니다. AMEBaS는 Python에서 대화형 Jupyter Notebook( 대화형 노트북 프로토콜 섹션에서 설명)으로 구현되어 프로그래밍 경험이 없어도 쉽게 사용할 수 있으며, 명령줄 도구( 배치 모드 프로토콜 섹션)로 구현되어 동일한 파라미터 세트로 여러 스택을 분석할 수 있습니다. 하나 또는 두 개의 형광 채널을 사용할 수 있지만, 프로브의 결합되지 않은 상태의 형광 방출이 세포질에서 단백질의 고르지 않은 분포로 인한 공간적 이질성을 완화할 수 있기 때문에 두 개의 방출 채널이 있는 비율계량 프로브는 보다 신뢰할 수 있는 결과를 산출해야 합니다.
파이프라인은 먼저 가장 강한 채널에서 가장 큰 셀의 이진 마스크를 생성하고, Filename_binary_mask.tiff라는 tif 파일로 내보냅니다(그림 2). 각 채널에 대해 isodata를 사용하여 얻은 임계값 추정값은 선택적으로 황토로 평활화되어 표 Filename_background_treshold.csv에 저장됩니다(그림 5). 이진 마스크에서 추출된 셀의 중간선은 Filename_skeletonized.tiff라는 tif 파일로 내보내집니다(그림 3). 각 채널의 카이모그래프는 Filename_kymograph_c_*.csv라는 중간선에서 생성되며, 여기서 *는 채널 번호에 해당합니다(그림 4). 마지막으로, 비율계량 카이모그래프는 Filename_kymograph_ratio.csv로 저장되고 전체 비율계량 스택은 Filename_ratiometric.tiff로 명명됩니다(그림 6). 그림 2, 그림 3, 그림 4, 그림 5 및 그림 6에 해당하는 플롯은 사용자가 첫 번째 코드 청크(1.1단계)에서 'verbose == True' 또는 '--v'를 지정할 때 선택적으로 PNG 파일로 저장됩니다.
이러한 결과를 다른 이미지 분석 파이프라인과 결합하여 각 채널의 카이모그래프를 입력으로 사용하고 다양한 시계열 분석 방법과 함께 서브픽셀 해상도로 성장률 분석을 수행하는 CHUKNORRIS8과 같은 세포의 시공간 역학을 추가로 조사할 수 있습니다.
AMEBaS는 세포 내 Ca2+(CaMeleon; 도 7A,B) 및 H+(pHluorin; 광학 형광 현미경에서 획득한 그림 7C,D) 농도와 이전에 설명한 대로 광시트 현미경에서 획득한 CaMeleon NES-YC3.6(그림 7E,F)을 발현하는 성장하는 뿌리 털의 cpVenus/CFP 비율의 최대 강도 투 영15,16. 파이프라인은 성장 방향, 이미징 기술, 형광 리포터 및 세포 유형의 차이에도 불구하고 성공적으로 작동했습니다. 이러한 데이터 세트에 대해 분할, 중간선 추적 및 카이모그래프 추출이 표시되어 있으며(그림 7), AMEBaS를 광범위한 실험 설정에 적용할 수 있는 가능성을 보여줍니다.
그림 7: 팁 성장 세포의 다양한 형광 이미지 데이터 세트에 대한 대표적인 결과. (ᅡ,ᄂ) Ca2+ 리포터 CaMeleon을 표현하는 꽃가루 튜브; (씨,디) 상기 pH 지시약 pHluorin을 발현하는 꽃가루관; (이,에프) Ca2+ 리포터 NES-YC3.6을 표현하는 뿌리 털. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 코딩 File 1: AMEBaS-main.zip. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 제시된 새로운 방법은 편광 세포의 형광 현미경 이미지 스택 분석을 간소화하고 자동화하는 강력한 도구입니다. ImageJ Kymograph 플러그인과 같이 문헌에 설명된 현재 방법은 관심 있는 편광 셀의 정중선을 수동으로 추적해야 하며, 이는 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라 인적 오류가 발생하기 쉬운 작업입니다. 이 파이프라인에서 정중선의 정의는 골격화를 수행하는 수치적 방법(18,19)에 의해 뒷받침되기 때문에 주관적 평가가 제거되어 절차에 정량적 표준이 도입됩니다. 이는 많은 양의 데이터를 보유한 연구원에게 특히 유용하며, 모든 프레임에 대한 중간선 추출을 포함하여 다양한 요구 사항에 맞게 파이프라인을 사용자 지정할 수 있습니다. 또한 배경 값 빼기는 임의적인 경우가 많으며 지정된 채널의 모든 프레임에 대해 단일 배경 값을 수동으로 선택합니다. 여기서 isodata 분할은 각 프레임에 대한 배경 임계값을 객관적으로 결정하는 데 사용되며, 페이딩(광표백)으로 인한 형광의 장기적인 변화를 포착하기 위해 로컬 다항식 회귀로 (선택적으로) 평활화합니다. 픽셀 영역별로 더 큰 개체를 선택하여 가능한 아티팩트 및 보조 요소는 백그라운드에서 무시되지만 FRET-IBRA12와 같은 다른 방법을 사용하여 음영과 같은 효과를 제거할 수 있습니다. 공간 아티팩트(예: 음영)는 임계값에 의해 분할된 셀의 모양에 영향을 줄 수 있으며, 이는 AMEBaS 로고에 등장하는 비율계량 동영상에서 볼 수 있는 튜브의 한쪽 면에 대한 기울기의 편향을 설명할 수 있습니다(GitHub 페이지 또는 Colab 노트북 참조).
그럼에도 불구하고 제시된 파이프라인이 실패할 수 있고 은색 총알 솔루션으로 간주되어서는 안 되는 몇 가지 상황이 여전히 있습니다. 큰 교란은 표적 세포를 분할하는 알고리즘의 기능을 손상시킬 수 있기 때문에 이미지 캡처 중에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 최적의 결과를 위해 이미지 스택 전처리를 고려해야 하며, 원치 않는 요소와 전반적인 잘못된 프레임을 제거해야 합니다.
매개변수는 형광 리포터로 이온 농도를 분석하는 애기장대 꽃가루 튜브의 제한된 데이터 세트를 고려하여 단일 정점 성장 세포를 분석하는 것을 목표로 선택되었습니다. 따라서 다른 데이터에는 매개 변수의 합리적인 선택이 필요할 수 있습니다. 전처리 필터는 분할 후(1.2단계) 깨끗한 이진 마스크를 생성하기 위해 데이터를 평활화하므로, 잡음이 많은 데이터의 경우 가우스 필터와 중앙값 필터에 사용되는 시그마 값을 늘리거나 결과가 지나치게 평활화되면 줄일 수 있습니다. 가장 강한 채널에서 얻은 바이너리 마스크의 위치는 가장 약한 채널과 동일한 것으로 가정되며, 이는 두 채널에서 셀 위치가 동일하지 않은 경우 문제가 될 수 있습니다. 이 경우 FRET-IBRA12에서 수행된 것처럼 각 채널에 대해 서로 다른 마스크를 사용하거나 이미지 정합을 수행해야 합니다.
스켈레톤화는 기본적으로 마지막 프레임(1.3단계)에서만 수행되며, 이는 시간이 지남에 따라 세포질의 위치를 유지하는 팁 성장 세포를 가정합니다(정점 제외). 골격을 확장하면 CHUKNORRIS8과 같은 방법을 사용하여 서브 픽셀 해상도에서도 성장률을 분석할 수 있는 키모그래프를 생성할 수 있습니다. 이 확장은 스켈레톤의 성장하는 끝에서 처음 25% 포인트를 고려한 선형 외삽법(1.3단계)으로 수행되며 전체 스켈레톤의 interpolation_fraction 0%에서 100% 포인트로 조정하여 조정할 수 있습니다. 그러나 세포가 프레임 사이의 위치를 표류하거나 이동하는 세포인 경우 성장률 분석이 더 복잡해집니다. 이러한 시나리오에서는 매개 변수 complete_skeletonization=TRUE를 선택하여 모든 프레임에 대해 독립적인 스켈레톤이 생성될 수 있으며, 이는 세포 외 확장 없이 스켈레톤을 생성합니다. 성장률을 분석하는 것은 여전히 가능하지만 isodata 임계값으로 생성된 이진 마스크에 의해 분해능이 제한됩니다. 또한 결과 카이모그래프는 연속된 골격이 기본 좌표에 의해 정렬될 수 있다고 가정하며, 이는 사실이 아닌 경우 세포 내 역학을 분석하는 데 적합하지 않습니다.
카이모그래프를 생성할 때(1.4단계) AMEBaS는 중간선 주위의 기존 픽셀 여백을 사용하는 대신 가우스 커널을 사용한 평균화를 사용합니다. 3x3의 기본값은 가능한 가장 작은 크기이며, 데이터에 노이즈가 너무 많거나 셀이 큰 경우 증가할 수 있습니다. 그러나 이 단계는 과도한 평활화를 유발할 수 있으며, 이 경우 kymograph_kernel = 0으로 설정하여 필터를 완전히 꺼야 합니다. 마지막으로, 각 채널의 각 프레임에 대해 추정된 배경은 사용자가 페이딩(광표백)을 예상하거나 원시 추정치를 사용할 때(단계 1.5) 평활화될 수 있다. LOESS 다항식 회귀(1.5단계)를 사용하여 배경 값을 평활화하는 것은 창 n_points 에 사용되는 포인트 수를 최소 3개로 설정하고 스택의 최대 프레임 수(자동으로 제한됨)로 설정하여 조정할 수 있습니다. 시간 경과에 따른 배경 변화를 설명하는 더 간단한 함수는 더 큰 창을 사용하여 더 거친 맞춤을 생성할 수 있습니다.
이 방법은 일반적으로 연구자가 수행하는 여러 수동 단계를 통합하기 때문에 AMEBaS 파이프라인은 단일 편광 세포 타임랩스의 시공간 거동을 분석하기 위한 보다 효율적이고 편향되지 않으며 정밀한 접근 도구입니다. 앞으로 이 방법은 단일 세포 이동 분석을 지원하기 위해 확장될 가능성이 있습니다. 또한, 더 넓은 범위의 세포 유형에서 이 방법의 성능을 평가하기 위해서는 추가 분석이 필요합니다.
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Disclosures
이 원고의 저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자들은 재정 지원을 위해 FAPESP 보조금 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 보조금 GM131043 및 NSF 보조금 MCB1714993, MCB1930165 재정 지원에 감사드립니다. 모발 데이터는 인프라와 Andrea Bassi 교수와 Alex Costa 교수의 감독 하에 생성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
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