Summary
Bu protokol, bir toprak örneğindeki organoklor pestisit kalıntılarını başarılı bir şekilde belirlemek için QuEChERS'de faz bölümlemesi için amonyum formatının gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile birlikte kullanılmasını açıklamaktadır.
Abstract
Şu anda, QuEChERS yöntemi, hem resmi hem de resmi olmayan laboratuvarlarda çok çeşitli matrislerde pestisit kalıntılarını analiz etmek için dünya çapında en yaygın kullanılan numune hazırlama protokolünü temsil etmektedir. Amonyum format kullanan QuEChERS yönteminin daha önce orijinal ve iki resmi versiyona kıyasla avantajlı olduğu kanıtlanmıştır. Bir yandan, numunenin gramı başına 0,5 g amonyum formatın basit bir şekilde eklenmesi, faz ayrımını indüklemek ve iyi analitik performans elde etmek için yeterlidir. Öte yandan, amonyum format rutin analizlerde bakım ihtiyacını azaltır. Burada, tarım toprağındaki organoklorin pestisit (OCP) kalıntılarının eşzamanlı analizi için amonyum format kullanılarak modifiye edilmiş bir QuEChERS yöntemi uygulanmıştır. Spesifik olarak, numunenin 10 gramı 10 mL su ile nemlendirildi ve daha sonra 10 mL asetonitril ile ekstrakte edildi. Daha sonra, faz ayırma 5 g amonyum format kullanılarak gerçekleştirildi. Santrifüjlemeden sonra, süpernatant susuz magnezyum sülfat, birincil-ikincil amin ve oktadesilsilan içeren dağıtıcı bir katı faz ekstraksiyon temizleme adımına tabi tutuldu. Analitik teknik olarak gaz kromatografisi-kütle spektrometresi kullanılmıştır. Amonyum format kullanan QuEChERS yöntemi, OCP kalıntılarını bir toprak örneğinden çıkarmak için başarılı bir alternatif olarak gösterilmiştir.
Introduction
Gıda üretimini artırma ihtiyacı, son birkaç on yılda dünya çapında pestisitlerin yoğun ve yaygın kullanımına yol açmıştır. Pestisitler, zararlılardan korunmak ve mahsul verimini artırmak için mahsullere uygulanır, ancak kalıntıları genellikle toprak ortamında, özellikle tarım alanlarında sona erer1. Ayrıca, organoklor pestisitleri (OCP'ler) gibi bazı pestisitler çok kararlı bir yapıya sahiptir, bu nedenle kalıntıları kolayca ayrışmaz ve toprakta uzun süre kalır2. Genel olarak, toprak, özellikle yüksek organik madde içeriğine sahip olduğunda, pestisit kalıntılarını biriktirme kapasitesiyüksektir 3. Sonuç olarak, toprak, pestisit kalıntıları tarafından en çok kirlenmiş çevresel bölmelerden biridir. Örnek olarak, bugüne kadar yapılan tüm çalışmalardan biri, Avrupa Birliği genelinde 317 tarım toprağının% 83'ünün bir veya daha fazla pestisit kalıntısı ile kontamine olduğunu bulmuştur4.
Pestisit kalıntılarından kaynaklanan toprak kirliliği, kalıntıların yüksek toksisitesi nedeniyle besin zinciri yoluyla hedef olmayan türleri, toprak fonksiyonunu ve tüketici sağlığını etkileyebilir 5,6. Sonuç olarak, topraklardaki pestisit kalıntılarının değerlendirilmesi, pestisitlerin kullanımına ilişkin katı düzenlemelerin bulunmaması nedeniyle, özellikle gelişmekte olan ülkelerde, çevre ve insan sağlığı üzerindeki potansiyel olumsuz etkilerini değerlendirmek için esastır7. Bu, pestisit çoklu kalıntı analizini giderek daha önemli hale getirmektedir. Bununla birlikte, topraklardaki pestisit kalıntılarının hızlı ve doğru analizi, çok sayıda müdahale eden maddenin yanı sıra düşük konsantrasyon seviyesi ve bu analitlerin çeşitli fizikokimyasal özellikleri nedeniyle zor bir zorluktur4.
Tüm pestisit kalıntı analizi yöntemleri arasında, QuEChERS yöntemi en hızlı, en kolay, en ucuz, en etkili, en sağlam ve en güvenli seçenek8 haline gelmiştir. QuEChERS yöntemi iki adımdan oluşur. İlk adımda, bir sulu ve bir asetonitril tabaka arasında tuzlama yoluyla bölümlemeye dayanan mikro ölçekli bir ekstraksiyon gerçekleştirilir. İkinci adımda, dispersif katı faz ekstraksiyonu (dSPE) kullanılarak bir temizleme işlemi gerçekleştirilir; Bu teknik, matrise müdahale eden bileşenleri çıkarmak için az miktarda birkaç gözenekli sorbent kombinasyonu kullanır ve geleneksel SPE9'un dezavantajlarının üstesinden gelir. Bu nedenle, QuEChERS, çok doğru sonuçlar veren ve potansiyel rastgele ve sistematik hata kaynaklarını en aza indiren, çok az çözücü / kimyasal atıkla çevre dostu bir yaklaşımdır. Aslında, yüzlerce pestisitin yüksek verimli rutin analizi için başarıyla uygulanmıştır ve hemen hemen her türlü çevresel, tarımsal gıda ve biyolojik numunede güçlü uygulanabilirlik 8,10. Bu çalışma, tarım toprağındaki OCP'leri analiz etmek için daha önce geliştirilen ve GC-MS ile birleştirilen QuEChERS yönteminin yeni bir modifikasyonunu uygulamayı ve doğrulamayı amaçlamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Stok çözeltilerinin hazırlanması
NOT: Tüm protokol boyunca nitril eldiven, laboratuvar önlüğü ve güvenlik gözlüğü takılması önerilir.
- 25 mL'lik hacimsel bir şişede hekzan:toluen (1:1) içinde 2.000 mg/L'lik ticari bir OCP karışımından (bkz. Malzeme Tablosu) 400 mg/L'de asetonda bir stok çözeltisi hazırlayın. Tablo 1 , seçilen OCP'lerin her birini gösterir.
- Sonraki stok çözeltilerini asetonda 10 mL hacimsel şişelerde 50 mg / L, 1 mg / L ve 0.08 mg / L konsantrasyonlarında hazırlayın ve bunları -18 ° C'de amber cam şişelerde saklayın.
NOT: Aynı çözümler çalışma boyunca kullanılabilir, ancak her kullanımdan hemen sonra bunları bu koşullar altında saklamak önemlidir. - Stok çözeltilerini 10 mL hacimsel şişelerde asetonda 100 mg / L'de 4,4'-DDE-d8 ticari standardından 20 mg / L ve 0.4 mg / L konsantrasyonlarında hazırlayın ve -18 ° C'de amber cam şişelerde saklayın. Dahili standart (IS) olarak 4,4'-DDE-d8 kullanın.
2. Örnek toplama
- Bir tarım toprağının üst 10 cm'lik tabakasının yaklaşık 0,5 kg'ını bir cam kapta toplayın. Bu çalışmanın toprak amacı, patates bitkilerinin geleneksel bir tarım bölgesinde toplanmıştır.
NOT: Spatula ile yüzey örneklemesi yapılmıştır. Bununla birlikte, toprağın derinliği fizikokimyasal özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, organik karbon içeriği derinliğe göre değişiyorsa, farklı derinliklerde numune almak gerekir. - Toprak örneğini laboratuvara götürün, 1 mm çapında bir elek ile eleyin ve amber cam bir kapta 4 ° C'de analize kadar saklayın.
NOT: Aynı toprak örneği çalışma boyunca kullanılabilir, ancak her kullanımdan hemen sonra bu koşullar altında saklanması önemlidir.
3. Amonyum format kullanarak modifiye QuEChERS yöntemiyle numune hazırlama
NOT: Şekil 1 , değiştirilmiş QuEChERS yönteminin şematik bir temsilini göstermektedir.
- 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 10 g toprak örneğini tartın ve 100 μg/kg verim sağlamak için 20 mg/L'de 50 μL IS çözeltisi ekleyin. Geri kazanım amacıyla, 10 μg / kg, 50 μg / kg ve 200 μg / kg (her biri n = 3) verim sağlamak için adım 1.2'de hazırlanan pestisit çözeltilerini de ekleyin.
- Başakları numuneye daha iyi entegre etmek için tüpü 30 sn'lik bir vorteks kullanarak sallayın.
- 10 mL su ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 10 x g'de otomatik bir çalkalayıcı kullanarak çalkalayın.
- 10 mL asetonitril ekleyin. Tüpü 5 dakika boyunca 10 x g'de tekrar çalkalayın.
- 5 g amonyum format ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), tüpü elle 1 dakika boyunca kuvvetlice sallayın ve 5 dakika boyunca 1.800 x g'de santrifüj yapın.
- Asetonitril ekstraktının 1 mL'sini, 150 mg susuz MgSO4, 50 mg birincil-sekonder amin (PSA) ve 50 mg oktadesylsilane (C18) içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne dispersif-katı faz ekstraksiyonu (d-SPE)8, 30 s için vorteks ve 5 dakika boyunca 1.800 x g'de santrifüj ile temizleme amacıyla aktarın.
- Ekstraktın 200 μL'sini, 300 μL kaynaştırılmış bir kesici uç ile uygun şekilde etiketlenmiş bir otomatik numune alma şişesine aktarın ve bir GC-MS sistemi kullanarak enstrümantal bir analiz gerçekleştirin (adım 4).
NOT: Matris eşleştirmeli kalibrasyon, daha önce boş ekstraktlar kullanılarak aynı adımlar izlenerek gerçekleştirilir, ancak süpernatantın 5 mL'si d-SPE adımında (adım 3.6) 15 mL tüplerde temizlenir ve ani ve IS çözeltileri adım 3.7'ye kadar eklenmez. 5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg ve 400 μg/kg verim elde etmek için otomatik numune alma şişelerine kalibrasyon standart çözeltilerini ekleyin, kuruluğa buharlaşın ve matris ekstraktlarının 200 μL'sini ekleyin.
4. GC-MS ile enstrümantal analiz
- GC-MS analizlerini, tek bir dörtlü kütle spektrometresi ve bir elektron iyonizasyon arayüzü (-70 eV) içeren bir GC-MS sistemi kullanarak gerçekleştirin (bkz.
- MS transfer hattını 280 °C'ye ve iyon kaynağını 230 °C'ye ayarlayın.
- % 5-fenil-metilpolissiloksan 30 m x 250 μm x 0,25 μm sütun (bakınız Malzeme Tablosu) ve ultra yüksek saflıkta He 1,2 mL / dak sabit akış hızında taşıyıcı gaz olarak kullanın.
- GC fırınını başlangıçta 2 dakika boyunca 60 ° C'de tutun, ardından sıcaklığı 25 ° C / dak'da 160 ° C'ye yükseltin ve 1 dakika bekletin. Ardından, sıcaklığı 15 ° C / dak'da 175 ° C'ye yükseltin ve 3 dakika bekleyin. Ardından, 40 °C / dak'da 220 ° C'ye yükseltin ve 3 dakika bekleyin. Yine, 30 ° C / dak'da 250 ° C'ye yükseltin ve 2 dakika bekleyin. Son olarak, sıcaklığı 30 ° C / dak'da 310 ° C'ye alın ve 2 dakika bekleyin. Toplam analiz süresi 22.125 dakikadır.
- Her sekanstan önce tam bir otomatik ayar ve MS'in hava ve su kontrolünü yapın.
- GC-MS sisteminin tüm parametrelerini kontrol eden MassHunter satın alma yazılımını açın.
NOT: Cihaz sistemi varsayılan olarak MassHunter edinme yazılımını içerir. - Araç çubuğundaki "Görünüm" seçeneğini açın ve Vakum kontrolüne tıklayın, Ayarla'ya tıklayın ve Otomatik Ayarla'ya tıklayın. Otomatik ayar birkaç dakika sonra sona erer.
- "Görünüm" seçeneğini açın ve Enstrüman kontrolüne tıklayın.
- Evet'e tıklayın ve otomatik ayar için yeni ayar dosyasını kaydedin.
- Araç çubuğundaki "Görünüm" seçeneğini açın ve Vakum kontrolüne tıklayın, tekrar Ayarla'ya tıklayın ve Hava ve Su kontrolüne tıklayın. Hava ve su kontrolü birkaç saniye sonra sona erecektir.
- "Görünüm" seçeneğini açın ve Enstrüman kontrolüne tıklayın.
- Evet'e tıklayın ve hava ve su kontrolü için yeni melodi dosyasını kaydedin.
- GC-MS sisteminin tüm parametrelerini kontrol eden MassHunter satın alma yazılımını açın.
- Enjeksiyonu, bölünmemiş modda 280 °C'de bir otomatik örnekleyici kullanarak ( Malzeme Tablosuna bakınız) gerçekleştirin ve enjeksiyon hacmini 1,5 μL. Enjeksiyondan 0,75 dakika sonra, bölmeyi 40 mL / dak akış hızında açın.
NOT: Enjeksiyonlar arasında, 10 μL şırınga üç kez etil asetat ve üç kez sikloheksan ile yıkanmalıdır. Tüm enjeksiyonlar kopyadır. - Analitleri seçilen iyon izleme (SIM) modunda analiz edin. Bu, tek bir dörtlü MS sistemlerinde kullanılan standart moddur.
NOT: Tablo 1 , OCP'ler ve IS için bir kantitasyon ve iki tanımlama iyonu kullanmaya dayanan tutma sürelerini (min) ve niceleme parametrelerini göstermektedir. Kantitatif analiz, kantitasyon iyonunun tepe alanının IS iyonuna oranına dayanır.
5. Veri toplama
- GC-MS sisteminin tüm parametrelerini kontrol eden MassHunter satın alma yazılımını açın.
- Araç çubuğundaki "Sıra" seçeneğini açın ve örnek adı, şişe numarası, enjeksiyon sayısı, enstrümantal yöntem ve oluşturulacak dosyanın adı dahil olmak üzere sırayı düzenleyin. Gerektiği kadar satır ekleyin.
- Tamam'a tıklayın ve yeni diziyi kaydedin.
- Araç çubuğundaki "Sıra" seçeneğini tekrar açın ve açılır menüden Sırayı Çalıştır'a tıklayın. Enjeksiyon yöntemini ve örneklerin kaydedileceği klasörü onaylamak için yeni bir pencere açılacaktır. Sırayı Çalıştır'a tekrar tıklayın ve enjeksiyon başlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analitik yöntemin tam doğrulaması, doğrusallık, matris etkileri, geri kazanım ve tekrarlanabilirlik açısından gerçekleştirildi.
Doğrusallık değerlendirmesi için altı konsantrasyon seviyesinde (5 μg/kg, 10 μg/kg, 50 μg/kg, 100 μg/kg, 200 μg/kg ve 400 μg/kg) çivili boş numunelerle matris uyumlu kalibrasyon eğrileri kullanılmıştır. Belirleme katsayıları (R2), tüm OCP'ler için 0,99'dan yüksek veya ona eşitti. En düşük kalibrasyon seviyesi (LCL), gıda uygulamalarında izleme amacıyla 10 μg/kg'da belirlenen izin verilen maksimum sınırı karşılayan 5 μg/kg olarak ayarlanmıştır11.
Matris etkisi değerlendirmesi, saf çözücüdeki OCP kalibrasyon eğrilerinin eğimleri ile matris uyumlu kalibrasyon eğrilerinin karşılaştırılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Matris etkisi aşağıdaki denklem12 kullanılarak hesaplanmıştır:
Matris etkisi (%) = (matrisle eşleşen kalibrasyon eğrisinin eğimi − saf çözücü bazlı kalibrasyon eğrisinin eğimi)/(saf çözücü bazlı kalibrasyon eğrisinin eğimi) × 100.
Şekil 2, toprak örneklerine amonyum formatı kullanılarak modifiye edilmiş bir QuEChERS yöntemi uygulanarak incelenen OCP'ler için matris etkisi dağılımlarını göstermektedir. Pozitif matris etkisi yüzdeleri bir sinyal artışına karşılık gelirken, negatif yüzdeler sinyal bastırma olduğu anlamına gelir. Spesifik olarak, (1) -% 20 ile% 20 arasında değişen değerler yumuşak bir matris etkisine karşılık gelir; (2) -%20 ile -%50 arasında veya %20 ile %50 arasında değişen değerler orta matris etkisine karşılık gelir; (3) ve %50'den yüksek veya -%50'den düşük değerler, güçlü bir matris etkisi olduğu anlamına gelir. Gözlemlendiği gibi, daha fazla OCP yumuşak veya orta matris etkilerine maruz kalırken, daha az OCP güçlü matris etkilerine maruz kalmıştır.
Geri kazanım ve tekrarlanabilirlik, pestisitlerle birlikte boş numunelerin üç konsantrasyon seviyesinde (10 μg / kg, 50 μg / kg ve 200 μg / kg) yükselmesiyle değerlendirildi. Şekil 3 , tüm pestisitler ve ani yükselme seviyeleri için genel geri kazanım değerlerini ve göreceli standart sapma (RSD) değerlerini göstermektedir (n = 9). Gözlemlenebileceği gibi, incelenen OCP'lerin büyük çoğunluğu,% 70-120 aralığında ortalama iyileşme yüzdeleri sunmuş, RSD'ler% 20'den düşük, heptaklor, endrin ve β-endosülfan hariç, biraz daha yüksek ortalama iyileşmeler sağlamıştır.
Şekil 1: Toprak örneğinden pestisit kalıntılarını çıkarmak için amonyum format kullanılarak modifiye edilmiş QuEChERS yönteminin gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 17 OCP için matris etkilerinin tutma sürelerine (min) dağılımı. Yumuşak matris etkisi -%20 ile %20 arasındaki değerlere karşılık gelir; orta matris etkisi -%20 ile -%50 arasında veya %20 ile %50 arasında değişen değerlere karşılık gelir; Güçlü bir matris etkisi,% 50'den büyük veya -% 50'den küçük değerlere karşılık gelir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Toprak örneğinde 10 μg/kg, 50 μg/kg ve 200 μg/kg (n = 9) yükseldikten sonra 17 OCP için ortalama geri kazanımlar. Kabul edilebilir iyileşme (%70-%120) ve RSD (<%20) aralığındaki analitlerin sayısı, bu aralığın dışında etiketlenenlerle birlikte sağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Arjantin | Saklama süresi (min) | Niceleyici iyon | Eleme iyonu 1 | Eleme iyonu 2 |
| α-BHC | 11.35 | 181 | 219 | 111 |
| β-BHC | 11.90 | 181 | 219 | 109 |
| Arjantin | 12.01 | 181 | 183 | 219 |
| δ-BHC | 12.39 | 181 | 219 | 111 |
| Heptaklor | 13.24 | 272 | 100 | 274 |
| Arjantin | 13.94 | 263 | 66 | 265 |
| Heptaklor epoksit | 14.86 | 353 | 355 | 81 |
| α-Endosülfan | 15.71 | 241 | 239 | 195 |
| 4,4'-DDE-d8 (IS) | 16.09 | 254 | 184 | 326 |
| 4,4'-DDE | 16.12 | 246 | 318 | 248 |
| Arjantin | 16.18 | 79 | 263 | 81 |
| Endrin | 16.57 | 263 | 317 | 345 |
| β-Endosülfan | 16.73 | 195 | 241 | 159 |
| 4,4'-DDD | 16.89 | 235 | 237 | 165 |
| Endosülfan sülfat | 17.61 | 387 | 227 | 272 |
| 4,4'-DDT | 17.65 | 235 | 237 | 165 |
| Endrin keton | 18.64 | 317 | 67 | 315 |
| Metoksiklor | 18.86 | 227 | 228 | 212 |
Tablo 1: OCP'lerin GC-MS analizi için tutma süreleri (min) ve niceleme parametreleri. Alfa-benzenheksaklorür (α-BHC); beta-benzenheksaklorür (β-BHC); lindane; delta-benzenheksaklorür (δ-BHC); heptaklor; aldrin; heptaklor epoksit; α-endosülfan; 4,4'-diklorodifenildikloroetilen-d8 (4,4'-DDE-d8) (IS); 4,4'-diklorodifenildikloroetilen (4,4'-DDE); dieldrin; endrin; β-endosülfan; 4,4'-diklorodifenildikloroetan (4,4'-DDD); endosülfan sülfat; 4,4'-diklorodifeniltrikloroetan (4,4'-DDT); endrin keton; metoksiklor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
QuEChERS yönteminin orijinal9 ve iki resmi versiyonu 13,14, ekstraksiyon sırasında asetonitril / su karışımı ayrımını teşvik etmek için sodyum klorür, asetat veya sitrat tuzları ile birlikte magnezyum sülfat kullanır. Bununla birlikte, bu tuzlar kütle spektrometresi (MS) kaynağındaki yüzeylerde katı madde olarak birikme eğilimindedir, bu da sıvı kromatografisi (LC)-MS tabanlı yöntemlerin daha fazla korunmasına ihtiyaç duyulmasına neden olur. Bu dezavantajların üstesinden gelmek açısından, González-Curbelo ve ark.15, daha uçucu amonyum formatının, faz ayrımını ve hem LC hem de GC-tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) için pestisit kalıntılarının ekstraksiyonunu indüklemek için iyi çalıştığını bildirmiştir. Daha sonraki çalışmalar, çeşitli kompleks matrislerden pestisit kalıntılarını çıkarmak için numunenin gramı başına 0.5 g amonyum formatı kullanmıştır16,17,18,19. Ek olarak, amonyum formatının kullanımının, GC-MS tabanlı yöntemler için kullanımını haklı çıkaran daha düşük miktarlarda birlikte ekstrakte edilmiş malzeme20 sağladığı gösterilmiştir. Bu çalışma, ilk kez, topraklardaki pestisit kalıntılarını analiz etmek için bu versiyonu rapor etmektedir21.
Topraklar gibi karmaşık matrislerdeki pestisit kalıntılarının GC analizi, birlikte ekstrakte edilen matris bileşenlerinin pestisitlerin enstrümantal tepkisi üzerindeki etkisinden dolayı bazı sınırlamalara sahiptir, bu da yanlış belirlemeye ve daha düşük hassasiyete neden olur22,23. Bu nedenle, optimize edilmiş temizleme adımları21 de dahil olmak üzere matris etkisini en aza indirmek için çeşitli iyileştirmeler yapılmıştır. Bununla birlikte, matris etkisi hala gerçekleşir ve mümkün olduğunca düzeltilmelidir. Bu anlamda, matris uyumlu kalibrasyon kullanılan ana yaklaşım olmuştur, çünkü kromatografik sinyalin saf çözücülerinkine göre iyileştirilmesini telafi etmede çok pratiktir24. Böylece, bu çalışmada, saf asetonitrilde kalibrasyon eğrileri oluşturularak ve toprak ekstraktları kullanılarak doğrusallık değerlendirilmiş ve her iki yaklaşım kullanılarak tüm OCP'ler için 0.99'dan yüksek veya 0.99'a eşit R2 değerleri elde edilmiştir. Bununla birlikte, her iki kalibrasyon eğrisi karşılaştırıldığında, -%49 ila %191 aralığında kayda değer matris etkileri bulunmuştur (Şekil 2). Güçlü bir matris etkisine maruz kalan pestisitlerin sayısı 17'den sadece 3'ü olmasına rağmen (endrin, endrin keton ve metoksiklor), matris etkilerini daha büyük ölçüde telafi etmek için matrisle eşleşen kalibrasyon eğrileri kullanılarak sonraki çalışmalar gerçekleştirilmiştir.
Topraklardaki pestisit kalıntıları için maksimum kalıntı limitleri (MRL'ler) belirlenmemiştir, ancak tüm OCP'ler için 5 μg / kg'lık bir LCL belirlenmiştir; bu, tarım-gıda ürünlerindeki pestisit kalıntılarının analizi için uluslararası mevzuat tarafından 10 μg / kg'da belirlenen çok zorlu standart MRL'den daha düşüktür (Yönetmelik 396/2005)11. Ek olarak, 5 μg / kg'lık LCL, tüm OCP'ler için yaklaşık 10'luk bir sinyal-gürültü oranı (S / N) sağlamıştır. Bu yöntemin yüksek hassasiyeti, QuEChERS yöntemini ve ardından GC-MS'yi kullanarak topraklardaki OCP'leri analiz eden diğer çalışmalarda elde edilene benzer veya daha iyidir. Örneğin, bir çalışmada, sitrat tamponu kullanan QuEChERS yönteminin resmi versiyonu kullanılarak 34 OCP analiz edildi ve niceleme sınırları (LOQ'lar) 7 μg / kg25'e eşit veya daha yüksekti. Özellikle, α-BHC, β-BHC, lindan ve δ-BHC'nin LOQ değerleri 206 μg / kg ile 384 μg / kg arasındaydı. Başka bir çalışmada, lindane ve dieldrin QuEChERS yönteminin aynı versiyonu kullanılarak analiz edilmiş ve sırasıyla 42 μg / kg ve 292 μg / kg'lık LOQ değerleri eldeedilmiştir. Benzer şekilde, başka bir araştırma çalışması da QuEChERS ve GC-MS kullanarak aldrin ve heptakloru belirledi ve LOQ değerleri sırasıyla 13 ve 23 μg / kg,27 idi.
İyileşme ve tekrarlanabilirlik değerlendirmesi üçlü (n = 9) içinde üç konsantrasyon seviyesinde (düşük, orta ve yüksek) geliştirilmiştir. Bu amaçla, amonyum format kullanılarak QuEChERS yönteminin uygulanmasının başlangıcında çivilenmiş toprak örneklerinden elde edilen pestisit pik alanı/IS (4,4'-DDE-d8) pik alan oranlarının matris uyumlu kalibrasyon oranları ile karşılaştırılarak genel geri kazanım değerleri belirlenmiştir. Her durumda, her replikasyon aynı sırayla iki kez enjekte edildi. İzotopik olarak etiketlenmiş bir standart olan IS'nin kullanılmasının, tüm prosedür boyunca meydana gelen pestisitlerin olası kayıplarının yanı sıra matris etkisinin ve / veya cihazdaki olası değişkenliğin telafi edilmesine izin verdiği belirtilmelidir. Sonuçlara göre, çoğu pestisit, yöntemin etkinliğini ve tekrarlanabilirliğini gösteren her bir ani seviye28'de% 70-120 geri kazanım değerlerinin% 70 ≤ila% 120'lik kabul edilebilirlik kriterlerini karşıladı. Bununla birlikte, genel iyileşme değerleri (n = 9), heptaklor (% 122), endrin (% 121) ve β-endosülfan (% 130) için% 120'den biraz daha yüksekti, ancak tutarlıydılar (RSD'ler <% 13). Bu anlamda, üç ani seviyedeki genel iyileşme değerleri göz önüne alındığında, RSD ≤değerleri %30-%140 ile %30-%140 arasında bir kabul edilebilirlik kriteri %20 olarak belirlenmiştir 28.
Sonuç olarak, GC-MS ile birleştirilmiş amonyum format kullanan QuEChERS yöntemi, tarımsal toprak örneklerinde OCP'leri başarıyla belirleyebilir. Bu çalışmada, su ve asetonitril tabakaları arasında faz ayrımını indüklemek için 5 g amonyum formatının basit bir şekilde eklenmesinin, seçilen pestisitlerin yüksek geri kazanımları ile uygun ekstraksiyonu sağladığı gösterilmiştir. Bununla birlikte, matris etkisi gerçekleşmeye devam etti, bu nedenle sonraki çalışmalarda analit koruyucularının eklenmesi gibi diğer yaklaşımlar incelenmelidir. Her durumda, resmi QuEChERS versiyonlarına bu alternatif, özellikle rutin LC-MS tabanlı analizlerde, magnezyum ve sodyum tuzlarının kullanımı nedeniyle analitik sistemde biriken istenmeyen katıları önlemek için kullanılabilir. İkinci durumda, amonyum format pozitif elektrosprey iyonizasyonunda iyonizasyon için bir yardımcı olduğundan ve sodyum katkıları yerine amonyum addüktörlerinin oluşumunu artırabileceğinden daha da ilginç olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Açıklayacağım bir çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Javier Hernández-Borges ve Cecilia Ortega-Zamora'ya paha biçilmez destekleri için teşekkür ederim. Ayrıca Universidad EAN ve Universidad de La Laguna'ya teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL disposable glass conical centrifuge tubes | PYREX | 99502-15 | |
| 2 mL centrifuge tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL centrifuge tubes with screw caps | VWR | 21008-169 | |
| 5977B mass-selective detector | Agilent Technologies | 1617R019 | |
| 7820A gas chromatography system | Agilent Technologies | 16162016 | |
| Acetone | Supelco | 1006582500 | |
| Acetonitrile | VWR | 83642320 | |
| Ammonium formate | VWR | 21254260 | |
| Automatic shaker KS 3000 i control | IKA | 3940000 | |
| Balance | Sartorius Lab Instruments Gmbh & Co | ENTRIS224I-1S | |
| Bondesil-C18, 40 µm | Agilent Technologies | 12213012 | |
| Bondesil-PSA, 40 µm | Agilent Technologies | 12213024 | |
| Cyclohexane | VWR | 85385320 | |
| EPA TCL pesticides mix | Sigma Aldrich | 48913 | |
| Ethyl acetate | Supelco | 1036492500 | |
| G4567A automatic sampler | Agilent Technologies | 19490057 | |
| HP-5ms Ultra Inert (5%-phenyl)-methylpolysiloxane 30 m x 250 µm x 0.25 µm column | Agilent Technologies | 19091S-433UI | |
| Magnesium sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | 434183-1KG | |
| Mega Star 3.R centrifuge | VWR | 521-1752 | |
| Milli-Q gradient A10 | Millipore | RR400Q101 | |
| p,p'-DDE-d8 | Dr Ehrenstorfer | DRE-XA12041100AC | |
| Pipette tips 2 - 200 µL | BRAND | 732008 | |
| Pipette tips 5 mL | BRAND | 702595 | |
| Pipette tips 50 - 1000 uL | BRAND | 732012 | |
| Pippette Transferpette S variabel 10 - 100 µL | BRAND | 704774 | |
| Pippette Transferpette S variabel 100 - 1000 µL | BRAND | 704780 | |
| Pippette Transferpette S variabel 20 - 200 µL | BRAND | 704778 | |
| Pippette Transferpette S variabel 500 - 5000 µL | BRAND | 704782 | |
| Vials with fused-in insert | Sigma Aldrich | 29398-U | |
| OCPs | CAS registry number | ||
| α-BHC | 319-84-6 | ||
| β-BHC | 319-85-7 | ||
| Lindane | 58-89-9 | ||
| δ-BHC | 319-86-8 | ||
| Heptachlor | 76-44-8 | ||
| Aldrin | 309-00-2 | ||
| Heptachlor epoxide | 1024-57-3 | ||
| α-Endosulfan | 959-98-8 | ||
| 4,4'-DDE-d8 (IS) | 93952-19-3 | ||
| 4,4'-DDE | 72-55-9 | ||
| Dieldrin | 60-57-1 | ||
| Endrin | 72-20-8 | ||
| β-Endosulfan | 33213-65-9 | ||
| 4,4'-DDD | 72-54-8 | ||
| Endosulfan sulfate | 1031-07-8 | ||
| 4,4'-DDT | 50-29-3 | ||
| Endrin ketone | 53494-70-5 | ||
| Methoxychlor | 72-43-5 |
References
- Sabzevari, S., Hofman, J. A worldwide review of currently used pesticides' monitoring in agricultural soils. Science of The Total Environment. 812, 152344 (2022).
- Tzanetou, E. N., Karasali, H. A. Comprehensive review of organochlorine pesticide monitoring in agricultural soils: The silent threat of a conventional agricultural past. Agriculture. 12 (5), 728 (2022).
- Farenhorst, A. Importance of soil organic matter fractions in soil-landscape and regional assessments of pesticide sorption and leaching in soil. Soil Science Society of America Journal. 70 (3), 1005-1012 (2006).
- Silva, V., et al. Pesticide residues in European agricultural soils - A hidden reality unfolded. Science of The Total Environment. 653, 1532-1545 (2019).
- Vischetti, C., et al. Sub-lethal effects of pesticides on the DNA of soil organisms as early ecotoxicological biomarkers. Frontiers in Microbiology. 11, 1892 (2020).
- Alengebawy, A., Abdelkhalek, S. T., Qureshi, S. R., Wang, M. -Q. Heavy metals and pesticides toxicity in agricultural soil and plants: Ecological risks and human health implications. Toxics. 9 (3), 42 (2021).
- Zikankuba, V. L., Mwanyika, G., Ntwenya, J. E., James, A. Pesticide regulations and their malpractice implications on food and environment safety. Cogent Food & Agriculture. 5 (1), 1601544 (2019).
- Varela-Martínez, D. A., González-Sálamo, J., González-Curbelo, M. Á, Hernández-Borges, J. Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe (QuEChERS) extraction. Handbooks in Separation Science. , Elsevier. Amsterdam, the Netherlands. 399-437 (2020).
- Anastassiades, M., Lehotay, S. J., Štajnbaher, D., Schenck, F. J. Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce. Journal of AOAC International. 86 (2), 412-431 (2003).
- González-Curbelo, M. Á, et al. Evolution and applications of the QuEChERS method. Trends in Analytical Chemistry. 71, 169-185 (2015).
- European Union. European Regulation (EC) NO 396/2005 of the European Parliament and of the Council of 23 February 2005 on maximum residue levels of pesticides in or on food and feed of plant and animal origin and amending Council Directive 91/414/EEC. Official Journal of the European Union. 70, 1-16 (2005).
- Kwon, H., Lehotay, S. J., Geis-Asteggiante, L. Variability of matrix effects in liquid and gas chromatography-mass spectrometry analysis of pesticide residues after QuEChERS sample preparation of different food crops. Journal of Chromatography A. 1270, 235-245 (2012).
- Lehotay, S. J., et al. Determination of pesticide residues in foods by acetonitrile extraction and partitioning with magnesium sulfate: Collaborative study. Journal of AOAC International. 90 (2), 485-520 (2007).
- European Committee for Standardization (CEN). Standard Method EN 15662. Food of plant origin-Determination of pesticide residues using GC-MS and/or LC-MS/MS following acetonitrile extraction/partitioning and clean-up by dispersive SPE-QuEChERS method. European Committee for Standardization. , (2008).
- González-Curbelo, M. Á, Lehotay, S. J., Hernández-Borges, J., Rodríguez-Delgado, M. Á Use of ammonium formate in QuEChERS for high-throughput analysis of pesticides in food by fast, low-pressure gas chromatography and liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1358, 75-84 (2014).
- Han, L., Sapozhnikova, Y., Lehotay, S. J. Method validation for 243 pesticides and environmental contaminants in meats and poultry by tandem mass spectrometry coupled to low-pressure gas chromatography and ultrahigh-performance liquid chromatography. Food Control. 66, 270-282 (2016).
- Lehotay, S. J., Han, L., Sapozhnikova, Y. Automated mini-column solid-phase extraction clean-up for high-throughput analysis of chemical contaminants in foods by low-pressure gas chromatography-tandem mass spectrometry. Chromatographia. 79 (17), 1113-1130 (2016).
- Lehotay, S. J. Possibilities and limitations of isocratic fast liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of pesticide residues in fruits and vegetables. Chromatographia. 82 (1), 235-250 (2019).
- Han, L., Matarrita, J., Sapozhnikova, Y., Lehotay, S. J. Evaluation of a recent product to remove lipids and other matrix co-extractives in the analysis of pesticide residues and environmental contaminants in foods. Journal of Chromatography A. 1449, 17-29 (2016).
- Varela-Martínez, D. A., González-Curbelo, M. Á, González-Sálamo, J., Hernández-Borges, J. Analysis of pesticides in cherimoya and gulupa minor tropical fruits using AOAC 2007.1 and ammonium formate QuEChERS versions: A comparative study. Microchemical Journal. 157, 104950 (2020).
- González-Curbelo, M. Á, Varela-Martínez, D. A., Riaño-Herrera, D. A. Pesticide-residue analysis in soils by the QuEChERS method: A review. Molecules. 27 (13), 4323 (2022).
- Anastassiades, M., Maštovská, K., Lehotay, S. Evaluation of analyte protectants to improve gas chromatographic analysis of pesticides. Journal of Chromatography A. 1015 (1-2), 163-184 (2003).
- Maštovská, K., Lehotay, S., Anastassiades, M. Combination of analyte protectants to overcome matrix effects in routine GC analysis of pesticide residues in food matrixes. Analytical Chemistry. 77 (24), 8129-8137 (2005).
- Rahman, M., Abd El-Aty, A., Shim, J. Matrix enhancement effect: A blessing or a curse for gas chromatography? - A review. Analytica Chimica Acta. 801, 14-21 (2013).
- Rouvire, F., Buleté, A., Cren-Olivé, C., Arnaudguilhem, C. Multiresidue analysis of aromatic organochlorines in soil by gas chromatography-mass spectrometry and QuEChERS extraction based on water/dichloromethane partitioning. Comparison with accelerated solvent extraction. Talanta. 93, 336-344 (2012).
- Lesueur, C., Gartner, M., Mentler, A., Fuerhacker, M. Comparison of four extraction methods for the analysis of 24 pesticides in soil samples with gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatography-ion trap-mass spectrometry. Talanta. 75 (1), 284-293 (2008).
- Ðurović-Pejčev, R. D., Bursić, V. P., Zeremski, T. M. Comparison of QuEChERS with traditional sample preparation methods in the determination of multiclass pesticides in soil. Journal of AOAC International. 102 (1), 46-51 (2019).
- European Commission. SANTE/11312/2021. Guidance document on analytical quality control and method validation procedures for pesticide residues analysis in food and feed. European Commission. , (2021).
