Summary
Bu protokol, dört farklı mantar β-glukanının saflaştırma adımlarını ve sonraki çalışmalarını, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın anti-tümöral özelliklerini geliştiren potansiyel immünomodülatör moleküller olarak tanımlamaktadır.
Abstract
Glioblastoma karşı etkili tedaviler geliştirmedeki en büyük zorluklardan biri, tümör mikro ortamındaki güçlü bağışıklık baskılanmasının üstesinden gelmektir. İmmünoterapi, bağışıklık sistemi tepkisini tümör hücrelerine karşı çevirmek için etkili bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Glioma ile ilişkili makrofajlar ve mikroglia (GAM'lar) bu tür anti-enflamatuar senaryoların ana itici güçleridir. Bu nedenle, GAM'larda anti-kanseröz yanıtın arttırılması, glioblastoma hastalarını tedavi etmek için potansiyel bir ko-adjuvan tedaviyi temsil edebilir. Bu damarda, mantar β-glukan molekülleri uzun zamandır güçlü bağışıklık modülatörleri olarak bilinmektedir. Doğuştan gelen bağışıklık aktivitesini uyarma ve tedavi yanıtını iyileştirme yetenekleri tanımlanmıştır. Bu modüle edici özellikler kısmen, ilginç bir şekilde, GAM'larda büyük ölçüde ifade edilen örüntü tanıma reseptörlerine bağlanma yeteneklerine atfedilir. Bu nedenle, bu çalışma, glioblastoma hücrelerine karşı mikroglia'nın tümör öldürücü tepkisini arttırmak için mantar β-glukanların izolasyonu, saflaştırılması ve daha sonra kullanılmasına odaklanmıştır. Fare glioblastomu (GL261) ve mikroglia (BV-2) hücre hatları, mevcut biyofarmasötik endüstrisinde yoğun olarak kullanılan mantarlardan ekstrakte edilen dört farklı mantar β-glukanının immünomodülatör özelliklerini test etmek için kullanılır: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus ve Ganoderma lucidum. Bu bileşikleri test etmek için, önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış bir ortamın glioblastoma hücrelerinde proliferasyon ve apoptoz aktivasyonu üzerindeki etkisini ölçmek için ko-stimülasyon testleri yapıldı.
Introduction
Nöro-onkoloji alanında yeni başarıların ortaya çıkmasına rağmen, glioblastoma hastalarının yaşam beklentisi yetersiz kalmaktadır. Beyin tümörlerine karşı altın standart tedaviler cerrahi, radyoterapi ve kemoterapinin birleştirilmesine dayanır. Bununla birlikte, son on yılda, immünoterapi, farklı kanser türlerini tedavi etmek için güçlü bir strateji olarak ortaya çıkmıştır1. Bu nedenle, vücudun tümör hücrelerine karşı bağışıklık tepkisini kullanma olasılığı son zamanlarda onkolojinin dördüncü ayağı haline gelmiştir.
Alandaki en büyük zorluklardan birinin, tümör mikroçevre2'de bulunan güçlü immünsüpresyonun üstesinden gelmek olduğu uzun zamandır bilinmektedir. Özellikle, beyin kanserinin en yaygın ve agresif formlarından biri olan glioblastoma durumunda, bu tür pro-tümöral senaryoları düzenleyen kilit yolları çözmek ve bağışıklık sisteminin iç karartıcı tepkisine karşı koyabilecek yeni bileşikler bulmak, bu tedavi edilemez hastalığa karşı gelecekteki tedavilerin yolunu açabilir.
Beyin kendi bağışıklık sistemi hücrelerine sahiptir ve en alakalı hücre tipi mikrogliadır. Bu hücrelerin farklı merkezi hastalıklarda oldukça karmaşık bir davranışa sahip oldukları kanıtlanmıştır3. Primer beyin tümörleri (örneğin, glioblastoma) durumunda, bu hücreler beyin parankimini kolonize etmek için tümör hücrelerini destekleyen bir anti-enflamatuar fenotipe doğru kaydırılır3. Çok sayıda yayın, tümör progresyonu sırasında bu hücrelerin ana rolünü arttırmıştır. Bunun başlıca nedenlerinden biri, glioma ile ilişkili mikroglia ve infiltrasyon makrofajlarının (GAM'lar) toplam tümör kütlesinin üçte birini oluşturmasıdır, bu nedenle beyin tümörü ilerlemesi sırasında aktivasyon durumlarının kesin etkisini düşündürmektedir 4,5.
Bu bağlamda, mantar β-glukanlar, fagositoz ve pro-inflamatuar faktörlerin üretimi de dahil olmak üzere etkili immün yanıtları tetikleyen ve zararlı ajanların eliminasyonuna yol açan güçlü moleküller olarak tanımlanmıştır 6,7,8,9,10. Mantar β-glukanlar genellikle farklı mantar parçalarından elde edilen ekstraktlar kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, spesifik etkilerin atfedilmesi, belirsizliklerden kaçınmak ve immünomodülatör ajanlar gibi moleküllerin etki mekanizmasını anlayabilmek için saflaştırılmasını gerektirir8.
Bu çalışmada, çözünür β-glukanlar, düzenli olarak yenilebilir (Pleurotus ostreatus ve Pleurotus djamor) ve tıbbi (Ganoderma lucidum ve Hericium erinaceus) mantarlar olarak kullanılan dört farklı mantarın meyve veren gövdesinden saflaştırılır. Özellikle, bu dört mantar gıda ve ilaç endüstrisinde büyük kullanıma sahiptir ve ticari bir işletmede çevre dostu bir döngüsel ekonomi içinde üretilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
Beyin kanseri tedavilerinde mantar β-glukanların gelecekteki kullanımının temelini atmak için, iyi tanımlanmış saflaştırma stratejileri ve bağışıklık sistemi hücreleri ile varsayılan etkileşimlerini araştıran klinik öncesi çalışmalar, anti-tümör aracıları olarak potansiyel rollerini değerlendirmek için gereklidir. Bu çalışma, seçilen mantarın meyve veren gövdelerinde bulunan çözünür β-glukanları elde etmek için gereken sayısız izolasyon ve saflaştırma adımını açıklamaktadır. Başarılı bir şekilde saflaştırıldıktan sonra, mikroglia hücreleri enflamatuar fenotiplerini arttırmak için aktive edilir. Fare glioblastoma hücreleri (GL261), daha önce bu ekstraktlarla muamele edilen farklı bir mikroglia şartlandırılmış ortam ile kaplanır ve daha sonra tümör hücrelerinin davranışları üzerindeki etkisi değerlendirilir. İlginç bir şekilde, laboratuvarımızdan yapılan pilot çalışmalar (veriler gösterilmemiştir), pro-inflamatuar mikroglia'nın sadece glioblastoma hücrelerinde değil, diğer kanser hücre hatlarında da tümör hücresi göçünü ve istila özelliklerini nasıl yavaşlatabileceğini ortaya çıkarmıştır. Bu multidisipliner çalışma, onkoloji araştırmacılarının birçok farklı tümör türünde bağışıklık tepkisini artırabilen umut verici bileşikleri test etmeleri için yararlı bir araç sağlayabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokolde açıklanan dört farklı mantar çeşidi ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu).
1. Mantar β-glukanların izolasyonu
- Çözünür mantar polisakkaritlerinin ekstraksiyonu ve izolasyonu
NOT: Çözünür mantar polisakkaritleri (SMP'ler) Şekil 1'de şematik olarak gösterilen prosedüre göre elde edilmiştir.- Taze P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus ve G. lucidum meyve veren cisimleri (yaklaşık 2.000 g / mantar) damıtılmış suda beş kez nazikçe durulayın.
- Meyve gövdelerini geleneksel bir hava kurutmalı fırında sabit bir ağırlığa ulaşana kadar (~ 24 saat) 50 ± 2 ° C'de kurutun.
- Kurutulmuş mantarları bir bıçak değirmeninde öğütün ve her mantardan yaklaşık 200 g toz elde edin.
- 100 g mantar tozunu (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus ve G. lucidum) 1.000 mLH2O'daaskıya alın. Ardından, 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklavlayın ve son olarak oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
- Elde edilen süspansiyonu 6.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Çözünmeyen mantar polisakkaritleri (IMP) içeren çökeltiyi 50 ± 2 °C'de hava kurutmalı fırında 24 saat kurutun.
- Çökeltiyi atın ve süpernatantı koruyun. Süpernatantı döner bir evaporatörde 10 kez konsantre edin.
- SMP içeren konsantreyi gece boyunca 4 ° C'de etanol (% 80 nihai konsantrasyon) ile çökeltin.
- Etanol süspansiyonunu 6.000 x g'de 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüj edin, peleti koruyun (çökeltin) ve süpernatantı bir pipetle atın.
- ÇökeltiyiH2Od(% 10 w / v) içinde çözmeden önce% 80 etanol ile üç kez yıkayın. PH'ı 6.5/7'ye ve sıcaklığı 37 ° C'ye ayarlayın ve üreticinin talimatlarını izleyerek α-glukanları çözündürmek için sırasıyla 2 U ve 4 U α-amilaz ve glukoamilaz ile muamele edin (bkz.
- α-amilaz / glukoamilaz ile işlemden sonra, pH ve sıcaklığı sırasıyla 8.0 ve 50 ° C'ye ayarlayın ve proteinleri çözündürmek için alkalaz (2.5 U / g protein) ile muamele edin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Bu sıralı enzimatik işlem, etanol çökeltisinde β-glukanlarla birlikte çökelen çoğu α-glukan ve proteini uzaklaştırır. - Hidrolizden sonra, hidrolizatı 4 ° C'de 15 dakika boyunca 6.000 x g'de santrifüj edin ve temiz süpernatant döner bir evaporatörde beş kez konsantre olur. % 80 etanol ile tekrar çökeltin.
- Elde edilen çökeltiyiH2O'daçözünür ve düşük moleküler ağırlıklı molekülleri uzaklaştırmak için selüloz boru membranları (12.000 Da kesme membranları; bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak 24 saat boyunca damıtılmış suda diyaliz yapın. Suda çözünür kısmı geri kazanın ve çözünür β-glukanlar (SβG'ler) üretmek için dondurarak kurutun.
- Şeker ve protein ölçümü
- Her fraksiyonun toplam şeker içeriğini, standart8 olarak glikoz kullanarak fenol-sülfürik asit yöntemiyle ölçün.
NOT: β-glukan içeriğinin kantitasyonu, enzimatik hidrolize ve oksidoredüktazların aktivitesine dayanan β-glukan tahlil kiti (mantar ve maya; bakınız Malzeme Tablosu) kullanılarak da yapılabilir: yani ekzo-1,3-β-glukanaz, glikoz oksidaz, β-glukozidaz ve peroksidaz, daha sonra kinoneimin oluşumu ile. Küçük değişikliklerle üreticinin talimatlarını izleyin. - 12 MH2SO 4 yerine 18 MH2SO4 kullanın.
- Toplam glukanların ve α-glukanların içeriğini ayrı ayrı değerlendirin.
- Elde edilen β-glukan değerlerini, Kjeldahl protokolünü takiben toplam glukan ve α-glukan (üçlü) değerleri arasındaki fark olarak ölçün. Bazı durumlarda, protein içeriği, kalibrasyon eğrisi11,12'yi çizmek için albümin kullanılarak Lowry yöntemiyle belirlenebilir.
- Her fraksiyonun toplam şeker içeriğini, standart8 olarak glikoz kullanarak fenol-sülfürik asit yöntemiyle ölçün.
- Ultraviyole absorpsiyon spektroskopisi analizi
- 200-400 nm bölgesindeki numuneleri tarayarak UV görünür bir spektrofotometre kullanarak SβG ultraviyole (UV) spektrumlarını elde edin (Malzeme Tablosuna bakınız) (Şekil 2).
- Her bir SβG'den 1.0 mg/mL'siniH2OD'dehazırlayın, çözeltiyi bir kuvars küvete aktarın ve oda sıcaklığında tarayın.
- Moleküler ağırlık dağılımı analizi
- Bir kırılma indisi dedektörü ve ultra hidrojel lineer jel filtrasyon sütunu (300 mm x 7,8 mm; Şekil 3).
- Tahlilini 40 °C'de, 0,5 mL/dak-1 akış hızında elüent olarak deiyonize su ve standart olarak dextrans (110, 80 ve 50 kDa) kullanarak gerçekleştirin (bkz. 5 mL'lik bir fraksiyon toplayın.
- Fourier dönüşümü kızılötesi (FTIR) analizi
- Kızılötesi spektrumları (Şekil 4) 4000-500 cm-1 aralığında bir FTIR spektrometresine kaydedin. Numuneler daha önce film oluşturmak için KBr ile karıştırılmalıdır (standart FTIR prosedürü; üreticinin talimatlarına ve Malzeme Tablosuna bakınız).
- Moleküler kompozisyon analizi
- SβG'lerin moleküler bileşimlerini, standart prosedürleri izleyerek yüksek performanslı ince tabaka kromatografisi (HPTLC) ve kütle spektrometresine (GC-MS) bağlı gaz kromatografisi ile tahmin edin12.
2. β-glukan kaynaklı mikroglia stimülasyonunun in vitro çalışması
- 8 kuyucuklu odacıklı slaytlarda fare glioblastoma ve mikroglia hücrelerinin hücre kültürü
NOT: Bu protokol GL261 (glioblastoma) ve BV2 (mikroglia) hücre hatları için spesifiktir. Bununla birlikte, küçük değişikliklerle, bu adımlar potansiyel olarak diğer kanser ve bağışıklık hücresi hatlarını incelemek için kullanılabilir.- Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium (DMEM) komple ortamını L-glutamin, 4.5 g / L D-glikoz ile modifiye edilmiş ve piruvat olmadan hazırlayın. Fetal sığır serumunun (FBS) %10'unu ve %1'ini penisilin/streptomisin ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu). Malzemeyi 37 ° C'de bir su banyosunda 15 dakika boyunca önceden ısıtın.
- Dondurulmuş BV2 ve GL261 aliquotlarını 2 dakika boyunca bir su banyosuna (37 ° C) çözün ve tamamen çözülmeden hemen önce, onları laminer bir akış başlığına taşıyın ve hücreleri iki farklı steril T25 şişesine (her hücre hattı için bir tane) plakalayın.
- T25 şişelerini 37 ° C'de,% 5 CO2'de kültür birleşene kadar inkübe edin.
NOT: Donma koşullarına ve kriyoprezervasyon altındaki süreye bağlı olarak, birleşme süresi değişebilir. Bu hücre hatları genellikle bir T75 şişesinde akıcılığa ulaşmak için 3 ila 5 gün gerektirir. - BV2 hücre kültürü birleştikten sonra, 0.6 x 106 hücre / kuyucuklu 8 delikli oda slaytlarına aktarın. 8 delikli oda slaytlarını inkübatörde 24 saat boyunca saklayın.
- Mikroglia hücreleri 8 delikli oda slaytlarına kaplandıktan sonra, GL261 hücreleri ile aynı protokolü tekrarlayın.
- Mikroglia'nın β-glukanlarla aktivasyonu
- BV2 hücrelerini dört farklı β-glukan (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus) ile 72 saat boyunca 0.2 mg / mL konsantrasyonda kaplayın. Bir deneysel koşul, kontrol grubu olarak hareket ederek tedavi edilmeden (normal ortam) kalmalıdır.
- Süpernatantı 72 saat sonra bir pipetle toplayın ve kalan hacmi 0,20 μm'lik bir şırınga filtresinden geçirin. Ardından, süpernatantı -80 ° C'de en az 24 saat dondurun.
- GL261'in önceden aktive edilmiş mikroglia şartlandırılmış ortam ile tedavisi
- GL261, 8 delikli hazneli kızaklar içinde% 80 oranında birleştiğinde, 72 saat boyunca% 25'lik bir son hacim konsantrasyonunda (toplam hacim: 250 μl / kuyu) β-glukanla muamele edilmiş mikroglial ortam (adım 2.2.2) ekleyin.
- 72 saatlik inkübasyondan sonra ortamı çıkarın ve atın.
- Hücreleri fosfat tampon salin (PBS; pH 7.4, 0.1 M) ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- 15 dakika boyunca 4 ° C'de 200 μL% 4 paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin.
NOT: İmmünofloresan için kullanılabilecek farklı antikorlara bağlı olarak, fiksasyon yöntemleri tipik% 4 PFA'dan farklı olabilir. Alkol bazlı fiksatifler, bazı epitopların korunmasında daha etkili olabilir.
- İmmünofloresan çalışması
- Numuneleri PBS ile triton X (PBST; %0,01) ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- PBST'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBST'de (Tablo 1) sığır serum albümini (BSA) bloke edici tamponu% 10 ekleyin.
- Bloke edici tamponu çıkarın ve birincil antikor karışımını içeren PBS kuyucuğu başına 200 μL ekleyin (1:500 sıçan Ki-67 monoklonal antikoru ve 1:500 tavşan parçalanmış kaspaz-3 antikoru; bakınız Malzeme Tablosu). Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- 4 ° C'de 24 saat inkübasyondan sonra, numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.
- Kuyucukları bir çalkalayıcıda PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın (düşük hız).
- PBS'yi çıkarın ve karanlıkta oda sıcaklığında 45 dakika boyunca ikincil antikorların (1:200 eşek anti-sıçan IgG (H + L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 488 ve 1:200 eşek anti-tavşan IgG (H + L) yüksek oranda çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor 647; bkz.
- Numuneleri PBS ile çok amaçlı bir çalkalayıcıda 10 dakika yıkayın.
- PBS'yi çıkarın ve 1 dakika boyunca PBS'de (1:5.000) seyreltilmiş 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) kuyucuğu başına 200 μL ekleyin.
- DAPI'yi çıkarın (bkz. malzemeler tablosu) ve hücreleri PBS'de 5 dakika yıkayın.
- Kuyu çerçevesini çıkarın ve her bir oyuğa 50 μL PBS:gliserol (1:1) ekleyin ve bir kapak kayması ile örtün.
- Slaytları oje ile kapatın.
- Konfokal mikroskop sistemi kullanarak 20x'te görüntüler elde edin (bkz.
3. Tümör hücresi proliferasyonu ve apoptozun nicelleştirilmesi ve analizi
NOT: Farklı β-glukanların tümör hücresi proliferasyonu ve apoptoz üzerindeki potansiyel etkisini ölçmek için, ImageJ yazılımında Ki67 (proliferasyon) ve cCasp3 (apoptoz)13'ün pozitif piksellerinin sayısını ölçmek için şirket içi bir komut dosyası kullanılmıştır.
- ImageJ'yi açın. Eklentiler düğmesine tıklayın. Daha önce eklenti klasörüne yüklenmiş bir eklenti olan Coloc2'ye tıklayın ve son olarak analiz etmek için resmi seçin11.
NOT: Bu eklenti, Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca) ile önceki temasın ardından mevcuttu. Komut dosyası yerine, hem ImageJ hem de Fiji yazılımı, benzer özelliklere sahip kolokalizasyon analizi için farklı araçlara sahiptir (bkz. - Eşikleri kontrol (işlenmemiş, yalnızca DMEM) koşullarına göre ayarlayın. Tamam düğmesine tıklayın.
NOT: Arka plan ve yoğunluk tutarsızlıklarını önlemek için, tüm görüntüler aynı koşullar altında çekilmelidir. Tercihen, görüntüleme seansları aynı gün yapılmalı ve mikroskop parametreleri görüntüler arasında değişmeden yapılmalıdır. - Birlikte yerelleştirilmiş piksellerin elde edilen görüntülerinin ve eşiğin üzerindeki piksellerin yüzdesini veya ham sayısını sağlayan bir özet penceresinin açıldığından emin olun. Kontrol (tedavi edilmemiş) koşullarına göre sonuçları normalleştirin.
NOT: Tüm veriler SEM'± ortalama olarak verilmiştir. İstatistiksel analiz grafik ve analiz yazılımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir (bakınız Malzeme Tablosu). Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA kullanıldı. Hatalar, ortalamanın (s.e.m.) standart hatası olarak temsil edilir (*p < 0.05, **p < 0.01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
β-glukanların başarılı bir şekilde saflaştırılması
Ekstraksiyon ve saflaştırma işlemini takiben P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'un meyve veren cisimciklerinden elde edilen MP, SMP ve SβG'lerin kütlesi Tablo 1'de özetlenmiştir. Mantarlardan elde edilen MP, SMP ve SβG'lerin temel bileşimi (toplam karbonhidratlar, β-glukanlar ve protein) Tablo 2'de gösterilmiştir. Bu sonuçlar, protokolün SMP'lerde büyük miktarda protein içeriğinin alınmasına nasıl izin verdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, α-amilaz / glukoamilaz ve proteaz ile enzimatik tedavi, protein miktarını azalttı ve β-glukan konsantrasyonunu arttırdı.
Farklı SβG'lerin UV spektrumları, 260 ve 280 nm'de UV absorpsiyon zirveleri göstermedi (Şekil 2A), SβG'lerin nükleik asitlerden (260 nm) ve proteinlerden (280 nm) yoksun olduğunu gösterdi. Ayrıca, SβG'lerin homojenliği, UV-görünür absorpsiyon spektroelektrokimyası (SEC) sonrasında test edilmiştir. Kromatograflar (Şekil 3), H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus ve P. djamor için sırasıyla 8.20, 10.5, 10.9 ve 11.3 dakikada ana keskin ve tek bir tepe noktası ile iyi homojenlik göstermiştir. Bu veriler, fraksiyonun homopolimerlerle tutarlı olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kalibrasyon eğrisi denklemine göre ağırlık ortalaması Mw, H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus ve P. djamor için sırasıyla 120.8, 92.8, 80.7 ve 75.9 kDa civarında hesaplanmıştır (y = -0.0655x + 2.6194; R2 = 0.9951).
FTIR spektrumları, kovalent polisakkarit bağlarına karşılık gelen moleküler titreşimleri ölçtü (Şekil 4). Spektrumlar, yaklaşık 3.435 cm-1'de geniş ve yoğun bir hidroksil grubu sergiledi. Ayrıca, polisakkaritler14'e karşılık gelen yaklaşık 2.922 cm-1'de zayıf bir C-H-gerilme zirvesi gösterdi. Ayrıca, yaklaşık 1.641 cm-1'deki absorbans, C = O ve CN gruplarının uzama titreşimleriyle ilgili olarak amid I15'e atanabilir. Yaklaşık 1.154 cm-1'deki sinyal, glikosidik bağlantı16'nın C-O-C asimetrik gerilmesinden kaynaklanıyor olabilir. Son olarak, yaklaşık 1.072 cm-1'deki bant, β-glukanların16'sının C-O gerilmesini gösterdi. 893 cm-1 yakınlarındaki zayıf emilim, β-piranozun asimetrik kırılma titreşiminden kaynaklanıyor olabilir ve şeker ünitelerinin β konfigürasyonunu gösterir17. Genel olarak, SβG'lerin esas olarak minimum miktarda protein ile konjuge edilmiş karbonhidrattan oluştuğu bulunmuştur.
SβG'lerin monosakkarit profili HPTLC ve GC-MS tarafından daha fazla incelenmiştir. Daha az miktarda D-galaktoz ve D-mannoz içeren büyük miktarda D-glikozun varlığı ve bir D-ksiloz, D-ramnoz, D-fukoz ve L-arabinoz izi doğrulandı. Tablo 3 , H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus ve P. djamor'un SβG'leri için elde edilen sonuçları özetlemektedir.
β-glukan ile önceden aktive edilen mikroglia şartlandırılmış ortam, kanser hücrelerinde apoptozu indükledi
Seçilen mantarlardan elde edilen β-glukanlar başarılı bir şekilde izole edildikten ve tamamen karakterize edildikten sonra, mikroglia hücre kültürüne (BV2) eklendi. GL261 hücrelerine mikroglia şartlandırılmış ortamın eklenmesinden 72 saat sonra (Şekil 5), proliferasyon (Ki67) ve apoptoz (yarıklı kaspaz 3 [cCasp3]) için iki anahtar belirtecin ekspresyonu immünofloresan ile ölçüldü. ImageJ yazılımında şirket içi bir komut dosyası kullanılarak, her floresan kanal için pozitif piksel sayısı ölçüldü ve böylece β-glukan kaynaklı mikroglial aktivasyonun potansiyel etkisinin tümör hücrelerinin davranışını nasıl etkileyebileceği analiz edildi. Kontrol örneklerini her floroforun yoğunluğu için bir eşik olarak kullanan komut dosyası, piksel sayısını sağladı ve böylece farklı deney koşullarından sonra her bir belirteç için ifadeyi gösterdi (Şekil 6).
İlginçtir ki, GL261, farklı mikroglia şartlandırılmış ortamlara maruz kaldıktan sonra tümör proliferasyonu açısından anlamlı bir fark yaşamamıştır (Şekil 7). Bununla birlikte, P. djamor (B) ve H. erinaceus (C), cCasp3'ün güçlü bir indüksiyonunu (sırasıyla yaklaşık altı kat ve dokuz kat artış) göstermiştir.
Şekil 1: İzolasyon protokolü. SβG preparatını P. streatus, P. djamor, H. erinaceus ve G. lucidum'dan izole etmek ve saflaştırmak için protokolün şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: β-glukanların UV spektrumları. (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor ve (D) H. erinaceus'un 200-400 nm bölgesindeki UV spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Boyut dışlama kromatogramları. (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor ve (D) H. erinaceus'un boyut dışlama kromatogramları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 4: FTIR spektrumları. (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor ve (D) H. erinaceus'un Fourier dönüşümlü kızılötesi (FTIR) spektrumları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Ko-stimülasyon testlerinin şeması. Fare mikroglia (BV2) hücrelerinin 72 saat boyunca β-glukanlarla kaplandığı ko-stimülasyon testi. Kriyokonserve edildikten ve filtrelendikten sonra, süpernatant toplandı ve 72 saat boyunca GL261 hücre kültürüne (% 25) aktarıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Proliferasyon ve apoptoz görüntüleri. GL261'in DAPI (mavi), Ki67 (yeşil) ve cCasp3 (kırmızı) ile üçlü bir kolokalizasyonunu gösteren immünofloresan görüntüleri. 'Prob Coloc' betiği (alttaki resimler), her bir işaretleyiciden gelen pozitif piksellerin sayısını ölçmeye ve aralarında kolokalizasyona izin verdi. Ölçek çubuğu: 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Proliferasyon hızlarının ve apoptozun kantitasyonu. Mikroglia şartlandırılmış ortam sunumundan sonra GL261 hücrelerinde Ki67 (solda) ve cCasp3 (sağda) ekspresyonunun kontrol koşullarına (DMEM) göre normalleştirilmiş değerler. (A) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Hatalar s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01) olarak temsil edilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| MP (g) | SMP'ler (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201.3 ± 2.2 | 14,4 ± 0,9 (%7,1) | 5,3 ± 0,2 (%2,6) |
| P. djamor · | 200.8 ± 1.9 | 13,5 ± 0,6 (%6,7) | 4,9 ± 0,3 (%2,4) |
| G. lucidum | 201.8 ± 1.6 | 14,7 ± 1,2 (%7,3) | 5,5 ± 0,2 (%2,7) |
| H. erinaceus | 204.2 ± 1.2 | 15,4 ± 0,8 (%7,5) | 5,7 ± 0,2 (%2,8) |
Tablo 1: Glukan içeriği tablosu. P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'un meyve veren cisimciklerinden MP, SMP ve SβG'lerin elde edilmesi için kütle dengesi.
| MP | SMP'ler | SβG'ler | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53.8 ± 2.3 | 90.1 ± 1.2 | |
| P. ostreatus | β-Glukan (%) | 22.7 ± 1.4 | 31.3 ± 2.4 | 89.4 ± 2.3 |
| Protein (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68.3 ± 2.1 | 61.4 ± 3.1 | 93.4 ± 1.1 | |
| P. djamor · | β-Glukan (%) | 24.3 ± 2.8 | 30,8 ± 3,5 | 91.3 ± 3.4 |
| Protein (%) | 19.9 ± 1.0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-Glukan (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3,1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Protein (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67.4 ± 1.2 | 58,9 ± 1,9 | 93.8 ± 1.4 |
| β-Glukan (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Protein (%) | 17.6 ± 1.3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tablo 2: Toplam karbonhidratlar. Toplam karbonhidratların (CHt), β-glukan ve MP, SMP'ler ve SβG'lerin proteinlerinin kuru ağırlık (g) içeriği. Kjeldah yöntemi12 ile ölçülen protein içeriği (MP). (*, Lowry yöntemi9 ile ölçülen proteinler).
| D-Gluk (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Ksilo (%) | D-Rham (%) | L-Arap (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3.8 ± 0.1 | 2.1 ± 0.2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | n.d |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2.6 ± 0.2 | 1,9 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | n.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4.4 ± 0.1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| P. djamor · | 95,2 ± 0,7 | 1.7 ± 0.2 | 1.1 ± 0.1 | 0,3 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
Tablo 3: Monosakaritlerin karakterizasyonu. P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'un SβG'lerinin monosakkarit profili (n.d., bazı monosakkaritler tespit edilememiştir).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma, SβG'lerin içeriğini dört farklı mantardan başarılı bir şekilde izole etmek, saflaştırmak ve karakterize etmek için köklü tekniklerin kullanımını açıklamaktadır. Sonuçlar, P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ve H. erinaceus'tan elde edilen SMP'lerin sıcak su ekstraksiyonundan ve ardından α-amilaz, glukozidaz ve proteaz ile hidrolitik işlemden sonra, α-glukan ve protein içeriğinin nasıl azaldığını ve böylece saf SβG'lerin miktarını önemli ölçüde zenginleştirdiğini göstermiştir.
Buna rağmen, mantar β-glukanların çoğunun saflaştırma işlemi sırasında suda çözünmez olduğunu gözlemledik. Çalışmanın ana ilgi alanı, tıbbi/farmasötik özelliklerinden dolayı SβG'lerdi10,18. Ayrıca, hidrolitik işleme, etanol çökeltme ve diyaliz sayesinde, çözünür düşük moleküler ağırlıklı karbonhidratlar, peptitler, oligopeptitler ve amino asitler SMP'lerden başarıyla uzaklaştırıldı ve farklı bir mantar türü kullanan ancak benzer işlemlere sahip diğer önceki çalışmalara benzer bir verimlilik gösterdi19,20.
SβG'lerin saflığını test etmek için, farklı SβG'lerin UV spektrumları, 200-400 nm bölgesindeki numuneleri tarayarak UV spektrofotometrisi ile araştırıldı. 260 ve 280 nm'de hiçbir UV absorpsiyon zirvesi gözlenmedi, bu da SβG'lerin ne nükleik asitlere (260 nm) ne de proteinlere (280 nm) sahip olmadığını gösterdi, böylece β-glukanların esas olarak SβG'leri oluşturduğunu tekrar gösterdi. Her ne kadar 200-400 nm bölgesindeki UV spektrumları, 280 nm'de tanımlanmış / keskin bir seçimin olmadığını gösterse de, küçük bir tepe noktası hala gözlemlenebilir. Bu, Tablo 2'de gösterilen sonuçlarla aynı fikirde olan az miktarda polisakkaride bağlı proteinlerin varlığı ile açıklanabilir. Bununla birlikte, bu kadar ihmal edilebilir miktarda polisakkaritin, glukanlar tarafından korunabilen kalan proteinlere veya glukana bağlı proteinlerin tamamen bozulmasını önleyen sterik etkilerle korunabilecek gecikmiş erişim ile de açıklanabileceğini düşünmek ilginçtir. Daha da önemlisi, SβG'lerin homojenliği, çözünmüş molekülleri boyutlarına göre saflaştırmak için kullanılan ve protokol sonuçlarını doğrulayan güçlü bir analitik teknik olan SEC tarafından daha da test edildi.
Ek olarak, kovalent polisakkarit bağlarına karşılık gelen moleküler titreşimleri ölçmek için FTIR spektrumları kullanılmıştır. Daha önce tarif edildiği gibi, dört mantarın tümü için benzer spektrumlar elde edilmiştir. Spektrum özelliği, polisakkaritler 14, amid I15 ve β-glukanlar16'nın varlığını sergiledi. 893 cm-1 yakınlarındaki zayıf emilim, şeker ünitelerinin β konfigürasyonunu önerdi17. Genel olarak, SβG'lerin esas olarak minimal protein ile konjuge edilmiş karbonhidratlardan oluştuğu bulunmuştur. SβG'lerin immünomodülatör moleküller olarak kullanılmasına olan ilgiyle ilgili olarak, polisakkarit-protein komplekslerinin immünomodülatör yararları için sıklıkla not edildiğini vurgulamakta fayda vardır21.
Son olarak, SβG'lerin monosakkarit profili HPTLC ve GC-MS tarafından incelenmiştir. Daha az miktarda D-galaktoz ve D-mannoz ve D-ksiloz, D-ramnoz ve D-fukoz izleri içeren büyük miktarda D-glikozun varlığı, kesinlikle SβG'lerdeki baskın bileşenin β-glukan olduğu anlamına gelir. Bununla birlikte, arıtma sistemimizin farklı klasik prosedürlerin optimize edilmesinden kaynaklandığını açıklığa kavuşturmak önemlidir. Şu anda, esas olarak kromatografi tekniklerine (boyut dışlama ve iyon değişim kromatografisi) odaklanan birkaç adımı geliştirmek için çalışıyoruz.
β-glukanların bağışıklık hücreleri üzerindeki etkisini test etmek olan bu çalışmanın temel amacı ile ilgili olarak, dört farklı β-glukan türü başarılı bir şekilde saflaştırıldıktan sonra, mikroglia aktivasyonu üzerindeki potansiyel etkileri test edilmiştir. İmmünofloresan, proliferasyon ve apoptoz22,23 için iki altın standart belirteçte karşı kullanıldı.
Tümör proliferasyon hızlarında istatistiksel bir farklılık olmamasına rağmen, P. ostreatus (A) ve H. erinaceus (C) Ki67 ekspresyonunu% 50'ye kadar düşürebildi. Anlamlılık eksikliği muhtemelen G. lucidum ile ilgili çalışmadaki yüksek varyanstan kaynaklanmaktadır. Ayrıca, kanser hücrelerinde apoptozun indüksiyonu oldukça ilginç bir terapötik yaklaşımdır ve P. djamor (B) ve H. erinaceus (C), hücre ölüm programının aktivasyonunu düşündüren cCasp3 seviyelerinin önemli bir indüksiyonunu göstermiştir. Tüm bu sonuçlar, bu mantarların diğer tümör tiplerinde anti-tümöral etkisini gösteren önceki çalışmalarla uyumludur24,25. Deneyler, aynı koşulları koruyarak ve aynı araştırmacılar tarafından yönetilerek çoğaltılarak gerçekleştirildi. İmmünofloresan çalışmalarından elde edilen sonuçların yazılım tabanlı analizi, tarafsız bir yaklaşımı desteklemekte ve bu çalışmanın potansiyel erişimini arttırmaktadır.
Genel olarak, bu çalışmalar, bileşiklerin saflığı olan β-glukanların kullanımı ile ilgili temel bir zorluğa sahiptir. İmmünolojik çalışmalarda kullanıldıktan sonra, gözlemlenen etkilerin yalnızca karbonhidratlar tarafından provoke edildiğini ve saflaştırma yeterince yapılmazsa bunlara bağlı kalabilecek proteinler veya diğer yapılar nedeniyle olmadığını doğrulamak için en yüksek standartları takip etmek zorunludur. Gelecekteki çalışmalarda göz önünde bulundurulabilecek ekstra bir adım, kromatografi tekniklerinin kullanılmasıdır (örneğin, iyon değişimi veya boyut dışlama).
Çalışmalardan sonraki genel sonuç, H. erinaceus'u , tümör proliferasyonunu (~% 50) düşürme ve glioblastoma hücrelerinde hücre ölüm programının güçlü aktivasyonunu indükleme kabiliyeti nedeniyle, glioblastoma tedavisi için potansiyel bir immünoterapötik seçenek olarak en iyi aday olarak yerleştirmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Beyan edilecek rakip çıkarlar yoktur.
Acknowledgments
Dr. Vasiliki Economopoulos'a ImageJ'deki fuluorescence sinyalini ölçmek için hazırladığı kurum içi senaryosu için teşekkür ederiz. Ayrıca CITIUS'a (Sevilla Üniversitesi) ve tüm personeline gösteri sırasındaki destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma İspanyol FEDER I + D + i-USE, Sevilla Üniversitesi'nden US-1264152 ve Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
