Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Reinigungsschritte und anschließenden Studien von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen als potentielle immunmodulatorische Moleküle, die die antitumoralen Eigenschaften von Mikroglia gegen Glioblastomzellen verbessern.
Abstract
Eine der größten Herausforderungen bei der Entwicklung wirksamer Therapien gegen das Glioblastom ist die Überwindung der starken Immunsuppression in der Tumormikroumgebung. Die Immuntherapie hat sich als wirksame Strategie herausgestellt, um die Reaktion des Immunsystems gegen Tumorzellen zu richten. Gliom-assoziierte Makrophagen und Mikroglia (GAMs) sind wichtige Treiber solcher entzündungshemmenden Szenarien. Daher könnte die Verstärkung des antikanzerösen Ansprechens bei GAMs eine potenzielle co-adjuvante Therapie zur Behandlung von Glioblastom-Patienten darstellen. In diesem Sinne sind pilzliche β-Glucan-Moleküle seit langem als starke Immunmodulatoren bekannt. Ihre Fähigkeit, die angeborene Immunaktivität zu stimulieren und das Ansprechen auf die Behandlung zu verbessern, wurde beschrieben. Diese modulierenden Eigenschaften werden zum Teil auf ihre Fähigkeit zurückgeführt, an Mustererkennungsrezeptoren zu binden, die interessanterweise in GAMs stark exprimiert werden. Daher konzentriert sich diese Arbeit auf die Isolierung, Reinigung und anschließende Verwendung von pilzlichen β-Glucanen zur Verbesserung der tumoriziden Reaktion von Mikroglia gegen Glioblastomzellen. Die Maus-Zelllinien Glioblastom (GL261) und Mikroglia (BV-2) werden verwendet, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von vier verschiedenen pilzlichen β-Glucanen zu testen, die aus Pilzen extrahiert werden, die in der aktuellen biopharmazeutischen Industrie stark verwendet werden: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus und Ganoderma lucidum. Um diese Verbindungen zu testen, wurden Co-Stimulations-Assays durchgeführt, um die Wirkung eines voraktivierten Mikroglia-konditionierten Mediums auf die Proliferation und Apoptose-Aktivierung in Glioblastomzellen zu messen.
Introduction
Trotz neuer Errungenschaften auf dem Gebiet der Neuroonkologie ist die Lebenserwartung von Glioblastom-Patienten nach wie vor gering. Goldstandard-Therapien gegen Hirntumore basieren auf der Verschmelzung von Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie. In den letzten zehn Jahren hat sich die Immuntherapie jedoch zu einer wirksamen Strategie zur Behandlung verschiedener Krebsarten entwickelt1. So ist die Möglichkeit, die körpereigene Immunantwort gegen Tumorzellen nutzbar zu machen, in jüngster Zeit zur vierten Säule der Onkologie geworden.
Es ist seit langem bekannt, dass eine der größten Herausforderungen auf diesem Gebiet darin besteht, die starke Immunsuppression in der Tumormikroumgebung zu überwinden2. Insbesondere im Fall des Glioblastoms, einer der häufigsten und aggressivsten Formen von Hirntumoren, könnte die Entschlüsselung wichtiger Signalwege, die solche pro-tumoralen Szenarien orchestrieren, und die Suche nach neuen Verbindungen, die der depressiven Reaktion des Immunsystems entgegenwirken könnten, den Weg für zukünftige Therapien gegen diese unheilbare Krankheit ebnen.
Das Gehirn besitzt eigene Zellen des Immunsystems, und der relevanteste Zelltyp sind Mikroglia. Es wurde nachgewiesen, dass diese Zellen ein ziemlich komplexes Verhalten bei verschiedenen zentralen Krankheiten aufweisen3. Bei primären Hirntumoren (z.B. Glioblastom) werden diese Zellen in Richtung eines antiinflammatorischen Phänotyps verschoben, der Tumorzellen bei der Besiedlung des Hirnparenchyms unterstützt3. Zahlreiche Veröffentlichungen belegen die wichtige Rolle dieser Zellen bei der Tumorprogression. Einer der Hauptgründe dafür ist, dass Gliom-assoziierte Mikroglia und infiltrierte Makrophagen (GAMs) ein Drittel der gesamten Tumormasse ausmachen, was auf den eindeutigen Einfluss ihrer Aktivierungszustände während der Progression von Hirntumoren hindeutet 4,5.
In diesem Sinne wurden pilzliche β-Glucane als starke Moleküle beschrieben, die wirksame Immunreaktionen auslösen, einschließlich Phagozytose und Produktion entzündungsfördernder Faktoren, was zur Eliminierung schädlicher Stoffe führt 6,7,8,9,10. Pilze β-Glucane wurden im Allgemeinen mit Extrakten aus verschiedenen Pilzteilen untersucht. Die Zuordnung spezifischer Wirkungen erfordert jedoch eine Reinigung, um Mehrdeutigkeiten zu vermeiden und den Wirkmechanismus solcher Moleküle als immunmodulatorische Wirkstoffe verstehen zu können8.
In dieser Arbeit werden lösliche β-Glucane aus dem Fruchtkörper von vier verschiedenen Pilzen gereinigt, die regelmäßig als essbare (Pleurotus ostreatus und Pleurotus djamor) und als Heilpilze (Ganoderma lucidum und Hericium erinaceus) verwendet werden. Insbesondere in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie finden diese vier Pilze große Verwendung und wurden im Rahmen einer umweltfreundlichen Kreislaufwirtschaft in einem Gewerbebetrieb hergestellt (siehe Materialtabelle).
Um den Grundstein für den zukünftigen Einsatz von Pilz-β-Glucanen in der Therapie von Hirntumoren zu legen, sind klar definierte Aufreinigungsstrategien und präklinische Studien, die sich mit ihrer mutmaßlichen Interaktion mit Zellen des Immunsystems befassen, unerlässlich, um ihre potenzielle Rolle als Anti-Tumor-Mediatoren zu bewerten. Diese Arbeit beschreibt die zahlreichen Schritte der Isolierung und Reinigung, die erforderlich sind, um die löslichen β-Glucane zu gewinnen, die in den Fruchtkörpern des ausgewählten Pilzes enthalten sind. Nach erfolgreicher Reinigung werden die Mikrogliazellen aktiviert, um ihren entzündlichen Phänotyp zu verstärken. Maus-Glioblastomzellen (GL261) werden mit einem anderen Mikroglia-konditionierten Medium beschichtet, das zuvor mit diesen Extrakten behandelt wurde, und dann wird seine Wirkung auf das Verhalten der Tumorzellen untersucht. Interessanterweise haben Pilotstudien aus unserem Labor (Daten nicht gezeigt) aufgedeckt, wie entzündungsfördernde Mikroglia die Migration von Tumorzellen und die Invasionseigenschaften nicht nur in Glioblastomzellen, sondern auch in anderen Krebszelllinien verlangsamen können. Diese multidisziplinäre Arbeit könnte ein nützliches Werkzeug für Onkologieforscher sein, um vielversprechende Wirkstoffe zu testen, die in der Lage sind, die Immunantwort bei vielen verschiedenen Tumorarten zu verstärken.
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Protocol
Die vier verschiedenen Pilzvarianten, die in diesem Protokoll beschrieben werden, wurden aus einer kommerziellen Quelle gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Isolierung von pilzlichen β-Glucanen
- Extraktion und Isolierung von löslichen Pilzpolysacchariden
HINWEIS: Lösliche Pilzpolysaccharide (SMPs) wurden gemäß dem in Abbildung 1 schematisch dargestellten Verfahren erhalten.- Spülen Sie frische Fruchtkörper von P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum (ca. 2.000 g/Pilz) fünfmal vorsichtig in destilliertem Wasser ab.
- Trocknen Sie die Fruchtkörper bei 50 ± 2 °C in einem konventionellen Lufttrockner, bis ein konstantes Gewicht erreicht ist (~24 h).
- Mahlen Sie die getrockneten Pilze in einer Messermühle und erhalten Sie von jedem Pilz etwa 200 g Pulver.
- 100 g Pilzpulver (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum) in 1.000 mlH2Od suspendieren. Dann 15 Minuten bei 121 °C autoklavieren und schließlich 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
- Die resultierende Suspension wird bei 6.000 x g 10 min bei 4 °C zentrifugiert.
- Trocknen Sie den Niederschlag mit unlöslichen Pilzpolysacchariden (IMPs) bei 50 ± 2 °C in einem Lufttrocknungsofen für 24 h.
- Entsorgen Sie den Niederschlag und bewahren Sie den Überstand auf. Konzentrieren Sie den Überstand 10 Mal in einem Rotationsverdampfer.
- Das SMP-haltige Konzentrat mit Ethanol (80 % Endkonzentration) wird über Nacht bei 4 °C ausgefällt.
- Zentrifugieren Sie die Ethanolsuspension bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C, halten Sie das Pellet zurück (Niederschlag) und entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette.
- Waschen Sie den Niederschlag dreimal mit 80 % Ethanol, bevor Sie ihn in H2Od (10 % w/v) auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 6,5/7 und die Temperatur auf 37 °C ein und behandeln Sie mit 2 U bzw. 4 U α-Amylase und Glucoamylase, um α-Glucane gemäß den Anweisungen des Herstellers zu lösen (siehe Materialtabelle).
- Nach der Behandlung mit α-Amylase/Glucoamylase den pH-Wert und die Temperatur auf 8,0 bzw. 50 °C einstellen und mit Alcalase (2,5 E/g Protein) behandeln (siehe Materialtabelle), um die Proteine zu lösen.
HINWEIS: Bei dieser sequenziellen enzymatischen Behandlung werden die meisten α-Glucane und Proteine entfernt, die zusammen mit β-Glucanen in der Ethanolfällung ausfallen. - Nach der Hydrolyse wird das Hydrolysat bei 6.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert und der saubere Überstand fünfmal in einem Rotationsverdampfer konzentriert. Erneut mit 80%igem Ethanol ausfällen.
- Den resultierenden Niederschlag in H2Od auflösen und 24 h lang in destilliertem Wasser dialysieren, wobei Zelluloseschlauchmembranen (12.000Da Cut-off-Membranen; siehe Materialtabelle) verwendet werden, um niedermolekulare Moleküle zu entfernen. Gewinnen Sie den wasserlöslichen Teil zurück und trocknen Sie ihn gefrier, um lösliche β-Glucane (SβGs) herzustellen.
- Zucker- und Proteinmessung
- Messen Sie den Gesamtzuckergehalt jeder Fraktion mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode, wobei Glukose als Standard verwendetwird 8.
ANMERKUNG: Die Quantifizierung des β-Glucan-Gehalts kann auch mit dem β-Glucan-Assay-Kit (Pilz und Hefe; siehe Materialtabelle) erfolgen, das auf enzymatischer Hydrolyse und der Aktivität von Oxidoreduktasen basiert: nämlich exo-1,3-β-Glucanase, Glucoseoxidase, β-Glucosidase und Peroxidase, mit anschließender Bildung des Chinonimins. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers mit geringfügigen Änderungen. - Verwenden Sie 18 MH 2SO 4 anstelle von 12 MH2SO4.
- Bewerten Sie den Gehalt der Gesamtglucane und der α-Glucane separat.
- Messen Sie die resultierenden β-Glucan-Werte als Differenz zwischen den Gesamt-Glucan- und α-Glucan-Werten (dreifach) nach dem Kjeldahl-Protokoll. In bestimmten Fällen kann der Proteingehalt mit der Lowry-Methode bestimmt werden, wobei Albumin verwendet wird, um die Kalibrierungskurve11,12 aufzuzeichnen.
- Messen Sie den Gesamtzuckergehalt jeder Fraktion mit der Phenol-Schwefelsäure-Methode, wobei Glukose als Standard verwendetwird 8.
- Analyse der Ultraviolett-Absorptionsspektroskopie
- Erhalten Sie die ultravioletten (UV) SβG-Spektren mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), indem Sie die Proben im Bereich von 200-400 nm scannen (Abbildung 2).
- Bereiten Sie 1,0 mg/ml jedes SβG inH2Od vor, übertragen Sie die Lösung in eine Quarzküvette und scannen Sie sie bei Raumtemperatur.
- Analyse der Molekulargewichtsverteilung
- Abschätzung der Homöogenität von SβGs und des Molekulargewichts von Polymeren mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung eines Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystems (HPLC) (siehe Materialtabelle), das mit einem Brechungsindexdetektor und einer linearen Ultra-Hydrogel-Gelfiltrationssäule (300 mm x 7,8 mm; Abbildung 3).
- Führen Sie den Test bei 40 °C mit deionisiertem Wasser als Laufmittel mit einer Durchflussrate von 0,5 ml/min-1 und Dextran (110, 80 und 50 kDa) als Standard durch (siehe Materialtabelle). Sammeln Sie eine 5-ml-Fraktion.
- Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Analyse
- Nehmen Sie die Infrarotspektren (Abbildung 4) mit einem FTIR-Spektrometer im Bereich von 4000-500 cm-1 auf. Die Proben sollten zuvor mit KBr gemischt werden, um Filme zu bilden (Standard-FTIR-Verfahren; siehe Herstelleranweisung und Materialtabelle).
- Analyse der molekularen Zusammensetzung
- Schätzung der molekularen Zusammensetzung von SβGs mittels Hochleistungs-Dünnschichtchromatographie (HPTLC) sowie Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS) nach Standardverfahren12.
2. In-vitro-Studie zur β-Glucan-induzierten Mikroglia-Stimulation
- Zellkultur von Maus-Glioblastom- und Mikrogliazellen in 8-Well-Kammerobjektträgern
HINWEIS: Dieses Protokoll ist spezifisch für GL261 (Glioblastom) und BV2 (Mikroglia) Zelllinien. Mit leichten Modifikationen könnten diese Schritte jedoch möglicherweise zur Untersuchung anderer Krebs- und Immunzelllinien verwendet werden.- Bereiten Sie das modifizierte Eagle's Medium (DMEM) von Dulbecco zu, das mit L-Glutamin, 4,5 g/L D-Glukose und ohne Pyruvat modifiziert ist. Fügen Sie 10 % fötales Kälberserum (FBS) und 1 % Penicillin/Streptomycin hinzu (siehe Materialtabelle). Das Material im Wasserbad bei 37 °C für 15 min vorwärmen.
- Tauen Sie gefrorene BV2- und GL261-Aliquots 2 Minuten lang in einem Wasserbad (37 °C) auf und tragen Sie sie kurz vor dem vollständigen Auftauen in eine Laminar-Flow-Haube und plattieren Sie die Zellen in zwei verschiedene sterile T25-Kolben (einen für jede Zelllinie).
- Inkubieren Sie die T25-Kolben bei 37 °C, 5 % CO2 , bis die Kultur konfluent ist.
HINWEIS: Abhängig von den Gefrierbedingungen und der Zeit der Kryokonservierung kann die Zeit bis zum Zusammenfluss variieren. Diese Zelllinien benötigen in der Regel zwischen 3 und 5 Tagen, um die Konfluenz in einem T75-Kolben zu erreichen. - Nachdem die BV2-Zellkultur konfluiert ist, wird sie in Objektträger mit 8 Wells und 0,6 x 106 Zellen/Well überführt. Bewahren Sie die Objektträger mit 8 Wells 24 Stunden im Inkubator auf.
- Sobald die Mikrogliazellen in die 8-Well-Kammer-Objektträger eingebracht sind, wiederholen Sie das gleiche Protokoll mit den GL261-Zellen.
- Aktivierung von Mikroglia mit β-Glucanen
- Beschichten Sie die BV2-Zellen 72 h lang mit vier verschiedenen β-Glucanen (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus) in einer Konzentration von 0,2 mg/ml. Eine Versuchsbedingung muss unbehandelt bleiben (normales Medium) und als Kontrollgruppe fungieren.
- Den Überstand nach 72 h mit einer Pipette auffangen und das restliche Volumen durch einen 0,20 μm Spritzenvorsatzfilter leiten. Anschließend wird der Überstand bei -80 °C für mindestens 24 h eingefroren.
- Behandlung von GL261 mit voraktiviertem Mikroglia-konditioniertem Medium
- Sobald der GL261 zu 80 % in den Objektträgern mit 8 Wells zusammenfließt, wird β-Glucan-behandeltes Mikrogliamedium (Schritt 2.2.2) mit einer Endvolumenkonzentration von 25 % für 72 h (Gesamtvolumen: 250 μl/Well) zugegeben.
- Entfernen Sie das Medium nach 72 h Inkubation und entsorgen Sie es.
- Waschen Sie die Zellen dreimal 5 Minuten lang mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS; pH 7,4, 0,1 M).
- Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 200 μl 4%igem Paraformaldehyd (PFA) bei 4 °C für 15 min.
HINWEIS: Abhängig von den verschiedenen Antikörpern, die für die Immunfluoreszenz verwendet werden können, können die Fixierungsmethoden von der typischen 4%igen PFA abweichen. Fixiermittel auf Alkoholbasis können bei der Erhaltung bestimmter Epitope effizienter sein.
- Immunfluoreszenz-Studie
- Waschen Sie die Proben dreimal mit PBS mit Triton X (PBST; 0,01 %) für 10 Minuten.
- Entfernen Sie das PBST und fügen Sie Rinderserumalbumin (BSA) Blockierungspuffer 10 % in PBST (Tabelle 1) für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
- Entfernen Sie den Blockierungspuffer und fügen Sie 200 μl PBS pro Vertiefung hinzu, die die primäre Antikörpermischung enthält (1:500 monoklonaler Ki-67-Antikörper der Ratte und 1:500 gespaltener Caspase-3-Antikörper des Kaninchens; siehe Materialtabelle). Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Nach 24 h Inkubation bei 4 °C lassen Sie die Proben 30 min bei Raumtemperatur.
- Waschen Sie die Vertiefungen dreimal für 10 Minuten mit PBS auf einem Shaker (niedrige Geschwindigkeit).
- Entfernen Sie das PBS und ersetzen Sie es durch 200 μl PBS pro Vertiefung, das die Mischung aus Sekundärantikörpern (1:200 Esel-Anti-Ratten-IgG (H + L) stark kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488 und 1:200 Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) hoch-kreuzadsorbiertem Sekundärantikörper, Alexa Fluor 647; siehe Materialtabelle) für 45 min bei Raumtemperatur im Dunkeln enthält.
- Waschen Sie die Proben 10 Minuten lang mit PBS auf einem Mehrzweckschüttler.
- Entfernen Sie das PBS und fügen Sie 200 μl pro Vertiefung von 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), verdünnt in PBS (1:5,000), für 1 Minute hinzu.
- Entfernen Sie DAPI (siehe Materialtabelle) und waschen Sie die Zellen 5 Minuten lang in PBS.
- Entfernen Sie den Well-Rahmen und geben Sie 50 μl PBS:Glycerin (1:1) auf jede Vertiefung und decken Sie sie mit einem Deckglas ab.
- Versiegeln Sie die Objektträger mit Nagellack.
- Erfassen Sie Bilder mit 20-facher Vergrößerung mit einem konfokalen Mikroskopsystem (siehe Materialtabelle).
3. Quantifizierung und Analyse der Tumorzellproliferation und Apoptose
HINWEIS: Um die potenzielle Wirkung der verschiedenen β-Glucane auf die Proliferation und Apoptose von Tumorzellen zu messen, wurde ein internes Skript in der ImageJ-Software verwendet, um die Anzahl der positiven Pixel von Ki67 (Proliferation) und cCasp3 (Apoptose)13 zu quantifizieren.
- Öffnen Sie ImageJ. Klicken Sie auf die Schaltfläche Plugins . Klicken Sie auf Coloc2, ein Plugin, das zuvor im Plugin-Ordner installiert wurde, und wählen Sie schließlich das zu analysierende Bildaus 11.
HINWEIS: Dieses Plugin war nach einem vorherigen Kontakt mit Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca) verfügbar. Anstelle des Skripts verfügen sowohl ImageJ als auch Fiji Software über unterschiedliche Werkzeuge für die Kolokalisierungsanalyse (siehe Materialtabelle) mit ähnlichen Eigenschaften. - Legen Sie die Schwellenwerte entsprechend den Kontrollbedingungen (unbehandelt, nur DMEM) fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche OK .
HINWEIS: Um Hintergrund- und Intensitätsdiskrepanzen zu vermeiden, müssen alle Bilder unter den gleichen Bedingungen aufgenommen werden. Vorzugsweise sollten Bildgebungssitzungen am selben Tag durchgeführt werden, und die Mikroskopparameter sollten über die Bilder hinweg unverändert bleiben. - Stellen Sie sicher, dass die resultierenden Bilder der kolokalisierten Pixel und ein Zusammenfassungsfenster mit dem Prozentsatz oder der Rohanzahl der Pixel über dem Schwellenwert angezeigt werden. Normalisieren Sie die Ergebnisse in Bezug auf die Kontrollbedingungen (unbehandelt).
HINWEIS: Alle Daten sind als Mittelwert ± REM angegeben. Die statistische Analyse wurde mit Hilfe von Grafik- und Analysesoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle). Es wurde eine einfaktorielle ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Tukey verwendet. Fehler werden als Standardfehler des Mittelwerts (s.e.m.) dargestellt (*p < 0,05, **p < 0,01).
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Representative Results
Erfolgreiche Aufreinigung von β-Glucanen
Die Masse an MP, SMPs und SβGs, die aus den Fruchtkörpern von P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus nach dem Extraktions- und Reinigungsprozess gewonnen werden, ist in Tabelle 1 zusammengefasst. Die grundlegende Zusammensetzung (Gesamtkohlenhydrate, β-Glucane und Protein) von MP, SMPs und SβGs, die aus den Pilzen gewonnen werden, ist in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, wie das Protokoll die Gewinnung einer großen Menge an Proteingehalt in SMPs ermöglichte. Die enzymatische Behandlung mit α-Amylase/Glucoamylase und Protease reduzierte jedoch die Proteinmenge und erhöhte die β-Glucan-Konzentration.
Die UV-Spektren der verschiedenen SβGs zeigten keine UV-Absorptionsspitzen bei 260 und 280 nm (Abbildung 2A), was darauf hindeutet, dass den SβGs Nukleinsäuren (260 nm) und Proteine (280 nm) fehlten. Des Weiteren wurde die Homogenität von SβGs nach UV-sichtbarer Absorptionsspektroelektrochemie (SEC) getestet. Die Chromatogramme (Abbildung 3) zeigten eine gute Homogenität, mit einem scharfen Haupt- und Einzelpeak bei 8,20, 10,5, 10,9 bzw. 11,3 min für H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus und P. djamor. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Fraktion mit Homopolymeren übereinstimmt. Darüber hinaus wurde das gewichtsgemittelte Mw für H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus bzw. P. djamor gemäß der Kalibrierungskurvengleichung mit etwa 120,8, 92,8, 80,7 und 75,9 kDa berechnet (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
Die FTIR-Spektren maßen molekulare Schwingungen, die kovalenten Polysaccharidbindungen entsprachen (Abbildung 4). Die Spektren zeigten eine breite und intensive Hydroxylgruppe bei etwa 3.435 cm-1. Es zeigte sich auch ein schwacher C-H-Streckungspeak bei etwa 2.922 cm-1, was den Polysaccharidenentspricht 14. Des Weiteren konnte die Absorption bei ca. 1.641 cm-1 dem Amid I15 zugeordnet werden, bezogen auf die Dehnungsschwingungen der C=O- und CN-Gruppen. Das Signal bei etwa 1.154 cm-1 könnte auf eine asymmetrische C-O-C-Dehnung der glykosidischen Kopplung16 zurückzuführen sein. Schließlich deutete die Bande bei etwa 1.072 cm-1 auf eine C-O-Streckung von β-Glucanenhin 16. Die schwache Absorption in der Nähe von 893 cm-1 könnte auf die asymmetrische Brechungsschwingung von β-Pyranose zurückzuführen sein, was die β-Konfiguration der Zuckereinheiten17 zeigt. Insgesamt wurde festgestellt, dass SβGs hauptsächlich aus Kohlenhydraten bestehen, die mit einer minimalen Menge an Protein konjugiert sind.
Das Monosaccharidprofil von SβGs wurde mittels HPTLC und GC-MS weiter untersucht. Das Vorhandensein einer großen Menge D-Glukose mit kleineren Mengen an D-Galaktose und D-Mannose sowie einer Spur von D-Xylose, D-Rhamnose, D-Fucose und L-Arabinose wurde bestätigt. Tabelle 3 fasst die Ergebnisse für SβGs von H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus und P. djamor zusammen.
Mikroglia-konditioniertes Medium, voraktiviert mit β-Glucan, induzierte Apoptose in Krebszellen
Nachdem β-Glucane aus den ausgewählten Pilzen erfolgreich isoliert und vollständig charakterisiert waren, wurden sie der Mikroglia-Zellkultur (BV2) zugesetzt. 72 h nach Zugabe von Mikroglia-konditioniertem Medium zu den GL261-Zellen (Abbildung 5) wurde die Expression von zwei Schlüsselmarkern für Proliferation (Ki67) und Apoptose (gespaltene Caspase 3 [cCasp3]) mittels Immunfluoreszenz gemessen. Mit Hilfe eines hauseigenen Skripts in der ImageJ-Software wurde die Anzahl der positiven Pixel für jeden Fluoreszenzkanal quantifiziert und damit die Art und Weise analysiert, wie der potenzielle Effekt der β-Glucan-induzierten Mikroglia-Aktivierung das Verhalten von Tumorzellen beeinflussen kann. Unter Verwendung von Kontrollproben als Schwellenwert für die Intensität jedes Fluorophors lieferte das Skript die Anzahl der Pixel und gab somit die Expression für jeden Marker nach den verschiedenen Versuchsbedingungen an (Abbildung 6).
Interessanterweise erlitt GL261 keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die Tumorproliferation, nachdem es den verschiedenen Mikroglia-konditionierten Medien ausgesetzt wurde (Abbildung 7). P. djamor (B) und H. erinaceus (C) zeigten jedoch eine starke Induktion (ca. sechsfache bzw. neunfache Steigerung) von cCasp3.
Abbildung 1: Isolationsprotokoll. Schematische Darstellung des Protokolls zur Isolierung und Reinigung von SβG-Präparaten aus P. streatus, P. djamor, H. erinaceus und G. lucidum. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: UV-Spektren von β-Glucanen. UV-Spektren im 200-400 nm Bereich von (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor und (D) H. erinaceus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Chromatogramme zum Größenausschluss. Größenausschlusschromatogramme von (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor und (D) H. erinaceus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: FTIR-Spektren. Fourier-Transformations-Infrarotspektren (FTIR) von (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor und (D) H. erinaceus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Schematische Darstellung der Co-Stimulations-Assays. Co-Stimulations-Assay, bei dem Maus-Mikrogliazellen (BV2) 72 h lang mit β-Glucanen beschichtet wurden. Nach der Kryokonservierung und Filtration wurde der Überstand gesammelt und für 72 h in eine GL261-Zellkultur (25%) überführt .
Abbildung 6: Proliferations- und Apoptosebilder. Immunfluoreszenzbilder zeigen eine dreifache Kolokalisation von GL261 mit DAPI (blau), Ki67 (grün) und cCasp3 (rot). Das Skript "Prob Coloc" (untere Bilder) ermöglichte es, die Anzahl der positiven Pixel von jedem Marker und die Kolokalisierung zwischen ihnen zu quantifizieren. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Quantifizierung von Proliferationsraten und Apoptose. Normalisierte Werte in Bezug auf die Kontrollbedingungen (DMEM) der Ki67 (links) und cCasp3 (rechts) Expression in GL261 Zellen nach der Mikroglia-bedingten Mediumexposition. (ein) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Fehler werden als s.e.m. dargestellt (*p < 0,05, **p < 0,01). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| MP (g) | Beträchtliche Marktvoraussetzungen (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201.3 ± 2.2 | 14,4 ± 0,9 (7,1 %) | 5,3 ± 0,2 (2,6 %) |
| P. djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7 %) | 4,9 ± 0,3 (2,4 %) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3 %) | 5,5 ± 0,2 (2,7 %) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5 %) | 5,7 ± 0,2 (2,8 %) |
Tabelle 1: Tabelle des Glucangehalts. Massenbilanz zur Gewinnung von MP, SMPs und SβGs aus Fruchtkörpern von P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus.
| MP | Beträchtliche Marktteilnehmer | SβGs | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-Glucan (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Eiweiß (%) | 21,5±0,9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2,1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| P. djamor | β-Glucan (%) | 24,3 ± 2,8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Eiweiß (%) | 19.9 ± 1.0 | 22,3 ± 1,1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-Glucan (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3,1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Eiweiß (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-Glucan (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Eiweiß (%) | 17,6 ± 1,3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tabelle 2: Gesamtkohlenhydrate. Trockengewichtsgehalt (g) an Gesamtkohlenhydraten (CHt), β-Glucan und Protein von MP, SMPs und SβGs. Proteingehalt (MP) quantifiziert nach der Kjeldah-Methode12. (*, Proteine, die nach der Lowry-Methode quantifiziert wurden9).
| D-Gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-Arabisch (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3,8 ± 0,1 | 2,1 ± 0,2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | n.d |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2,6 ± 0,2 | 1,9 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | n.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| P. djamor | 95,2 ± 0,7 | 1,7 ± 0,2 | 1,1 ± 0,1 | 0,3 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabelle 3: Charakterisierung von Monosacchariden. Monosaccharidprofil der SβGs von P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus (o.J., einige Monosaccharide waren nicht nachweisbar).
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Discussion
Diese Arbeit beschreibt die Verwendung etablierter Techniken zur erfolgreichen Isolierung, Reinigung und Charakterisierung des Gehalts an SβGs aus vier verschiedenen Pilzen. Die Ergebnisse zeigten, wie nach der Heißwasserextraktion von SMPs, die aus P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum und H. erinaceus gewonnen wurden, gefolgt von einer hydrolytischen Behandlung mit α-Amylase, Glucosidase und Protease, der Gehalt an α-Glucan und Protein reduziert wurde, wodurch die Menge an reinen SβGs signifikant angereichert wurde.
Trotzdem beobachteten wir, dass die meisten pilzlichen β-Glucane während des Reinigungsprozesses wasserunlöslich waren. Das Hauptinteresse der Studie galt den SβGs aufgrund ihrer medizinischen/pharmazeutischen Eigenschaften10,18. Darüber hinaus wurden dank hydrolytischer Verarbeitung, Ethanolfällung und Dialyse lösliche niedermolekulare Kohlenhydrate, Peptide, Oligopeptide und Aminosäuren erfolgreich aus SMPs entfernt, was eine ähnliche Effizienz wie andere frühere Arbeiten mit einer anderen Pilzart, aber mit ähnlichen Prozessen zeigte19,20.
Um die Reinheit der SβGs zu testen, wurden die UV-Spektren der verschiedenen SβGs mittels UV-Spektrophotometrie untersucht, wobei die Proben im Bereich von 200-400 nm gescannt wurden. Bei 260 und 280 nm wurden keine UV-Absorptionsspitzen beobachtet, was darauf hindeutet, dass SβGs weder Nukleinsäuren (260 nm) noch Proteine (280 nm) enthielten, was wiederum zeigt, dass β-Glucane hauptsächlich die SβGs ausmachten. Obwohl UV-Spektren im Bereich von 200-400 nm das Fehlen eines definierten/scharfen Picks bei 280 nm zeigten, konnte dennoch ein kleiner Peak beobachtet werden. Dies könnte durch das Vorhandensein einer geringen Menge an Polysaccharid-gebundenen Proteinen erklärt werden, was mit den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen übereinstimmt. Es ist jedoch interessant zu bedenken, dass eine so vernachlässigbare Menge an Polysacchariden auch durch den verzögerten Zugang zu den verbleibenden Proteinen erklärt werden könnte, die durch Glucane abgeschirmt werden können, oder durch sterische Effekte, die den vollständigen Abbau von Glucan-gebundenen Proteinen verhindern. Wichtig ist, dass die Homogenität von SβGs von SEC weiter getestet wurde, einer leistungsstarken Analysetechnik, die zur Aufreinigung gelöster Moleküle nach Größe verwendet wird, was die Protokollergebnisse bestätigte.
Zusätzlich wurden FTIR-Spektren verwendet, um molekulare Schwingungen zu messen, die kovalenten Polysaccharidbindungen entsprechen. Wie bereits beschrieben, wurden für alle vier Pilze ähnliche Spektren erhalten. Die Spektren zeigten die Anwesenheit von Polysacchariden14, Amid I15 und β-Glucanen16. Die schwache Absorption in der Nähe von 893 cm-1 deutete auf die β-Konfiguration der Zuckereinheiten17 hin. Insgesamt wurde festgestellt, dass SβGs hauptsächlich aus Kohlenhydraten gebildet werden, die mit minimalem Protein konjugiert sind. In Bezug auf das Interesse an der Verwendung von SβGs als immunmodulatorische Moleküle ist hervorzuheben, dass Polysaccharid-Protein-Komplexe häufig für ihre immunmodulatorischen Vorteile bekannt sind21.
Abschließend wurde das Monosaccharidprofil von SβGs mittels HPTLC und GC-MS untersucht. Das Vorhandensein einer großen Menge an D-Glucose mit kleineren Mengen an D-Galactose und D-Mannose sowie Spuren von D-Xylose, D-Rhamnose und D-Fucose impliziert streng genommen, dass die vorherrschende Komponente in SβGs β-Glucan ist. Es ist jedoch wichtig klarzustellen, dass unser Reinigungssystem aus der Optimierung verschiedener klassischer Verfahren resultiert. Wir arbeiten derzeit an der Verbesserung mehrerer Schritte, die sich hauptsächlich auf Chromatographietechniken (Größenausschluss und Ionenaustauschchromatographie) konzentrieren.
In Bezug auf das Hauptziel dieser Arbeit, die darin bestand, die Wirkung von β-Glucanen auf Immunzellen zu testen, wurden nach erfolgreicher Aufreinigung der vier verschiedenen Arten von β-Glucanen ihre potenziellen Auswirkungen auf die Aktivierung von Mikroglia getestet. Die Immunfluoreszenz wurde gegen zwei Goldstandardmarker für Proliferation und Apoptose eingesetzt22,23.
Obwohl es keine statistischen Unterschiede in den Tumorproliferationsraten gab, konnten P. ostreatus (A) und H. erinaceus (C) die Ki67-Expression um bis zu 50% senken. Die mangelnde Signifikanz ist wahrscheinlich auf die hohe Varianz in der Studie bezüglich G. lucidum zurückzuführen. Darüber hinaus ist die Induktion von Apoptose in Krebszellen ein recht interessanter therapeutischer Ansatz, und P. djamor (B) und H. erinaceus (C) zeigten eine signifikante Induktion des cCasp3-Spiegels, was auf eine Aktivierung des Zelltodprogramms hindeutet. Alle diese Ergebnisse stehen im Einklang mit früheren Studien, die die antitumorale Wirkung dieser Pilze bei anderen Tumorarten gezeigt haben24,25. Die Experimente wurden unter den gleichen Bedingungen und unter der Leitung der gleichen Forscher in zweifacher Ausführung durchgeführt. Die softwarebasierte Analyse der Ergebnisse aus den Immunfluoreszenzstudien unterstützt einen unvoreingenommenen Ansatz und erhöht die potenzielle Reichweite dieser Studie.
Im Allgemeinen haben diese Studien eine große Herausforderung in Bezug auf die Verwendung von β-Glucanen, nämlich die Reinheit der Verbindungen. Es ist zwingend erforderlich, die höchsten Standards zu verfolgen, um zu bestätigen, dass die beobachteten Wirkungen nach ihrer Verwendung in immunologischen Studien ausschließlich durch die Kohlenhydrate hervorgerufen werden und nicht durch Proteine oder andere Strukturen, die an ihnen haften bleiben können, wenn die Reinigung nicht angemessen durchgeführt wird. Ein zusätzlicher Schritt, der in zukünftigen Studien in Betracht gezogen werden könnte, ist der Einsatz von Chromatographietechniken (z. B. Ionenaustausch oder Größenausschluss).
Die Gesamtschlussfolgerung nach den Studien sieht H. erinaceus als Top-Kandidat als potenzielle immuntherapeutische Option für die Behandlung von Glioblastomen, da es in der Lage ist, die Tumorproliferation (~50%) zu verringern und eine starke Aktivierung des Zelltodprogramms in Glioblastomzellen zu induzieren.
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Disclosures
Es bestehen keine Interessenkonflikte, die deklariert werden müssen.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Dr. Vasiliki Economopoulos für ihr hauseigenes Skript zur Messung des Fuluoreszenz-Signals in ImageJ. Wir möchten uns auch bei der CITIUS (Universität Sevilla) und ihrem gesamten Personal für die Unterstützung während der Demonstration bedanken. Diese Arbeit wurde vom spanischen FEDER I + D + i-USE, US-1264152 der Universität Sevilla, und dem Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00 unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
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