Summary
Cet article présente un protocole détaillé pour disséquer les ligaments utéro-sacrés et d’autres tissus du plancher pelvien, y compris le col de l’utérus, le rectum et la vessie chez la souris, afin d’élargir l’étude des tissus reproducteurs féminins.
Abstract
Le prolapsus des organes pelviens (POP) est une affection qui affecte l’intégrité, la structure et le soutien mécanique du plancher pelvien. Les organes du plancher pelvien sont soutenus par différentes structures anatomiques, y compris les muscles, les ligaments et le fascia pelvien. Le ligament utéro-sacré (LSU) est une structure portante critique, et une lésion de la LSU entraîne un risque plus élevé de développer un POP. Le présent protocole décrit la dissection des LSU murins et des organes du plancher pelvien, ainsi que l’acquisition de données uniques sur la composition et la fonction biochimiques de la LSU à l’aide de la spectroscopie Raman et de l’évaluation du comportement mécanique. Les souris sont un modèle inestimable pour la recherche préclinique, mais disséquer la LSU murine est un processus difficile et complexe. Cette procédure présente une approche pour guider la dissection des tissus du plancher pelvien murin, y compris la LSU, afin de permettre de multiples évaluations et caractérisations. Ce travail vise à faciliter la dissection des tissus du plancher pelvien par les scientifiques fondamentaux et les ingénieurs, élargissant ainsi l’accessibilité de la recherche sur la LSU et les conditions du plancher pelvien et l’étude préclinique de la santé des femmes à l’aide de modèles murins.
Introduction
Environ 50 % des femmes sont touchées par le prolapsus des organes pelviens (POP)1,2. Environ 11 % de ces femmes répondent aux critères pour subir une réparation chirurgicale, ce qui a un faible taux de réussite (~30 %)3,4. Les POP se caractérisent par la descente de tout ou partie des organes pelviens (c.-à-d. vessie, utérus, col de l’utérus et rectum) de leur position naturelle en raison de l’incapacité de la LSU et des muscles du plancher pelvien à fournir un soutien adéquat5. Cette condition implique un dysfonctionnement anatomique et une perturbation du tissu conjonctif, ainsi que des lésions neuromusculaires, en plus des facteurs prédisposants 3,6. Les POP sont associés à de multiples facteurs tels que l’âge, le poids, la parité et le type d’accouchement (c.-à-d. les naissances vaginales ou césariennes). On pense que ces facteurs affectent l’intégrité mécanique de tous les tissus du plancher pelvien, la grossesse et la parité étant considérées comme les principaux moteurs du POP 5,7,8.
Les ligaments utéro-sacrés (LSU) sont des structures de soutien importantes pour l’utérus, le col de l’utérus et le vagin et attachent le col de l’utérus au sacrum4. Les dommages causés aux LSU exposent les femmes à un risque accru de développer des POP. On croit que la grossesse et l’accouchement imposent une pression supplémentaire sur la LSU, ce qui peut induire des blessures et augmenter les risques de POP. La LSU est un tissu complexe composé de cellules musculaires lisses, de vaisseaux sanguins et de lymphatiques répartis de manière hétérogène le long du ligament, qui peut être divisé en trois sections distinctes: cervicale, intermédiaire et sacrée9. L’intégrité mécanique de la LSU est dérivée de composants de la matrice extracellulaire (ECM) comme le collagène, l’élastine et les protéoglycanes 5,9,10. Les fibres de collagène de type I sont connues pour être un composant de traction porteur majeur des tissus ligamenteux et sont, par conséquent, probablement impliquées dans la défaillance de la LSU et du POP11.
Il y a un manque de connaissances sur les causes, la prévalence et les effets des POP chez les femmes. Le développement d’un modèle animal approprié de POP est nécessaire pour faire progresser notre compréhension du plancher pelvien féminin. Les souris et les humains ont des repères anatomiques similaires dans le bassin, tels que les uretères, le rectum, la vessie, les ovaires et les ligaments ronds9, ainsi que des points d’intersection similaires de la LSU avec l’utérus, le col de l’utérus et le sacrum. De plus, les souris offrent une facilité de manipulation génétique et ont le potentiel d’être un modèle facilement accessible et rentable pour l’étude du POP9.
Cette étude a mis au point une méthode pour accéder à la LSU et aux différents tissus du plancher pelvien et les isoler chez des souris nullipares (c.-à-d. jamais gestantes). Les LSU extraits ont été soumis à une digestion enzymatique (c.-à-d. pour éliminer les collagènes et les glycosaminoglycanes), testés pour déterminer la réponse mécanique sous charge de traction et évalués pour la composition biochimique dans une étude de validation de concept. La capacité d’isoler des tissus intacts facilitera d’autres caractérisations mécaniques et biochimiques des composants du plancher pelvien, ce qui constitue une première étape cruciale pour améliorer notre compréhension des risques de blessures liés à l’accouchement, à la grossesse et aux POP.
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Protocol
Toutes les expériences et procédures sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole #2705, approuvé par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Colorado à Boulder. Des souris C57BL/6J femelles âgées de six semaines ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux).
1. Préparation des animaux
- Euthanasier l’animal selon la méthode approuvée par l’établissement.
REMARQUE : La présente étude a utilisé l’inhalation de CO 2 conformément aux lignes directrices de l’American Veterinary Medical Association (un taux de déplacement de 30 % à 70 % du volume de la chambre avec du CO2 par minute), suivie d’une luxation cervicale, pour assurer une euthanasie réussie.- Travaillez sous une cagoule, si possible, pour minimiser la propagation des allergènes de souris. Une fois que la souris cesse de bouger et de respirer, attendez 2 minutes ou plus pour vérifier l’absence de réponse.
REMARQUE: Si la souris est enceinte ou post-partum, les chiots doivent être euthanasiés individuellement. Les chiots E15.5 et plus âgés doivent être décapités pendant la dissection.
- Travaillez sous une cagoule, si possible, pour minimiser la propagation des allergènes de souris. Une fois que la souris cesse de bouger et de respirer, attendez 2 minutes ou plus pour vérifier l’absence de réponse.
- Préparez la configuration de dissection à l’aide d’un tampon de dissection, d’un scalpel à 11 lames, de ciseaux pointus minces et incurvés, de deux paires de pinces, de pinces incurvées, d’une suture polyglactine 5-0, d’un microscope à dissection et de six broches (figure 1, voir le tableau des matériaux).
- Placez la souris sur le pad et épinglez les membres antérieurs vers le bas (Figure 2A). Faites une incision d’environ 1 à 1,5 cm dans l’abdomen avec des ciseaux (figure 2B). Utilisez doucement les ciseaux pour séparer la peau aux côtés crânien, caudal et latéral de l’incision (Figure 2C, D).
- Retournez la souris sur sa face dorsale et décollez doucement la peau vers les membres postérieurs pour éloigner la peau du site de dissection (figure 2E-H).
- Épinglez la souris aux membres (figure 2I) et faites une incision d’environ 1 cm dans l’abdomen, du thorax au bassin (figure 2J).
REMARQUE: Assurez-vous de ne pas endommager les organes sous-jacents. - Poussez doucement les organes vers le thorax pour dégager le champ de vision (Figure 2K).
REMARQUE: Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation. - Enlevez tout le tissu adipeux du plancher pelvien (figure 2L-N).
REMARQUE: Utilisez des pinces pour retirer doucement et éliminer la graisse des organes et des tissus d’intérêt.
Figure 1 : Un espace de travail propre avec tous les outils nécessaires pour effectuer les dissections. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Enlèvement de la peau et ouverture des cavités pelviennes et thoraciques de la souris. (A) Épingler tous les membres. (B) Incision initiale. (C) Séparer la peau du fascia sous-jacent à l’aide de ciseaux. (D) Coupe de la peau et préparation de l’enlèvement. (E-G) Arracher la peau en faisant le tour de la souris. (H) Enlever complètement la peau de la face dorsale. (I) Enlèvement complet de la peau du torse et réépinglage des membres de la souris. (J) Ouverture de l’abdomen. K) Vue de l’abdomen ouvert. (L) Déplacement des organes hors du champ de vision. (M) Enlever la graisse. (N) Vue du plancher pelvien dégagé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
2. Récolte de LSU
- Coupez les cornes utérines des ovaires (Figure 3B), éloignez-vous du champ de vision et coupez au niveau de la connexion cervicale (Figure 3C).
REMARQUE: Les cornes utérines peuvent être identifiées selon le schéma de la figure 3A. Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation. - Coupez les uretères loin du raccord de la vessie (Figure 3D).
NOTE: Ceci afin d’éviter toute confusion avec la LSU. - Coupez le côlon le plus près possible du col de l’utérus (Figure 3E,F).
REMARQUE: Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation. - Placez la souris avec le tampon de dissection sous la lunette de dissection pour visualiser les LSU (Figure 3G).
- Utilisez doucement les pinces pour nettoyer la graisse environnante des LSU.
REMARQUE: Utilisez une deuxième paire de pinces pour maintenir le col de l’utérus à un petit angle afin d’améliorer la visualisation de l’endroit où l’USL croise le col de l’utérus. Irriguer les tissus avec 1x PBS pour maintenir l’hydratation. - Attachez une suture polyglactine 5-0 autour de l’extrémité cervicale des deux USL (Figure 4B, C).
REMARQUE : Les LSU peuvent être identifiées à l’aide des images schématiques et d’agrandissement (Figure 4I-K) - Dans cette étude, une LSU est utilisée pour les analyses morphologiques ou biochimiques (c.-à-d. microscopie Raman, immunohistochimie, histologie). Coupez l’extrémité cervicale de la LSU, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché, et coupez un morceau de muscle du bas de la LSU (figure 4D). Placez le tissu disséqué dans un bain avec 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 4G, H).
- Utilisez la LSU restante pour les essais mécaniques et l’imagerie. Coupez l’extrémité cervicale de la LSU, en laissant un morceau du col de l’utérus attaché, pour faciliter la configuration mécanique (figure 4D).
REMARQUE: Le tissu cervical servira d’ancrage pour fixer l’USL pendant le test mécanique. - Une fois que tous les tissus d’intérêt sont prélevés (étapes 3 à 5), disloquez les fémurs du bassin (figure 4E).
REMARQUE: On devrait entendre un léger cliquetis lorsque la tête fémorale est désarticulée de la coupe acétabulaire. - Couper l’os pelvien des extrémités distales et proximales de l’os pelvien, en laissant environ 10 mm de tissu total (figure 4F). Placez le tissu disséqué dans 1x PBS.
Figure 3 : Plancher pelvien dégagé pour la dissection de la LSU. (A) Schéma de l’anatomie. (B) Couper les cornes utérines à la connexion ovarienne. (C) Couper les cornes utérines. D) Coupe des uretères. (E) Coupe du côlon. (F) Une vue claire du rectum et des LSU. (G) Placer la souris et le tampon de dissection sous la lunette de dissection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Vue de la LSU et des tissus environnants et dissection des LSU. (A) Schéma des repères anatomiques entourant la LSU. (B) Attacher une suture autour des extrémités cervicales. (C) Trancher les extrémités cervicales de la LSU. (D) Découpage de la LSU à utiliser pour les analyses biochimiques à la connexion sacrée. E) Coupe des fémurs de l’os pelvien. (F) Couper l’extrémité proximale du bassin. (G) Dissection de l’USL dans une boîte de Petri de 35 mm. H) La LSU avec le bassin attaché dans une boîte de Pétri de 35 mm. (I) La LSU et le rectum à un grossissement de 0,75x. (J) Élimination de la graisse de la LSU. (K) Nettoyage des USL à un grossissement de 1,0x. Barre d’échelle = 2 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Prélèvement de la vessie
- Une fois la graisse éliminée, tenez la vessie avec la pince et soulevez-la doucement à un angle d’environ 40° (figure 5A).
- Avec les ciseaux, trancher la vessie du côté distal, juste au-dessus du col de l’utérus (figure 5B).
- Placez le tissu dans un bain avec 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5H).
4. Prélèvement du rectum
- Une fois que les LSU sont déconnectées du col de l’utérus et que la vessie est disséquée, soulevez le col de l’utérus à un angle d’environ 40° avec la pince. Il y a le fascia rectovaginal qui relie le rectum et le col de l’utérus. Avec le scalpel, coupez délicatement cette connexion (Figure 5C, D).
- Couper l’os pubien à la symphyse pubienne à l’aide de ciseaux. Élargissez doucement l’espace de travail pour augmenter l’accès visuel aux insertions tissulaires.
- Avec la pince, tirez doucement le rectum vers le thorax et utilisez les ciseaux pour suivre le rectum de sa face postérieure à l’anus. Coupez le rectum au niveau de l’anus (figure 5E).
- Placez le tissu dans 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5I).
5. Prélèvement du complexe col de l’utérus-vagin
- Une fois les LSU retirées du col de l’utérus, utilisez les pinces pour maintenir le col de l’utérus. Coupez le col de l’utérus le plus près possible de la vulve à l’aide de ciseaux (Figure 5F, G).
REMARQUE: Assurez-vous de couper la symphyse pubienne pour voir visuellement l’extrémité distale du vagin. - Placez le tissu dans 1x PBS pour garder le tissu hydraté (Figure 5J).
Figure 5 : Dissections de la vessie, du rectum et du col de l’utérus et du vagin. (A) Tenir la vessie en biais. (B) Couper la vessie. (C) Couper le tendon reliant le col de l’utérus et le rectum. (D) Le tendon à un grossissement de 1,0x. (E) Couper le rectum. (F) Tenir le col de l’utérus avec une pince. (G) Coupure à l’extrémité distale du vagin. (H) La vessie dans une boîte de Petri de 35 mm. (I) Le rectum dans une boîte de Petri de 35 mm. (J) Le complexe tissulaire col-vagin dans une boîte de Pétri de 35 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
6. Préparation de l’échantillon pour la caractérisation tissulaire
- Analyses mécaniques et visuelles de la LSU
- Placez la LSU avec l’attache pelvienne sur un mur en forme de T dans un puits de coloration personnalisé pour assurer une immersion complète dans la solution de coloration (les dessins CAO du puits se trouvent dans le fichier de codage supplémentaire 1 et le fichier de codage supplémentaire 2).
REMARQUE: Utilisez la suture et les forceps pour faciliter le placement. - Diluer un colorant disponible dans le commerce qui colore les groupes amines libres (5 μL, voir le tableau des matériaux) dans 2,5 mL de 1x PBS, ajouter la solution au puits de coloration personnalisé et colorer le tissu pendant 2 h sur une bascule à 4 °C.
REMARQUE: Vortex la solution avant de l’ajouter au puits de coloration. - Au cours des 15 dernières minutes de coloration, ajouter 2,5 μL d’une coloration de noyaux de cellules mortes disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) à la solution.
REMARQUE: Vortex la solution avant de l’ajouter au puits de coloration.
- Placez la LSU avec l’attache pelvienne sur un mur en forme de T dans un puits de coloration personnalisé pour assurer une immersion complète dans la solution de coloration (les dessins CAO du puits se trouvent dans le fichier de codage supplémentaire 1 et le fichier de codage supplémentaire 2).
- Analyse Raman des USL
- Épinglez la LSU en ligne droite sur un bloc de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenu dans un puits personnalisé.
REMARQUE: Le PDMS est utilisé comme substrat souple pour permettre l’épinglage de l’échantillon dans la configuration souhaitée. Des blocs de dimensions variables peuvent être fabriqués en mélangeant les deux composants en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux), en coulant dans une boîte de Petri et, après polymérisation, en coupant le PDMS dans la géométrie requise avec une lame de scalpel. - Épingler avec des épingles d’insectes à la boucle de suture et au muscle pelvien. Hydratez le tissu avec 1x PBS.
- Épinglez la LSU en ligne droite sur un bloc de polydiméthylsiloxane (PDMS) contenu dans un puits personnalisé.
- Tissus restants
- Congeler les tissus restants avec de l’azote liquide ou dans un composé d’enrobage approprié, selon les analyses souhaitées.
- Conservez les tissus à −80 °C jusqu’à des analyses ultérieures (p. ex. tests immunohistochimiques ou biochimiques).
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Representative Results
Chaque étape de la dissection d’une souris de type sauvage est détaillée dans la vidéo associée et les figures liées au protocole. Pour cette étude, des souris C57BL/6J femelles âgées de 6 semaines ont été utilisées (tableau supplémentaire 1). Trois groupes d’échantillons avec des LSU traitées avec différentes enzymes ont été analysés: les groupes témoins (aucun traitement), les groupes traités à la collagénase et les groupes traités à la chondroïtinase. Le muscle lisse, les nerfs et les lymphatiques de la LSU sont entourés d’une ECM riche en collagènes fibrillaires et en glycosaminoglycanes (GAG)5, qui sont censés assurer l’intégrité mécanique du tissu. Les traitements enzymatiques ont été choisis pour perturber ces composants ECM et démontrer la faisabilité de résoudre les différences biochimiques et mécaniques en utilisant la spectroscopie Raman et les tests mécaniques (de traction).
Pour la digestion, tous les USL ont été placés dans un thermomélangeur pendant 3 h dans une solution de 1 mL à 37 °C et 300 rpm. Les LSU témoins ont été placés dans une solution de 1x PBS, les LSU traités au collagénase ont été placés dans une solution de collagénase de type I à 1,0 U/mL et les LSU traités à la chondroïtinase ont été placés dans une solution de 2,0 U/mL de chondroïtinase ABC (voir le tableau des matériaux).
Les LSU pour les essais mécaniques ont été préparés à partir de l’étape 6.1. Les échantillons ont été placés dans une chambre de chargement personnalisée (un dessin CAO de la chambre se trouve dans le fichier de codage supplémentaire 3) pour le protocole d’essai mécanique12. Le bassin était fixé dans une configuration stationnaire, et l’extrémité cervicale de la LSU était fixée à un actionneur de bouée, ce qui était basé sur la conception décrite dans Jimenez et al.12 (figure 6B; Fichier de codage supplémentaire 4), sous un microscope confocal vertical et fixé à un capteur de pesage de 100 mN (figure 6A). Le système de bouée réduit le bruit causé par le bras de l’actionneur lors de la mesure de la force12. Une précharge d’environ 500 μN a été utilisée pour définir la configuration de référence de la LSU, et chaque LSU a été imagée dans cette position. Ensuite, un déplacement global de 750 μm a été appliqué et maintenu pendant 5 minutes avant d’être à nouveau absorbé par l’imagerie. L’USL a ensuite été ramenée à la configuration de référence, et ce processus a été répété pour un déplacement global de 1 000 μm. Ce protocole a été suivi pour les trois groupes d’échantillons (n = 1/groupe) pour obtenir les courbes de relaxation des contraintes (figure 7), et les contraintes de crête et d’équilibre supportées par chaque LSU ont été déterminées (tableau 1). La contrainte a été calculée en divisant la force mesurée par la section transversale moyenne (tableau supplémentaire 2 et tableau supplémentaire 3).
Figure 6 : Installation des essais mécaniques. (A) Chambre de chargement sous le microscope confocal et connectée à l’actionneur. (B) USL dans la chambre de chargement; Le bassin reste immobile, tandis que l’extrémité cervicale est attachée à un système de bouées interconnectées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Tracé macroscopique axial contrainte-relaxation des LSU murins soumis à différents traitements enzymatiques. Le traitement enzymatique a semblé réduire le pic axial moyen et détendu les contraintes que l’USL subit lors des déplacements globaux prescrits. (*) indique des valeurs de contrainte détendues, qui ont été mesurées 200 s après la contrainte maximale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Échantillon | Déplacement global (μm) | Contrainte maximale (kPa) | Contrainte d’équilibre détendue (kPa) |
| Contrôle | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| Collagénase- traité | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| Traitement par chondroïtinase | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
Tableau 1 : Effet du traitement enzymatique sur les mesures de stress des LSU.
À partir des images prises (Figure 8), les champs de déformation ont été estimés à l’aide d’une combinaison de suivi manuel et automatique de la texture (fonction « imregdemons » dans MATLAB) du ligament entre l’état de référence (déchargé) et l’état déformé13. Le suivi manuel a été effectué en sélectionnant les mêmes noyaux cellulaires dans les images de référence et déformées. Les champs de déformation Green-Lagrange ont été calculés à partir des champs de déplacement estimés (Figure 9). Les déformations axiales moyennes (E11) ont été calculées pour la partie intermédiaire de chaque échantillon (tableau 2).
Figure 8 : Images des états déformés et de référence d’un échantillon témoin (non traité) après déplacements globaux. (A) Un déplacement global de 750 μm. (B) Un déplacement global de 1 000 μm. Le vert représente l’état de référence et le violet l’état déformé (barre d’échelle = 500 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 9 : Estimation des champs de contraintes. Les champs de déformation estimés pour les échantillons de chaque groupe de traitement démontrent que les souches axiales (E11), transversales (E22) et cisaillées (E12) étaient spatialement inhomogènes et que la déformation axiale augmentait avec l’augmentation du déplacement appliqué (δ). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Déplacement global (μm) | Contrôle | Traitement au collagénase | Traitement par chondroïtinase |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
Tableau 2 : Déformations axiales moyennes. Les déformations axiales moyennes pour chaque échantillon testé mécaniquement indiquent que la déformation axiale globale dans les échantillons traités par enzymes était similaire ou plus grande que dans l’échantillon témoin, ce qui suggère que la réduction de la contrainte macroscopique était due au traitement enzymatique plutôt qu’à des souches plus petites.
La spectroscopie confocale Raman (laser de 785 nm, taille du point de 1,06 μm) a été effectuée sur les LSU préparées comme décrit aux étapes 6.2 et suivantes d’O’Brien et coll.14 afin d’évaluer semi-quantitativement la biochimie des tissus. Les rayons cosmiques ont été identifiés et supprimés, la ligne de base linéaire a été soustraite et l’intensité a été normalisée pour chaque spectre. Les mêmes groupes de traitement ont été comparés (n = 3/groupe). Des spectres représentatifs pour la section intermédiaire de chaque LSU (figure 10), ainsi que les extrémités cervicales et sacrées (figure supplémentaire 1 et figure supplémentaire 2), sont présentés.
Figure 10 : Influence du traitement enzymatique sur la composition en LSU. La spectroscopie Raman de la section intermédiaire de la LSU suggère que les traitements enzymatiques ont modifié la composition biochimique de l’USL murin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les pics ont été corrélés avec différents composants biologiques basés sur la spectroscopie Raman in vivo du col de l’utérus humain réalisée par O’Brien et al.15. Nos données ont été normalisées en utilisant le pic de phosphatidyléthanolamine (1 769 nm), un phospholipide présent dans les membranes cellulaires, qui devrait rester inchangé après les traitements enzymatiques. La comparaison entre spectres représentatifs a révélé que la teneur en eau, les collagènes, l’acide hyaluronique, les protéoglycanes et les GAG ont diminué dans les LSU traitées à la collagénase et à la chondroïtase (figure 10, figure supplémentaire 1 et figure supplémentaire 2).
Figure supplémentaire 1 : Influence du traitement enzymatique sur la composition de la LSU. La spectroscopie Raman de la section cervicale USL suggère que les traitements enzymatiques ont modifié la composition biochimique de la LSU murine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire 2 : Influence du traitement enzymatique sur la composition de la LSU. La spectroscopie Raman de la section sacrée de la LSU suggère que les traitements enzymatiques ont modifié la composition biochimique de la LSU murine. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 1 : Analyse du poids, de l’âge et de la LSU des souris utilisées dans l’étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 2 : Influence du traitement enzymatique sur les mesures de force USL. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Tableau supplémentaire 3 : Calculs de la section transversale des LSU soumis à des essais mécaniques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 1 : Fichier CAO pour colorer le puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 2 : fichier CAO pour colorer le couvercle du puits. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 3 : fichier CAO de la chambre de chargement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier de codage supplémentaire 4: fichier CAO du système de bouées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’effet des dommages structurels sur les tissus reproducteurs féminins est sous-étudié, et un modèle animal facilement accessible pour la recherche sur les POP est nécessaire. La souris est un modèle rentable qui peut imiter les études sur la reproduction humaine16. En raison de l’intérêt croissant pour l’étude du système reproducteur féminin, il existe un besoin de méthodes qui facilitent l’étude de ces tissus. Pour répondre à ce besoin, dans ce travail, une méthode est établie pour disséquer et préparer les tissus du plancher pelvien murin pour les analyses structurelles et fonctionnelles.
Pour le succès de la dissection, il faut suffisamment de temps et de soins. Les tissus reproducteurs murins sont petits et fragiles. Une attention aux détails est nécessaire, en particulier lors de l’élimination de la graisse entourant la LSU et les organes pelviens, afin d’éviter d’endommager la LSU ou d’autres tissus lorsque la graisse est enlevée. Il est important d’utiliser le microscope à dissection pour aider à identifier les différences entre l’USL et la graisse, que l’œil non entraîné peut facilement confondre. Le retrait des uretères peut être utile pour éviter toute confusion avec la LSU, car les points d’insertion de la vessie et du col de l’utérus sont proches l’un de l’autre. Lorsque vous attachez la suture autour de la LSU, il faut prendre soin d’éviter de percer tout tissu en utilisant des forceps pour soulever doucement les LSU afin de faire de la place pour l’aiguille. Pour extraire les LSU, l’identification de la bonne structure tissulaire et des principaux repères anatomiques peut être difficile, mais avec cette méthode et cette pratique, les résultats de la dissection seront reproductibles.
La méthode proposée décrit une procédure détaillée pour disséquer les tissus du plancher pelvien à partir d’un seul échantillon. Une limitation est qu’il n’est pas possible de garder tous les tissus complètement intacts puisqu’un morceau du col de l’utérus reste attaché à la LSU disséquée pour servir d’ancrage pendant les essais mécaniques et aider à identifier l’orientation. Une autre limitation est que l’anatomie de la souris et l’anatomie humaine ont des différences dans la forme, la taille et l’orientationdes tissus 9. Le POP a été étudié à l’aide de plusieurs modèles animaux, tels que les rongeurs 17,18, les lapins19,20 moutons 20,21, les porcs5,22,23,24 et les primates non humains 25,26, ainsi que dans des cadavres humains24,26,27, et certains de ces modèles se sont concentrés sur le rôle de la LSU. Bien que chacun de ces modèles soit bénéfique pour l’étude des POP, un avantage supplémentaire de la souris est la facilité de manipulation génétique pour créer de nouveaux modèles de maladies, ce qui n’est pas possible chez les animauxplus gros 27.
Afin de tirer parti de la souris comme modèle, cette méthode est développée pour aider à la dissection réussie des LSU et à la préparation des tissus pour diverses analyses, y compris les tests mécaniques, la microscopie Raman, l’immunohistochimie et les tests biochimiques. Avec cette méthode, il est possible d’extraire la LSU avec sa connexion anatomique pour identifier son orientation, d’attacher la LSU et de tester mécaniquement la LSU dans des conditions similaires à celles trouvées in vivo.
L’intégrité mécanique de l’USL est dérivée des composants ECM, y compris les collagènes, les protéoglycanes et les GAG. Le collagène de type I est une protéine porteuse de charge de traction majeure, et on pense que les dommages causés à ce composant ECM contribuent à la défaillance de la LSU et au POP. Dans cette procédure, deux traitements enzymatiques différents ont été comparés pour tester comment la variation de la composition de l’ECM affecte la réponse mécanique et la composition de l’USL. L’analyse mécanique a suggéré que le collagène et les GAG contribuaient à la rigidité axiale de l’USL, abaissant le pic axial moyen et les contraintes d’équilibre (Figure 7). Les LSU traitées par enzymes présentaient une déformation axiale moyenne semblable ou supérieure (tableau 2). La spectroscopie Raman a démontré que l’USL traitée au collagénase avait une teneur en collagène réduite, ainsi qu’une diminution de l’eau et de l’acide hyaluronique, tandis que la LSU traitée à la chondroïtinase avait moins d’acide hyaluronique, ainsi qu’une teneur en eau et en collagène plus faible. Pour ces résultats, la spectroscopie Raman a validé que les composants ont été éliminés en raison de la digestion. Cette méthode devrait rendre les études sur le plancher pelvien plus accessibles et augmenter le nombre de chercheurs qui se concentrent sur cette zone sous-étudiée.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) (C.B.), la bourse de recherche d’études supérieures de la NSF (L.S.), la bourse scientifique Schmidt (C.L.), le programme de subventions de démarrage pour la recherche et l’innovation de l’Université du Colorado (prix 2020 à V.F., S.C. et K.C.) et la subvention Anschutz Boulder Nexus Seed à l’Université du Colorado (à V.F. et K.C.). Nous remercions tout particulièrement le Dr Tyler Tuttle pour son aide dans la conception de la chambre de chargement, ainsi que les membres du laboratoire Calve pour leurs discussions utiles.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
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