Summary
Denna artikel presenterar ett detaljerat protokoll för dissekering av uterosakrala ligament och andra bäckenbottenvävnader, inklusive livmoderhalsen, ändtarmen och urinblåsan hos möss, för att utöka studien av kvinnliga reproduktionsvävnader.
Abstract
Bäckenorganprolaps (POP) är ett tillstånd som påverkar bäckenbottens integritet, struktur och mekaniska stöd. Organen i bäckenbotten stöds av olika anatomiska strukturer, inklusive muskler, ligament och bäckenfascia. Det uterosakrala ligamentet (USL) är en kritisk bärande struktur, och skada på USL resulterar i en högre risk att utveckla POP. Detta protokoll beskriver dissektion av murina USL och bäckenbottenorganen tillsammans med förvärv av unika data om USL: s biokemiska sammansättning och funktion med Raman-spektroskopi och utvärdering av mekaniskt beteende. Möss är en ovärderlig modell för preklinisk forskning, men dissekering av murin USL är en svår och invecklad process. Denna procedur presenterar ett tillvägagångssätt för att styra dissektionen av murina bäckenbottenvävnader, inklusive USL, för att möjliggöra flera bedömningar och karakterisering. Detta arbete syftar till att hjälpa till med dissektion av bäckenbottenvävnader av grundforskare och ingenjörer och därmed utöka tillgängligheten för forskning om USL och bäckenbottenförhållanden och den prekliniska studien av kvinnors hälsa med hjälp av musmodeller.
Introduction
Cirka 50% av kvinnorna drabbas av bäckenorganprolaps (POP)1,2. Cirka 11% av dessa kvinnor uppfyller kriterierna för att genomgå kirurgisk reparation, vilket har en dålig framgångsgrad (~ 30%)3,4. POP kännetecknas av nedstigningen av något eller alla bäckenorganen (dvs. urinblåsan, livmodern, livmoderhalsen och ändtarmen) från deras naturliga position på grund av att USL och bäckenbottenmusklerna misslyckades med att ge tillräckligt stöd5. Detta tillstånd innefattar anatomisk dysfunktion och störning av bindväven, såväl som neuromuskulär skada, förutom predisponeringsfaktorer 3,6. POP är associerad med flera faktorer som ålder, vikt, paritet och leveranstyp (dvs. vaginala eller kejsarsnitt). Dessa faktorer tros påverka den mekaniska integriteten hos alla bäckenbottenvävnader, med graviditet och paritet som tros vara de främsta drivkrafterna för POP 5,7,8.
De uterosakrala ligamenten (USL) är viktiga stödjande strukturer för livmodern, livmoderhalsen och vagina och binder livmoderhalsen till korsbenet4. Skador på USL sätter kvinnor i ökad risk att utveckla POP. Man tror att graviditet och förlossning medför ytterligare belastning på USL, vilket potentiellt inducerar skada och ökar risken för POP. USL är en komplex vävnad som består av glattmuskelceller, blodkärl och lymfatiker fördelade heterogent längs ligamentet, som kan delas in i tre distinkta sektioner: livmoderhals, mellanliggande och sakral region9. USL: s mekaniska integritet härrör från extracellulära matriskomponenter (ECM) som kollagener, elastin och proteoglykaner 5,9,10. Typ I-kollagenfibrer är kända för att vara en viktig bärande dragkomponent i ligamentvävnader och är därför sannolikt involverade i USL-fel och POP11.
Det saknas kunskap om orsaker, prevalens och effekter av POP hos kvinnor. Utvecklingen av en lämplig djurmodell av POP är nödvändig för att öka vår förståelse av den kvinnliga bäckenbotten. Möss och människor har liknande anatomiska landmärken i bäckenet, såsom urinledarna, ändtarmen, urinblåsan, äggstockarna och runda ligament9, liksom liknande korsningspunkter i USL med livmodern, livmoderhalsen och korsbenet. Vidare erbjuder möss enkel genetisk manipulation och har potential att vara en lättillgänglig, kostnadseffektiv modell för studier av POP9.
Denna studie utvecklade en metod för att komma åt och isolera USL och de olika bäckenbottenvävnaderna från nulliparösa (dvs aldrig gravida) möss. De extraherade USL: erna utsattes för enzymatisk nedbrytning (dvs för att avlägsna kollagener och glykosaminoglykaner), testades för att bestämma det mekaniska svaret under dragbelastning och utvärderades för biokemisk sammansättning i en proof-of-concept-studie. Förmågan att isolera intakta vävnader kommer att underlätta ytterligare mekaniska och biokemiska karakteriseringar av bäckenbottenkomponenterna, vilket är ett viktigt första steg mot att förbättra vår förståelse av skaderiskerna i samband med förlossning, graviditet och POP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök och procedurer utfördes enligt protokoll # 2705, godkänt av djurvårds- och användningskommittén vid University of Colorado Boulder. Sex veckor gamla kvinnliga C57BL / 6J-möss användes för den aktuella studien. Djuren erhölls från en kommersiell källa (se Materialförteckning).
1. Beredning av djur
- Avliva djuret enligt den institutionellt godkända metoden.
OBS: Den aktuella studien använde CO 2-inhalation i linje med American Veterinary Medical Association riktlinjer (en förskjutningshastighet på 30% till 70% av kammarvolymen med CO2 per minut), följt av cervikal dislokation, för att säkerställa framgångsrik avlivning.- Arbeta under en huva, om möjligt, för att minimera spridningen av mössallergener. När musen slutar röra sig och andas, låt 2 minuter eller mer verifiera bristen på svar.
OBS: Om musen är gravid eller postpartum måste valparna avlivas individuellt. Valpar E15.5 och äldre måste halshuggas under dissektionen.
- Arbeta under en huva, om möjligt, för att minimera spridningen av mössallergener. När musen slutar röra sig och andas, låt 2 minuter eller mer verifiera bristen på svar.
- Förbered dissektionsinställningen med en dissektionsdyna, en skalpell med 11 blad, böjda tunna vassa saxar, två par pincett, böjda pincett, 5-0 polyglaktinsutur, ett dissekeringsmikroskop och sex stift (figur 1, se materialtabell).
- Placera musen på styrplattan och fäst frambenen nedåt (bild 2A). Gör ett snitt på ca 1-1,5 cm i buken med sax (figur 2B). Använd försiktigt saxen för att separera huden vid snittets kraniala, kaudala och laterala sidor (figur 2C, D).
- Vänd musen till ryggsidan och dra försiktigt tillbaka huden mot bakbenen för att ta bort huden från dissektionsstället (figur 2E-H).
- Fäst musen vid extremiteterna (figur 2I) och gör ett snitt på cirka 1 cm i buken från bröstkorgen till bäckenet (figur 2J).
OBS: Se till att inte skada de underliggande organen. - Tryck försiktigt organen mot bröstkorgen för att rensa synfältet (figur 2K).
OBS: Bevattna vävnaderna med 1x PBS för att bibehålla hydrering. - Rensa all fettvävnad från bäckenbotten (figur 2L-N).
OBS: Använd pincett för att försiktigt dra och rensa fett från de organ och vävnader som är av intresse.
Figur 1: En ren arbetsyta med alla verktyg som behövs för att utföra dissektionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Avlägsnande av huden och öppning av bäcken- och brösthålorna hos musen. (A) Klämma fast alla lemmar. (B) Inledande snitt. (C) Separera huden från underliggande fascia med sax. d) Styckning av huden och förberedelse för avlägsnande. (E-G) Dra av huden genom att gå runt musen. (H) Helt avlägsna huden från ryggsidan. (I) Fullständigt avlägsnande av huden från bålen och återfästning av musbenen. (J) Öppning av buken. (K) Vy över den öppna buken. (L) Flytta organen ur synfältet. (M) Ta bort fettet. (N) Vy över den rensade bäckenbotten. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. USL-skörd
- Skär livmoderhornen från äggstockarna (figur 3B), dra bort från synfältet och skär av vid livmoderhalsanslutningen (figur 3C).
OBS: Livmoderhornen kan identifieras enligt schemat i figur 3A. Bevattna vävnaderna med 1x PBS för att bibehålla hydrering. - Skär urinledarna bort från blåsanslutningen (figur 3D).
OBS: Detta för att undvika förvirring med USL. - Skär tjocktarmen så nära livmoderhalsen som möjligt (figur 3E,F).
OBS: Bevattna vävnaderna med 1x PBS för att bibehålla hydrering. - Placera musen tillsammans med dissektionsplattan under dissekeringsomfånget för att visualisera USL: erna (figur 3G).
- Använd försiktigt pincetten för att rengöra det omgivande fettet från USL.
OBS: Använd ett andra par pincett för att hålla livmoderhalsen upp i en liten vinkel för att förbättra visualiseringen av var USL skär med livmoderhalsen. Bevattna vävnaderna med 1x PBS för att bibehålla hydrering. - Bind en 5-0 polyglaktinsutur runt livmoderhalsänden av båda USL: erna (figur 4B, C).
USL:erna kan identifieras med hjälp av schematiska bilder och förstoringsbilder (figur 4I–K) - I denna studie används en USL för morfologiska eller biokemiska analyser (dvs. Ramanmikroskopi, immunhistokemi, histologi). Skär den cervikala änden av USL, lämna en bit av livmoderhalsen fäst och skär en bit muskel från botten av USL (figur 4D). Placera den dissekerade vävnaden i ett bad med 1x PBS för att hålla vävnaden hydratiserad (figur 4G, H).
- Använd återstående USL för mekanisk testning och avbildning. Skär den cervikala änden av USL, lämna en bit livmoderhalsen fäst, för att underlätta den mekaniska installationen (Figur 4D).
OBS: Den livmoderhalsiga vävnaden kommer att fungera som ett ankare för att säkra USL under det mekaniska testet. - När alla vävnader av intresse har skördats (steg 3-5), flytta lårbenen från bäckenet (figur 4E).
OBS: Man bör höra ett svagt klickande ljud när lårbenshuvudet är oartikulerat från acetabulära koppen. - Skär bäckenbenet från bäckenbenets distala och proximala ändar och lämna cirka 10 mm total vävnad (figur 4F). Placera den dissekerade vävnaden i 1x PBS.
Figur 3: Rensade bäckenbotten för USL-dissektion . a) Schematisk bild av anatomin. (B) Skärning av livmoderhornen vid äggstocksanslutningen. (C) Skärning av livmoderhorn. d) Skärning av urinledarna. (E) Skärning av tjocktarmen. (F) En tydlig bild av ändtarmen och USL. (G) Placera musen och dissektionsplattan under dissekeringsomfånget. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Vy över USL och omgivande vävnader och dissektion av USL. (A) Schematisk bild av anatomiska landmärken som omger USL. (B) Binda en sutur runt halsändarna. (C) Skära av USL: s livmoderhalsändar. (D) Skärning av USL som ska användas för biokemiska analyser vid sakralanslutningen. (E) Skärning av lårbenet från bäckenbenet. (F) Skär av den proximala änden av bäckenet. (G) Dissekera USL i en 35 mm petriskål. (H) USL med det bifogade bäckenet i en 35 mm petriskål. (I) USL och rektum vid 0,75x förstoring. (J) Ta bort fett från USL. (K) Rengöring av USL med 1,0x förstoring. Skalstång = 2 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Skörd av urinblåsan
- När fettet har läkts ut, håll blåsan med pincetten och lyft den försiktigt i en vinkel på cirka 40° (figur 5A).
- Skär av blåsan från den distala sidan med saxen, precis ovanför livmoderhalsen (figur 5B).
- Placera vävnaden i ett bad med 1x PBS för att hålla vävnaden hydratiserad (figur 5H).
4. Rektum skörd
- När USL: erna är frånkopplade från livmoderhalsen och blåsan dissekeras, lyft livmoderhalsen i en vinkel på cirka 40 ° med pincetten. Det finns rektovaginal fascia som förbinder ändtarmen och livmoderhalsen. Skär försiktigt denna anslutning med skalpellen (figur 5C, D).
- Skär skönhetsbenet vid pubic symphysis med sax. Bredda arbetsytan försiktigt för att öka visuell åtkomst till vävnadsinsättningarna.
- Dra försiktigt ändtarmen mot bröstkorgen med pincetten och använd saxen för att följa ändtarmen från dess bakre sida till anusen. Skär ändtarmen vid anus (figur 5E).
- Placera vävnaden i 1x PBS för att hålla vävnaden hydratiserad (figur 5I).
5. Skörd av livmoderhals-vagina-komplex
- När USL: erna har tagits bort från livmoderhalsen, använd pincetten för att hålla livmoderhalsen. Skär livmoderhalsen så nära vulva som möjligt med sax (figur 5F, G).
OBS: Se till att skära blygdsymfysen för att se den distala änden av slidan visuellt. - Placera vävnaden i 1x PBS för att hålla vävnaden hydratiserad (figur 5J).
Figur 5: Blås-, rektum- och livmoderhals-/vaginadissektioner . (A) Hålla blåsan i en vinkel. (B) Skära av urinblåsan. (C) Skärning av senan som förbinder livmoderhalsen och ändtarmen. (D) Senan vid 1,0x förstoring. (E) Skärning av ändtarmen. (F) Hålla fast livmoderhalsen med pincett. (G) Skärning i den distala änden av slidan. (H) Blåsan i en 35 mm petriskål. (I) Ändtarmen i en 35 mm petriskål. (J) Vävnadskomplexet cervix-vagina i en 35 mm petriskål. Klicka här för att se en större version av denna figur.
6. Provberedning för vävnadskarakterisering
- Mekaniska och visuella analyser av USL
- Placera USL med bäckenfästet över en T-formad vägg i en anpassad färgningsbrunn för att säkerställa full nedsänkning i färgningslösningen (CAD-ritningar av brunnen finns i kompletterande kodningsfil 1 och kompletterande kodningsfil 2).
OBS: Använd sutur och pincett för att hjälpa till med placeringen. - Späd ett kommersiellt tillgängligt färgämne som färgar fria amingrupper (5 μL, se materialtabell) i 2,5 ml 1x PBS, tillsätt lösningen till den anpassade färgningsbrunnen och färga vävnaden i 2 timmar på en vippa vid 4 ° C.
OBS: Virvla lösningen innan du lägger den till färgningsbrunnen. - Under de sista 15 minuterna av färgningen tillsätts 2,5 μl av en kommersiellt tillgänglig fläck av döda cellkärnor (se materialförteckning) till lösningen.
OBS: Virvla lösningen innan du lägger till färgningsbrunnen.
- Placera USL med bäckenfästet över en T-formad vägg i en anpassad färgningsbrunn för att säkerställa full nedsänkning i färgningslösningen (CAD-ritningar av brunnen finns i kompletterande kodningsfil 1 och kompletterande kodningsfil 2).
- Ramans analys av USL
- Fäst USL i en rak linje på ett polydimetylsiloxanblock (PDMS) som finns i en anpassad brunn.
PDMS används som ett mjukt substrat för att möjliggöra fastsättning av provet i önskad konfiguration. Block av varierande dimensioner kan tillverkas genom att blanda de två komponenterna enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning), gjuta i en petriskål och, efter polymerisation, skära PDMS i önskad geometri med ett skalpellblad. - Stift med insektsstift vid suturslingan och vid bäckenmuskeln. Hydrera vävnaden med 1x PBS.
- Fäst USL i en rak linje på ett polydimetylsiloxanblock (PDMS) som finns i en anpassad brunn.
- Återstående vävnader
- Snäppfrys de återstående vävnaderna med flytande kväve eller i en lämplig inbäddningsförening, beroende på önskade analyser.
- Spara vävnaderna vid −80 °C tills efterföljande analyser (t.ex. immunhistokemiska eller biokemiska analyser).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Varje steg i dissektionen av en vildtypmus beskrivs i tillhörande video och figurer relaterade till protokollet. För denna studie användes 6 veckor gamla kvinnliga C57BL/6J-möss (kompletterande tabell 1). Tre provgrupper med USL behandlade med olika enzymer analyserades: kontroll (ingen behandling), kollagenasbehandlade och kondroitinasbehandlade grupper. Den glatta muskulaturen, nerverna och lymfatiken i USL är omgivna av en ECM rik på fibrillära kollagener och glykosaminoglykaner (GAG)5, som tros ge mekanisk integritet till vävnaden. Enzymbehandlingarna valdes för att störa dessa ECM-komponenter och demonstrera möjligheten att lösa de biokemiska och mekaniska skillnaderna med hjälp av Raman-spektroskopi och mekanisk (drag) testning.
För matsmältning placerades alla USL i en termomixer i 3 timmar i en lösning av 1 ml vid 37 ° C och 300 rpm. Kontroll-USL:erna placerades i en lösning av 1x PBS, de kollagenasbehandlade USL:erna placerades i en lösning av 1,0 E/ml kollagenas typ I och de kondroitinasbehandlade USL:erna placerades i en lösning av 2,0 E/ml kondroitinas ABC (se materialtabell).
USL: erna för mekanisk testning utarbetades baserat på steg 6.1. Proverna placerades i en anpassad laddningskammare (en CAD-ritning av kammaren finns i kompletterande kodningsfil 3) för det mekaniska testprotokollet12. Bäckenet fixerades i en stationär konfiguration, och USL: s livmoderhalsände fästes på ett bojställdon, vilket baserades på den design som beskrivs i Jimenez et al.12 (figur 6B; Kompletterande kodningsfil 4), under ett upprätt konfokalmikroskop och fäst vid en 100 mN belastningscell (figur 6A). Bojsystemet minskar bullret som orsakas av ställdonets arm vid mätning av kraft12. En förbelastning på cirka 500 μN användes för att ställa in referenskonfigurationen för USL, och varje USL avbildades i denna position. Därefter applicerades en global förskjutning på 750 μm och hölls i 5 minuter innan avbildning igen. USL återfördes sedan till referenskonfigurationen, och denna process upprepades för en global förskjutning på 1 000 μm. Detta protokoll följdes för alla tre provgrupperna (n = 1 / grupp) för att erhålla spänningsavslappningskurvorna (figur 7), och topp- och jämviktsspänningarna som motstod varje USL bestämdes (tabell 1). Spänningen beräknades genom att dividera den uppmätta kraften med den genomsnittliga tvärsnittsarean (kompletterande tabell 2 och kompletterande tabell 3).
Figur 6: Mekanisk provningsinställning . (A) Laddningskammare under konfokalmikroskopet och ansluten till ställdonet. (B) USL i lastkammaren; Bäckenet förblir stillastående, medan livmoderhalsänden är bunden till ett sammankopplat bojsystem. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Makroskopisk axiell spänningsavslappningsplot för murina USL som utsätts för olika enzymbehandlingar. Enzymbehandlingen tycktes minska den genomsnittliga axiella toppen och avslappnade spänningar som USL upplever vid föreskrivna globala förskjutningar. (*) indikerar avslappnade spänningsvärden, som mättes 200 s efter toppspänning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Prov | Global förskjutning (μm) | Toppspänning (kPa) | Avslappnad jämviktsstress (kPa) |
| Kontroll | 750 | 95 | 67 |
| 1000 | 135 | 97 | |
| Kollagenas- behandlade | 750 | 60 | 27 |
| 1000 | 94 | 60 | |
| Kondroitinas-behandlade | 750 | 17 | 10 |
| 1000 | 25 | 16 |
Tabell 1: Effekten av enzymbehandling på stressmätningar av USL.
Från de tagna bilderna (figur 8) uppskattades töjningsfälten med hjälp av en kombination av manuell och automatisk ("imregdemons" -funktion i MATLAB) texturspårning av ligamentet mellan referens (obelastad) och deformerade tillstånd13. Manuell spårning gjordes genom att välja samma cellkärnor i referens- och deformerade bilderna. Stamfält för Green-Lagrange beräknades från de uppskattade förskjutningsfälten (figur 9). De genomsnittliga axiella töjningarna (E11) beräknades för den mellanliggande delen av varje prov (tabell 2).
Figur 8: Bilder av deformerade tillstånd och referenstillstånd för ett kontrollprov (obehandlat) efter globala förskjutningar . (A) En global förskjutning på 750 μm. (B) En global förskjutning på 1 000 μm. Grönt representerar referenstillståndet och lila är det deformerade tillståndet (skalstapel = 500 μm). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Uppskattning av töjningsfält. De töjningsfält som uppskattats för proverna i varje behandlingsgrupp visar att de axiella (E11), tvärgående (E22) och skjuvande (E12) stammarna var rumsligt inhomogena och den axiella töjningen ökade med ökande applicerad förskjutning (δ). Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Global förskjutning (μm) | Kontroll | Kollagenas-behandlade | Kondroitinas-behandlade |
| 750 | 9.57% | 8.01% | 6.67% |
| 1000 | 11.20% | 15.75% | 10.29% |
Tabell 2: Genomsnittliga axiella töjningar. De genomsnittliga axiella töjningarna för varje mekaniskt testat prov indikerar att den globala axiella stammen i de enzymbehandlade proverna liknade eller var större än i kontrollprovet, vilket tyder på att minskningen av makroskopisk stress berodde på enzymbehandling snarare än mindre stammar.
Konfokal Raman-spektroskopi (785 nm laser, 1,06 μm spotstorlek) utfördes på USL: erna beredda enligt beskrivningen i steg 6.2 och efter O'Brien et al.14 för att semikvantitativt utvärdera vävnadsbiokemin. Kosmiska strålar identifierades och avlägsnades, den linjära baslinjen subtraherades och intensiteten normaliserades för varje spektrum. Samma behandlingsgrupper jämfördes (n = 3/grupp). Representativa spektra för mellansektionen av varje USL (figur 10), samt cervikala och sakrala ändar (kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2) visas.
Figur 10: Påverkan av enzymbehandling på USL-sammansättning. Ramanspektroskopi av USL: s mellanliggande avsnitt tyder på att enzymbehandlingar förändrade den biokemiska sammansättningen av murina USL. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Topparna korrelerades med olika biologiska komponenter baserat på in vivo Raman-spektroskopi av den mänskliga livmoderhalsen utförd av O'Brien et al.15. Våra data normaliserades med hjälp av toppen av fosfatidyletanolamin (1 769 nm), en fosfolipid som finns i cellmembran, som bör förbli oförändrad efter enzymatiska behandlingar. Jämförelse mellan representativa spektra visade att vattenhalten, kollagener, hyaluronsyra, proteoglykaner och GAG minskade i både kollagenasbehandlade och kondroitinasbehandlade USL (figur 10, kompletterande figur 1 och kompletterande figur 2).
Kompletterande figur 1: Påverkan av enzymbehandling på USL-sammansättning. Ramanspektroskopi av USL-cervikala sektionen tyder på att enzymbehandlingarna förändrade den biokemiska sammansättningen av murin USL. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2: Påverkan av enzymbehandling på USL-sammansättning. Ramanspektroskopi av USL-sakralsektionen tyder på att enzymbehandlingarna förändrade den biokemiska sammansättningen av murin USL. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 1: Vikt, ålder och USL-analys av mössen som användes i studien. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 2: Påverkan av enzymbehandling på USL-kraftmätningar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell 3: Beräkningar av tvärsnittsarean för de mekaniskt testade USL. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: CAD-fil för färgning av brunnen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: CAD-fil för färgning av brunnslocket. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: CAD-fil för lastkammaren. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 4: CAD-fil för bojsystemet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Effekten av strukturella skador på kvinnliga reproduktionsvävnader är understuderad, och en lättillgänglig djurmodell för POP-forskning behövs. Musen är en kostnadseffektiv modell som kan efterlikna mänskliga reproduktionsstudier16. På grund av det växande intresset för studier av det kvinnliga reproduktionssystemet finns det ett behov av metoder som hjälper studien av dessa vävnader. För att möta detta behov etableras i detta arbete en metod för att dissekera och förbereda murina bäckenbottenvävnader för strukturella och funktionella analyser.
För att dissektionen ska lyckas behövs tillräcklig tid och omsorg. Murina reproduktiva vävnader är små och bräckliga. Uppmärksamhet på detaljer krävs, särskilt när du rensar fettet som omger USL och bäckenorganen, för att undvika att skada USL eller andra vävnader när fettet avlägsnas. Det är viktigt att använda dissekeringsmikroskopet för att hjälpa till att identifiera skillnader mellan USL och fett, vilket det otränade ögat lätt kan förvirra. Att ta bort urinledarna kan vara till hjälp för att undvika förvirring med USL, eftersom införingspunkterna till urinblåsan och livmoderhalsen ligger nära varandra. När du binder suturen runt USL måste man vara försiktig för att undvika att punktera någon vävnad genom att använda pincett för att försiktigt lyfta USL: erna för att göra plats för nålen. För att extrahera USL: erna kan identifieringen av rätt vävnadsstruktur och viktiga anatomiska landmärken vara svår, men med denna metod och övning kommer dissektionsresultaten att vara repeterbara.
Den föreslagna metoden beskriver ett detaljerat förfarande för dissekering av bäckenbottenvävnader från ett enda prov. En begränsning är att det inte är möjligt att hålla alla vävnader helt intakta eftersom en bit av livmoderhalsen förblir fäst vid den dissekerade USL för att fungera som ett ankare under den mekaniska testningen och hjälpa till att identifiera orienteringen. En annan begränsning är att musens anatomi och människans anatomi har skillnader i vävnadsform, storlek och orientering9. POP har undersökts med hjälp av flera djurmodeller, såsom gnagare 17,18, kaniner19,20, får 20,21, svin5,22,23,24 och icke-mänskliga primater 25,26, samt i mänskliga kadaver24,26,27, och några av dessa modeller har fokuserat på USL: s roll. Medan var och en av dessa modeller är fördelaktig för studien av POP, är en ytterligare fördel med musen den enkla genetiska manipulationen för att skapa nya sjukdomsmodeller, vilket inte är möjligt hos större djur27.
För att dra nytta av musen som modell utvecklas denna metod för att underlätta framgångsrik dissektion av USL och beredning av vävnaderna för olika analyser, inklusive mekanisk testning, Raman-mikroskopi, immunhistokemi och biokemiska analyser. Med denna metod är det möjligt att extrahera USL med dess anatomiska anslutning för att identifiera dess orientering, för att binda USL och för att mekaniskt testa USL under förhållanden som liknar dem som finns in vivo.
USL: s mekaniska integritet härrör från ECM-komponenterna, inklusive kollagener, proteoglykaner och GAG. Typ I-kollagen är ett viktigt dragbärande protein, och skador på denna ECM-komponent tros bidra till USL-fel och POP. I denna procedur jämfördes två olika enzymbehandlingar för att testa hur varierande ECM-kompositionen påverkar USL: s mekaniska respons och sammansättning. Den mekaniska analysen föreslog att kollagen och GAG bidrog till USL: s axiella styvhet, vilket sänkte den genomsnittliga axiella toppen och jämviktsspänningarna (figur 7). De enzymbehandlade USL: erna upplevde en liknande eller större genomsnittlig axiell belastning (tabell 2). Ramanspektroskopi visade att den kollagenasbehandlade USL hade minskat kollageninnehåll, samt minskat vatten och hyaluronsyra, medan den kondroitinasbehandlade USL hade mindre hyaluronsyra, samt lägre vatten- och kollageninnehåll. För dessa resultat validerade Raman-spektroskopi att komponenterna avlägsnades på grund av matsmältningen. Denna metod förväntas göra bäckenbottenbaserade studier mer tillgängliga och öka antalet utredare som fokuserar på detta understuderade område.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av CU Boulder Summer Underground Research Opportunities Program (UROP) -bidrag (CB), NSF Graduate Research Fellowship (LS), Schmidt Science Fellowship (CL), University of Colorado Research & Innovation Seed Grant Program (2020-pris till V.F., S.C. och KC) och Anschutz Boulder Nexus Seed Grant vid University of Colorado (till VF och KC). Särskilt erkännande går till Dr. Tyler Tuttle för hjälp med lastkammarens design samt Calve-labbmedlemmarna för användbara diskussioner.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 11 Blade | Fisher | 3120030 | Removable blade |
| 1x PBS | Fisher | BP399-1 | Diluted from 10x concentration |
| Chondroitinase ABC | Sigma | C3667-10UN | Enzyme |
| Collagenase Type I | Worthington Biochemical | LS004194 | Enzyme |
| Confocal Microscope | Leica | STELLARIS 5 | Upright configuration |
| Dissection Microscope | Leica | S9E | With camera |
| Dumont #5 Forceps | Fisher | NC9626652 | Thin tip |
| Female C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | strain #: 000664 | |
| FemtoTools Micromanipulator | FemtoTools | FT-RS1002 | 100 mN load cell |
| FST Curved Forceps | Fisher | NC9639443 | Curved tip |
| FST Sharp 9 mm Scissors | Fisher | NC9639443 | Dissection scissors |
| Ghost Dye 780 | Tonbo | 13-0865-T500 | Free amine stain |
| Kimwipes | Fisher | 06-666 | Box of 50 wipes |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | Used for tissue preservation |
| PDMS | Thermo Fisher | 044764.AK | Follow manufacturer's instructions |
| Petri Dishes 35 mm | Fisher | FB0875711A | Used for dissected tissue |
| Polyglactin 5-0 Suture | Veter.Sut | VS385VL | With needle |
| Renishaw InVia Raman Microscope | Renishaw | PN192(EN)-02-A | With confocal objectives |
| Rocking Platform | VWR | 10127-876 | 2 tier platform |
| Surgical Gloves | Fisher | 52818 | For dissection |
| Sytox | Thermo Fisher | S11381 | Nuclear stain |
| T-pins | Fisher | S99385 | For dissection |
| Transfer Pipets | Fisher | 13-711-7M | For dissection |
| Underpads | Fisher | 22037950 | To cover dissection pad |
References
- Maldonado, P. A., Wai, C. Y.
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice: Pregnancy-induced changes in elastic fiber homeostasis in mouse vagina. American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Barber, M. D., Maher, C. Epidemiology and outcome assessment of pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 24 (11), 1783-1790 (2013).
- Becker, W. R., De Vita, R. Biaxial mechanical properties of swine uterosacral and cardinal ligaments. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 14 (3), 549-560 (2015).
- Donaldson, K., Huntington, A., De Vita, R. Mechanics of uterosacral ligaments: Current knowledge, existing gaps, and future directions. Annals of Biomedical Engineering. 49 (8), 1788-1804 (2021).
- Amundsen, C. L., Flynn, B. J., Webster, G. D. Anatomical correction of vaginal vault prolapse by uterosacral ligament fixation in women who also require a pubovaginal sling. Journal of Urology. 169 (5), 1770-1774 (2003).
- Jelovsek, J. E., Maher, C., Barber, M. D.
- Blomquist, J. L., Muñoz, A., Carroll, M., Handa, V. L. Association of delivery mode with pelvic floor disorders after childbirth. Journal of the American Medical Association. 320 (23), 2438-2447 (2018).
- Iwanaga, R., et al. Comparative histology of mouse, rat, and human pelvic ligaments. International Urogynecology Journal. 27 (11), 1697-1704 (2016).
- Zhu, Y. P., et al. Evaluation of extracellular matrix protein expression and apoptosis in the uterosacral ligaments of patients with or without pelvic organ prolapse. International Urogynecology Journal. 32 (8), 2273-2281 (2021).
- Jimenez, J. M., et al. Multiscale mechanical characterization and computational modeling of fibrin gels. bioRxiv. , (2022).
- Fischenich, K. M., et al. Human articular cartilage is orthotropic where microstructure, micromechanics, and chemistry vary with depth and split-line orientation. Osteoarthritis and Cartilage. 28 (10), 1362-1372 (2020).
- Luetkemeyer, C. M., Neu, C. P., Calve, S. A method for defining tissue injury criteria reveals ligament deformation thresholds are multimodal. bioRxiv. , (2023).
- O'Brien, C. M., et al. In vivo Raman spectroscopy for biochemical monitoring of the human cervix throughout pregnancy. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 218 (5), 1-18 (2018).
- Louwagie, E. M., et al. et al. ultrasonic dimensions and parametric solid models of the gravid uterus and cervix. PLoS One. 16 (1), 0242118 (2021).
- Drewes, P. G., et al. Pelvic organ prolapse in fibulin-5 knockout mice. The American Journal of Pathology. 170 (2), 578-589 (2007).
- Rahn, D. D., Ruff, M. D., Brown, S. A., Tibbals, H. F., Word, R. A. Biomechanical properties of the vaginal wall: Effect of pregnancy, elastic fiber deficiency, and pelvic organ prolapse. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 198 (5), 1-6 (2008).
- Roman, S., et al. Evaluating alternative materials for the treatment of stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse: A comparison of the in vivo response to meshes implanted in rabbits. Journal of Urology. 196 (1), 261-269 (2016).
- Couri, B. M., Lenis, A. T., Borazjani, A., Paraiso, M. F., Damaser, M. S. Animal models of female pelvic organ prolapse: Lessons learned. Expert Review of Obstetrics & Gynecology. 7 (3), 49 (2012).
- Abramowitch, S. D., Feola, A., Jallah, Z., Moalli, P. A. Tissue mechanics, animal models, and pelvic organ prolapse: A review. European Journal of Obstetrics & Gynecologyand Reproductive Biology. 144, S146-S158 (2009).
- Tan, T., Cholewa, N. M., Case, S. W., De Vita, R. Micro-structural and biaxial creep properties of the swine uterosacral-cardinal ligament complex. Annals of Biomedical Engineering. 44 (11), 3225-3237 (2016).
- Tan, T., et al. Histo-mechanical properties of the swine cardinal and uterosacral ligaments. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 42, 129-137 (2015).
- Baah-Dwomoh, A., Alperin, M., Cook, M., De Vita, R. Mechanical analysis of the uterosacral ligament: Swine vs. human. Annals of Biomedical Engineering. 46 (12), 2036-2047 (2018).
- Vardy, M. D., et al. The effects of hormone replacement on the biomechanical properties of the uterosacral and round ligaments in the monkey model. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 192 (5), 1741-1751 (2005).
- Shahryarinejad, A., Vardy, M. D. Comparison of human to macaque uterosacral-cardinal ligament complex and its relationship to pelvic organ prolapse. Toxicological Pathology. 36 (7), 101 (2008).
- Smith, T. M., Luo, J., Hsu, Y., Ashton-Miller, J., DeLancey, O. L. A novel technique to measure in vivo uterine suspensory ligament stiffness. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 209 (5), 1-7 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models for human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6 (1), 2-9 (2014).
