Summary
In het huidige protocol werd een urethrale strictuurinductie ontwikkeld bij Wistar-ratten, gevolgd door urethrale reconstructie met een buccaal slijmvliestransplantaat. Er werd een retrograde urethrogram en laser-Doppler-beoordeling uitgevoerd, waarbij de urethrale reconstructie (na strictuurvorming) en de plaatsing van het transplantaat werden gevalideerd.
Abstract
Urethrale reconstructie is een belangrijk expertisegebied voor urologen. Het mondslijmvlies wordt als de beste optie beschouwd wanneer urethrale transplantatie noodzakelijk is, hoewel het in sommige gevallen ongepast is of moet worden geoptimaliseerd om een bepaalde vernauwing te herstellen. Daarom is het ontwikkelen van innovatieve procedures en het evalueren van hun vermeende succes in experimentele modellen van cruciaal belang om aan de klinische behoefte te voldoen. Met dit doel beschrijft deze studie een protocol waarbij urethrale strictuur werd geïnduceerd door elektrocauterisatie bij Wistar-ratten. Urethrale reconstructie werd 1 week later uitgevoerd met een buccaal slijmvliestransplantaat, geoogst uit de onderlip en op een ventrale onlay-manier geplaatst. Een retrograde urethrogram toonde een significante verbetering van de urethrale diameter na urethroplastiek in vergelijking met de respectieve waarde na strictuurinductie. Bovendien werd de plaatsing van het transplantaat beoordeeld door middel van bloedperfusieanalyse met behulp van laserdoppler. Zoals verwacht kwam een donkerblauw gebied overeen met het niet-gevasculariseerde buccale slijmvliestransplantaat. Deze procedure kan met succes het normale pathofysiologische proces van urethrale beschadiging en weefselmodulatie simuleren, evenals urethrale reconstructie met behulp van een buccaal slijmvliestransplantaat op een reproduceerbare manier, en dienen als basis voor toekomstig onderzoek op basis van weefselmanipulatie of urethrale transplantaten.
Introduction
Urethrale reconstructie is een grote uitdaging voor urologische chirurgen bij de behandeling van urethrale schade in het kader van vernauwingen, trauma of aangeboren afwijkingen1. Met curatieve intentie is uretroplastiek de voorkeursbehandeling voor de meeste patiënten, met lange (>2 cm) en anterieure urethrale defecten die een vorm van substitutie vereisen uretroplastiek2. Veel weefsels zijn gebruikt als urethrale vervangers, waaronder huidtransplantaten van volledige of gespleten dikte van genitale of extragenitale gebieden, blaaswandslijmvlies of het wijdverspreide mondslijmvlies2. Buccale slijmvliestransplantaten hebben verschillende voordelen, zoals afkomstig uit een natte en haarloze omgeving, gemakkelijk te oogsten, resistent zijn tegen infecties, een dik epitheel, een verminderde kans op pseudo-divertikelvorming en een dunne lamina, waardoor vroege inbibitie en inosculatie mogelijk is3. In tegenstelling tot flappen hebben transplantaten geen bloedtoevoer, afhankelijk van het vaatbed van de ontvanger om te overleven4.
Diermodellen van transplantaten of flappen zijn op grote schaal gebruikt om chirurgische technieken te ontwikkelen of te verfijnen, weefselfysiologie, onderliggende mechanismen en oorzaken van falen te bestuderen en te begrijpen, en innovatieve behandelingsstrategieën te evalueren 5,6. Hoewel grotere dieren de technische uitvoering vergemakkelijken, zijn knaagdieren, namelijk ratten en muizen, gemakkelijker te hanteren en te onderhouden, resistent tegen ziekten, kosteneffectiever en, belangrijker nog, met de instrumenten om moleculaire mechanismen te onderzoeken, cruciaal om innovatieve therapieën te testen 5,6. Er zijn verschillende modellen van flappen en transplantaten beschreven bij ratten met behulp van verschillende weefsels, namelijk huid, botten, spieren6, bloedvaten5 en zelfs vaste organen7. Er is echter weinig onderzoek in muizenmodellen naar transplantaten voor urethrale reconstructie of weefselmanipulatie.
Desalniettemin is de vooruitgang in de translationele wetenschap afhankelijk van diermodellen die ziekten nabootsen. Tot nu toe is de lokale pathofysiologische omgeving niet aangepakt, aangezien urethrale reconstructie onmiddellijk na de vernauwing wordt uitgevoerd. Hierin heeft deze studie tot doel een urethrale reconstructie uit te voeren met behulp van een buccaal slijmvliestransplantaat in een lokale pathofysiologische omgeving. Met dit doel werd de urethrale strictuur 1 week voor de reconstructie geïnduceerd. Dit experimentele model, uitgevoerd bij ratten, maakt het mogelijk om innovatieve therapieën te testen en hun moleculaire mechanismen en klinische voordelen in de toekomst te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU. De procedures zijn goedgekeurd door de institutionele instantie voor dierenwelzijn, met een vergunning van DGAV, de Portugese bevoegde autoriteit voor dierenbescherming (vergunningsnummer 0421/000/000/2021). Voor het huidige onderzoek werden mannelijke Wistar Han IGS (Crl:WI(Han)-ratten (400-500 g) op de leeftijd van 12-14 weken gebruikt. De dieren zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel).
1. Bereiding van oplossingen
- Verdovende oplossing
- Vul een spuit van 3 ml met 2,3 ml medetomidine (1 mg/ml; 0,715 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Vul een spuit van 3 ml met 1,55 ml fentanyl (0,05 mg/ml; 0,02 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar dezelfde centrifugebuis van 15 ml.
- Vul een spuit van 10 ml met 6,15 ml midazolam (5 mg/ml; 9,5 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar dezelfde centrifugebuis van 15 ml, waardoor een verdovingsoplossing van 10 ml ontstaat.
- Label de tube en bewaar deze bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: Deze anesthesiecombinatie (medetomidine, fentanyl en midazolam) biedt een chirurgisch anesthesievenster tot 3 uur. De toediening van atipamezol en flumazenil kan het effect ongedaan maken.
- Anti-kalmerende oplossing
- Vul een spuit van 1 ml met 0,7 ml atipamezol (5 mg/ml; 3,72 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Vul een spuit van 10 ml met 9,3 ml flumazenil (0,1 mg/ml; 1,56 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar dezelfde centrifugebuis van 15 ml, waardoor een anti-kalmerende oplossing van 10 ml ontstaat.
- Label de tube en bewaar deze bij 4 °C in het donker.
- Postoperatieve analgesie-oplossingen
- Vul een spuit van 1 ml met 0,5 ml carprofen (50 mg/ml; 5 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Voeg 9,5 ml NaCl-oplossing (0,9%) toe en verkrijg een carprofenoplossing van 10 ml.
- Vul een spuit van 1 ml met 1 ml buprenorfine (0,3 mg/ml; 0,01-0,05 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Voeg 9 ml NaCl-oplossing (0,9%) toe en verkrijg een buprenorfine-oplossing van 10 ml.
- Label de tubes en bewaar ze bij 4 °C in het donker.
- Perioperatief antibioticum
- Vul een spuit van 2,5 ml met 2,5 ml enrofloxacine (25 mg/ml; 10 mg/kg lichaamsgewicht) en breng over naar een centrifugebuis van 15 ml.
- Voeg 7,5 ml NaCl-oplossing (0,9%) toe en verkrijg een enrofloxacine-oplossing van 10 ml.
- Label de tube en bewaar deze bij 4 °C in het donker.
OPMERKING: De details van alle reagentia voor de bereiding van de bovenstaande oplossingen staan vermeld in de materiaaltabel.
2. Chirurgische inductie van urethrale strictuur
OPMERKING: De chirurgische ingrepen werden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop (10x) (zie Materiaaltabel).
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten voor gebruik: scalpelmesje (nummer 11), puntige pincet, veerschaar, chirurgische pincet, oogheelkundige naaldhouder, chirurgische schaar en een naaldhouder. Gebruik steriele wattenbolletjes om het operatieveld schoon te maken.
- Vul de spuit met de verdovingsoplossing voordat u de rat vasthoudt.
- Houd het dier in bedwang met een buis of een handdoek en til de staart op om de buik bloot te leggen.
- Houd het dier in bedwang en voer een intraperitoneale injectie uit met de verdovingsoplossing (bereid in stap 1.1).
- Test de terugtrekkingsreflexen van het pedaal van de rat om de anesthesie te beoordelen.
- Breng beschermende ooggel aan in beide ogen van het dier. Voer een subcutane injectie uit van de antibiotische oplossing (bereid in stap 1.1), met 10 mg/kg lichaamsgewicht.
- Plaats de rat in de dorsale decubituspositie op een verwarmd kussen en gebruik een dissectiemicroscoop met een vergroting van 10x of 20x om de chirurgische ingreep uit te voeren.
- Reinig de penis en de omliggende buikhuid met povidonjodium (100 mg/ml).
- Trek de voorhuid handmatig terug en plaats een oppervlakkige hechting (7.0 hechting; zie Materiaaltabel) in het dorsale aspect van de eikel van de penis om tractie op de penis uit te oefenen, waarbij u de naaldhouder op zijn plaats laat om de penis teruggetrokken te houden.
- Plaats een veneuze katheter van 22 G in de urethra voor katheterisatie met behulp van een glijmiddel.
- Voer met behulp van een chirurgisch scalpelmesje (nummer 11) een longitudinale ventrale incisie van 1 cm uit in de huid van de penis.
- Gebruik de puntige pincet en de veerschaar om de weefsellagen van de penis te ontleden totdat de urethra ter hoogte van de middelste schacht bloot komt te liggen.
- Breng met een elektrocauterisatieapparaat (zie Materiaaltabel) gedurende 1 s een stroom van 10 W aan in de laterale aspecten van de urethra (op één plaats aan elke kant), ventraal ter hoogte van de middenschacht van de penis.
- Sluit de incisie met een 6.0 resorbeerbare lopende hechting (zie Materiaaltabel).
- Verwijder de urethrale katheter. Verwijder de tractiehechting van de penis.
- Voer de subcutane injectie van analgesie uit: Carprofen met 5 mg/kg lichaamsgewicht en buprenorfine met 0,03 mg/kg lichaamsgewicht.
- Vul de spuit met de anti-sedatieve oplossing (bereid in stap 1.2) en vul, met het dier in ventrale decubitus, de losse huid op om een subcutane injectie met de anti-sedatieve oplossing toe te dienen.
3. Chirurgische ingreep van urethroplastiek met een buccaal slijmvliestransplantaat
OPMERKING: De chirurgische ingrepen werden uitgevoerd met behulp van een stereomicroscoop (10x) (zie Materiaaltabel).
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten die nodig zijn voor deze ingreep: puntige pincet, veerschaar, oogheelkundige naaldhouder, chirurgische schaar, naaldhouder, drie muggentangen en een scalpelmesje (nummer 11). Gebruik kleine sponzen om het operatieveld schoon te maken.
- Dien de verdoving, het antibioticum, de fixatie toe en plaats het dier zoals eerder beschreven (stappen 2.2-2.8).
- Reinig het mondslijmvlies van de onderlip, de penis en de omliggende buikhuid met povidonjodium (100 mg/ml).
- Plaats drie hechtingen (7.0 hechtingen) in de onderlip, aan beide zijden en in het midden, en laat in elke hechting een mug achter om de onderlip terug te trekken en het binnenste slijmvlies bloot te leggen.
- Oogst met behulp van een veerschaar en een puntige pincet een transplantaat met een diameter van 4 mm van het binnenste mondslijmvlies van de onderlip en plaats deze in een kleine recipiënt met steriele zoutoplossing (0,9% NaCl).
- Breng compressie aan in het donorgebied met een spons voor hemostase.
- Verwijder de eerder geplaatste hechtingen van de onderlip.
- Ontbloot de penis zoals eerder beschreven (stap 2.9).
- Plaats een veneuze katheter van 22 G in de urethra voor katheterisatie met behulp van een glijmiddel.
- Gebruik een veerschaar om een omtrek, subcoronale incisie en handschoen de penis tot aan de basis.
- Gebruik de puntige pincet en de veerschaar om de resterende lagen te ontleden en de urethra bloot te leggen.
- Voer met behulp van een chirurgisch scalpelmesje (nummer 11) en een veerschaar een longitudinale ventrale incisie uit, beginnend 3 mm distaal van de coronale sulcus in een verlenging van 4 mm, waarbij de urethra wordt gespatuleerd ter hoogte van de eerder geïnduceerde strictuur (stap 2).
- Plaats twee hechtingen van 7.0 materiaal, één aan elke kant van de spatulatie, en laat in elk een mug achter om de urethra terug te trekken.
- Plaats twee 7.0 niet-resorbeerbare hechtingen, één aan elk uiteinde van de spatel.
- Plaats het buccale slijmvliestransplantaat op een ventrale onlay-manier met de slijmvlieszijde naar het urethrale lumen gericht.
- Haal een van de hechtingen door het transplantaatuiteinde en voer een halve ellips uit met een lopende hechting.
- Herhaal stap 3.15 en stap 3.16 met de andere hechting aan de andere kant van het transplantaat.
- Verwijder de urethrale katheter. Verplaats de huid van de penis.
- Sluit de omtrek, subcoronale incisie met een 6.0 resorbeerbare onderbroken hechting.
- Verwijder de tractiehechting van de penis.
- Dien de analgesie toe, gevolgd door de anti-sedatieve oplossing, zoals beschreven in stap 2.16-2.17.
4. Postoperatieve monitoring
- Observeer de ratten drie tot vier keer per uur en bevestig hun herstel van anesthesie. Bewaak de ademhaling en beoordeel pedaal- en oogreflexen.
- Subcutaan analgesie injecteren om de 12 uur gedurende 48 uur.
OPMERKING: Carprofen werd toegediend met een lichaamsgewicht van 1 ml/500 mg lichaamsgewicht en buprenorfine met een dosis van 0,5 ml/500 mg lichaamsgewicht (zie tabel met materialen). - Geef zacht voedsel gedurende 48 uur na elke procedure en geef ad libitum water.
- Houd de ratten dagelijks in de gaten na de operatie en registreer hun gezondheidstoestand en uiterlijk op de operatieplaats. Geëvalueerde symptomen zijn onder meer gezichtsuitdrukking, vocalisatie, activiteitstoestand, elk teken van pijn, inname van eten en drinken, plassen en bloeden.
5. Evaluatie van de bloedperfusie
OPMERKING: De bloedstroom wordt gemeten direct vóór de inductie van de strictuur, onmiddellijk voor de uretroplastiek en onmiddellijk na de uretroplastiek.
- Voer laser Doppler-perfusiebeeldvorming uit.
- Verdoof de ratten met behulp van de verdovingsoplossing (stap 1.1).
- Leg de rat op rugligging op een verwarmingskussen van 37 °C met penistractie, zoals beschreven in stap 2.9.
- Start de laser Doppler-perfusieimager (zie Tabel met materialen) om gegevens te verkrijgen. Stel vooraf het interessegebied in dat door de laserstraal moet worden gelezen.
- Breng de anti-sedatieve oplossing (stap 1.2) aan om de anesthesie ongedaan te maken.
- Teken met behulp van de beeldanalysesoftware het interessegebied (ROI) rond het gebied van de penis en registreer de fluxwaarden in de loop van de tijd.
6. Radiografisch onderzoek
OPMERKING: Bevestiging van vernauwingsinductie en vernauwingsresolutie na uretroplastiek worden bevestigd met een retrograde urethrogram. Deze evaluatie wordt uitgevoerd 1 week na strictuurinductie (vóór urethroplastiek) en 2 weken na urethroplastiek.
- Voer een retrograde urethrogram uit met behulp van een monoplan-angiografiesysteem (zie Materiaaltabel).
- Verdoof de ratten met behulp van de verdovingsoplossing.
- Plaats het dier op de angiografiematras in een rechter schuine decubitus, met penistractie, zoals beschreven in stap 2.9.
- Richt de kegelstraal op het bekkengebied van het dier, inclusief de penis.
- Plaats een veneuze katheter van 22 G die 2 mm in de distale urethra is geplaatst.
- Begin met het indruppelen van 1 ml jodium radiografisch contrastmateriaal (1:1 verhouding van 623 mg/ml iopromide-oplossing en 0,9% NaCl) in de urethra.
- Voer tegelijkertijd een gewone radiografie uit om het radiografische contrast te identificeren dat voldoet aan het urethrale lumen en om de urethrale diameter te beoordelen.
- Na voltooiing van de beeldvorming keert u de anesthesie terug met de anti-sedatieve oplossing.
7. Euthanasie
OPMERKING: Euthanasie wordt 3 weken na uretroplastiek uitgevoerd (4 weken na strictuurinductie), onmiddellijk na de laatste perfusie-evaluatie.
- Vul een spuit van 2,5 ml met 2 ml/kg pentobarbitalnatrium (400 mg/ml).
- Voer een intraperitoneale injectie van de oplossing uit om het dier te euthanaseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In totaal werden 12 mannelijke Wistar-ratten, met een gewicht van 400-500 g en 12-14 weken oud, gebruikt voor urethrale strictuurinductie. Een retrograde urethrogram (RUG1) werd 1week later 8 uitgevoerd, wat het succes van de techniek bevestigde. De urethrale diameter werd gemeten in millimeters ter hoogte van de strictuurinductie. Hierna werd een urethroplastiek met een buccaal slijmvliestransplantaat uitgevoerd in het ventrale vlak van de urethra van de rat. Dezelfde ratten werden 14 dagen na de uretroplastiek onderworpen aan een tweede retrograde urethrogram (RUG2) en de urethrale diameter werd gemeten in millimeters ter hoogte van de plaatsing van het transplantaat. De gemiddelde diameters van RUG1 en RUG2 waren respectievelijk 1,04 mm en 1,52 mm, wat een significante verbetering (p < 0,0001) in de urethrale permeabiliteit liet zien (figuur 1), waarmee het succes van de chirurgische ingreep en een goede consistentie tussen de metingen werden bevestigd.
Lokale perfusie werd ook geëvalueerd door laserdoppler onmiddellijk voor en na uretroplastiek als een niet-invasieve methode om de microcirculatieomgeving van het weefsel te bewaken. Weefselperfusie wordt weergegeven in kleurgecodeerde afbeeldingen, waarbij lage of geen perfusie donkerblauw is en de hoogste perfusieniveaus rood. De gemiddelde fluxwaarden worden verkregen met behulp van Moor LDI V5.3 beeldverwerkingssoftware (zie Tabel met materialen).
Gezien de variabiliteit van de rattenpopulatie werden 35 mannelijke Wistar-ratten gebruikt. De gemiddelde bloedstroom voor en direct na de uretroplastiek was respectievelijk 603,4 en 137,6 willekeurige eenheden (A.U.). Zoals verwacht komt het gebied met een significante vermindering (p < 0,0001) van de lokale bloedstroom (in blauw) overeen met het niet-gevasculariseerde transplantaat (figuur 2).
Bij alle onderzochte dieren werd een goede tolerantie voor de anesthesieprocedure gevonden; Eerdere resultaten verkregen in het laboratorium (gegevens niet getoond) toonden echter aan dat de anesthesietijd van cruciaal belang kan zijn om volledig herstel van het dier mogelijk te maken, bij voorkeur niet langer dan 45 minuten. Postoperatief waren de ratten ook vrij van grote complicaties.
Figuur 1: Retrograde urethrogram (RUG) analyse. (A) Representatieve beelden van een retrograde urethrogram voor (RUG1) en 14 dagen na urethroplastiek (RUG2). (B) Kwantitatieve evaluatie van de diameter uitgedrukt in millimeters toonde een significante verbetering 14 dagen na urethroplastiek. Afkortingen: RUG1 = Retrograde urethrogram before urethroplastiek; RUG2 = Retrograde urethrogram 14 dagen na urethroplastiek. Veranderingen tussen de groepen werden beoordeeld met behulp van een tweezijdige gepaarde t-toets (n = 12). Schaalbalk: 10 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Laser Doppler-analyse. (A) Representatieve beelden van laser Doppler-flow voor en onmiddellijk na de urethroplastiek. (B) Kwantitatieve evaluatie van de bloedstroom toonde een significant verminderde bloedperfusie na urethroplastiek. Veranderingen tussen groepen werden beoordeeld door middel van een tweezijdige Wilcoxon-gematchte paren ondertekende rangtest (n = 35). Schaalbalk: 0,5 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Urethroplastiek met buccale slijmvliestransplantaten is een belangrijke hoeksteen bij urethrale reconstructie. Er moeten echter innovatieve procedures worden ontwikkeld om de reeds beschreven procedures te optimaliseren en nieuwe vast te stellen, zoals weefselmanipulatiematerialen en biologische transplantaten, om complicaties en morbiditeit te verminderen. Er zijn verschillende procedures gepubliceerd om preklinische modellen op te stellen en chirurgische technieken te definiëren. Souza et al.1 voerden een onderzoek uit met 12 Nieuw-Zeelandse konijnen. Er werd een ventrale longitudinale huidincisie uitgevoerd en de urethra werd gemobiliseerd uit de tunica albuginea, gevolgd door de excisie van een dorsaal segment van de urethra, waardoor een defect ontstond. Tegelijkertijd werd een buccaal slijmvliestransplantaat uit de wang geoogst en als dorsale onlay geplaatst met een 7-0 resorbeerbare hechtdraad. In de huidige studie worden mannelijke Wistar-ratten gebruikt. Door het kleinere formaat zijn ze technisch veeleisender, hoewel gemakkelijker te hanteren. Om de pathofysiologie van urethrale vernauwingen en de fysiologie van het transplantaat na te bootsen, werd in dit model eerder een urethrale strictuurachtige ziekte geïnduceerd, in tegenstelling tot een urethrale defect dat op hetzelfde operatieve moment werd uitgevoerd als de urethrlastiek. Net als Souza et al. werden ook hechtingen gebruikt om de urethra met het transplantaat te sluiten1. Niettemin werd de niet-resorbeerbare hechtdraad gebruikt omdat dit de identificatie van de transplantaatomtrek in verdere studies, zoals histologische, mogelijk maakt. Martín-Cano et al.9 ontwikkelden een model met Wistar-ratten. Er werd een subcoronale circumferentiële incisie gemaakt, gevolgd door degloving van de penis, waardoor een goede urethrale blootstelling mogelijk was. Het transplantaat werd geoogst van de onderlip, de urethra werd geopend via een longitudinale ventrale middellijnincisie en het transplantaat werd op een ventrale onlay-manier geplaatst met niet-resorbeerbare lopende hechtingen. Tijdens de procedure werd een urethrale katheter geplaatst om het urethra-patent te behouden. Deze techniek die hierin wordt beschreven, maakte gebruik van dezelfde benadering van het degloven van de penis, waardoor een goede expositie van de urethra en het plaatsen van een katheter mogelijk is om de urethra tijdens de procedure open te houden. Martín-Cano et al. hebben echter geen eerdere urethrale schade aan de procedure uitgevoerd, wat de natuurlijke transplantaatopname zou kunnen hebben beïnvloed, aangezien de weefsels gezonder waren.
In feite is eenvoudig urethrale letsel en genezing geëvalueerd door anderen, zoals Hofer et al.10, die een rattenmodel ontwikkelden met Wistar-ratten bestaande uit een subcoronale circumferentiële incisie, penisdegloving en een longitudinale ventrale middellijnincisie om de urethra te verwonden, gevolgd door sluiting met een lopende hechting. De conclusie was dat, in fasen van ontsteking, proliferatie, rijping en remodellering analoog aan dermale genezing, genezing van de urethra optreedt. Dit is niet beperkt tot de plaats van het letsel, maar geldt ook voor het overgrote deel van het periurethrale weefsel en het corpus spongiosum. Tavucku et al.11beschreven ook een model van urethrale schade met Sprague-Dawley-ratten, waarbij een penoscrotale ventrale incisie in de middellijn van de huid werd uitgevoerd om de urethra bloot te leggen en vervolgens elektrocauterisatiestroom werd toegepast om urethrale schade te induceren. Hun gegevens toonden een verhoogde collageen type I tot collageen type III verhouding, een sterke indicator van fibrose. Volgens deze redenering heeft een gewond weefsel meer fibrose dan een gezond weefsel, en de verwachting is dat de transplantaatopnames in beide weefsels niet gelijk zijn. Ervan uitgaande dat urethroplastieken worden uitgevoerd in gewonde weefsels, is een groot voordeel van dit model dat het het normale pathofysiologische proces beter nabootst. Een ander groot voordeel is de realisatie van een retrograde urethrogram om strictuurinductie te bevestigen en later om het succes van urethroplastiek op basis van urethrale diameter te bevestigen. In feite hadden alle dieren een verbeterde urethrale diameter na urethroplastiek, wat het succes van de procedure aantoont. Souza et al.1voerden ook een retrograde urethrogram uit, maar pas aan het einde van het onderzoek. In deze studie en in Tavukcu et al.11 werden beide urethrogrammen uitgevoerd, waarbij de effectiviteit van de procedure werd geconcludeerd door middel van urethrogramanalyse. Bovendien werd een perfusie-evaluatie uitgevoerd, voor en na urethroplastiek, die een totaal niet-gevasculariseerd (blauw) gebied bevestigde dat overeenkomt met het buccale slijmvliestransplantaat.
Desalniettemin zijn er verschillende beperkingen met betrekking tot deze procedure, zoals de grootte van de urethra van de ratten, wat resulteert in een veeleisende chirurgische techniek, de duur van de operatie en de afwezigheid van vluchtige anesthesie. Het is echter belangrijk om te bedenken dat, hoewel grotere dieren een eenvoudigere technische uitvoering mogelijk maken, er minder moleculaire hulpmiddelen beschikbaar zijn in vergelijking met knaagdieren, wat een beperking kan zijn voor het onderzoeken van de moleculaire mechanismen achter innovatieve therapieën. Een andere beperking is het gebruik van een enkele methode om urethrale strictuur te induceren, wat te wijten kan zijn aan vele andere oorzaken, waaronder trauma, infectie of aangeboren afwijkingen, die kunnen leiden tot verschillende pathofysiologische fenotypes. Er werd echter elektrocauterisatie gebruikt omdat het een eenvoudige, gemakkelijke, reproduceerbare aanpak met consistente resultaten mogelijk maakt.
Voor zover wij weten, is dit de eerste procedure bij ratten die: (1) een lokale pathofysiologische omgeving voorafgaand aan het transplantaat nabootst door 1 week voor de plaatsing van het buccale slijmvliestransplantaat een urethrale strictuur te induceren; (2) bevestigt de urethrale strictuur en de oplossing ervan door middel van een retrograde urethrogram; (3) bevestigt de locatie van het transplantaat door middel van laser-Doppler; en (4) maakt een experimenteel model mogelijk om het gebruik van transplantaten te optimaliseren en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen op basis van bijvoorbeeld weefselgemanipuleerde materialen, waarin moleculaire mechanismen kunnen worden onderzocht, met een impact op translationele wetenschap om aan de klinische behoefte te voldoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken João Leitão, hoofd van de afdeling Radiologie van het Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, en Catia Fernandes, technicus van de afdeling Radiologie van het Centro Hospitalar Universitário Lisboa Norte, voor hun medewerking bij de realisatie van urethrogrammen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atipamezole | OrionPharma | ANTISEDAN (atipamezole) is indicated for the reversal of the sedative and analgesic effects. | |
| Buprenorphine | RichterPharma | Buprenorphine is a derivative of the opioid alkaloid thebaine that is a more potent (25-40 times) and longer lasting analgesic than morphine. | |
| Carl Zeiss Opmi-1 FC Surgical Stereo Microscope | Carl Zeiss Microscopy, Germany | OPMI 1 FC from ZEISS symbolizes quality, precision and reliability. The manual system is easy to use and delivers high fidelity images with the legendary ZEISS optics. | |
| Carprofen | Zoetis | Carprofen is a non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) of the propionic acid class. | |
| Catheter 22 G. x 1'' | B Braun | Introcan Safety | IV Catheter of fluorinated ethylene propylene (FEP) with firmer construction for arterial access. |
| Enrofloxacin | Bayer | Enrofloxacin is a fluoroquinolone antibiotic. | |
| Fentanyl | Braun | 3644960 | Fentanyl is a powerful synthetic opioid analgesic. |
| Flumazenil | Fresenius Kabi | Benzodiazepine antagonist is used for the complete or partial reversal of the sedative effects caused by benzodiazepines. | |
| High temperature cautery | Fiab | F7244 | Disposable cautery, sterile, high temperature (1200 °C), 28 mm fine tip. |
| Instillagel gel | Farco-pharma | Cellulose-based lubricant with local anaesthetic and disinfecting properties. | |
| Iopromide | Bayer | Non-ionic injectable contrast medium, with iodine. | |
| Laser Doppler imaging system (perfusion imager moorLDI2-HIR and dedicated software) | MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, UK | 5710 | The angiogenesis models uses Laser Doppler imaging to assess blood perfusion in the hind limbs, one of which is ligated surgically. Dedicated measurement and comparison software allows the definition of regions of interest for blood flow assessment on the ischaemic versus non-ischaemic limb to establish a "reperfusion ratio" which can be assessed as often as needed and over a number of days on the same subject. |
| Lubrithal Eye Gel | Dechra | Eye gel used in animals for prevention of dry eyes during anaesthesia. Lubricating and moisturising action on cornea and conjunctiva. | |
| Male Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) rats | Charles River Laboratories, Spain | Twelve to fourteen-week-old | |
| Metedomidin | Virbac | 037/01/07RFVPT | Medetomidine is a synthetic drug used as surgical anesthetic. |
| Midazolam | Labesfal | Benzodiazepine medication is used for anesthesia and procedural sedation. | |
| Monoplan Angiography System | Philips Medical Systems | Azurion 7 M20 | A stationary diagnostic fluoroscopic x-ray system specifically designed to optimize the capability of users to visually and quantitatively evaluate the anatomy and function of blood vessels of the heart, brain and other organs, as well as the lymphatic system. |
| Mosquito forceps | Henry Schein | 102-4346 | Hartman-Mosquito Hemostatic Forcep Curved 3-1/2" Stainless Steel |
| Needle Holder | Henry Schein | 100-2570 | Needle holder Mayo-Hegar, stainless steel, 14 cm |
| Ophtalmic Needle Holder | Asico | AE-6143 | Needle holder barranquer most delicate without lock |
| Pentobarbital Sodium | Ecuphar | Pentobarbital Sodium is the sodium salt of pentobarbital used for euthanasia. | |
| Pointed Forceps | Aesculap | BD335R | Microforceps, 0.30 mm tip |
| Polysorb 6.0 | Medtronic (Covidien) | UL-101 | Coated Synthetic Absorbable Suture aimed to reduce the inflammatory reaction in tissues, followed by gradual encapsulation of the suture by fibrous connective tissue. |
| Providone-Iodine | Mylan | Povidone-iodine 10% is an antiseptic drug, used as a disinfectant before and after surgery. | |
| Scalpel Blade nº11 | B Braun | BB511 | Carbon steel, sterile |
| Spring Scissor | Henry Schein | 600-4826 | Surgical scissors 31 castroviejo |
| Surgical Forceps | Aesculap | BD33R | Microforceps, 0.20mm tip |
| Surgical Scissor | Aesculap | MA873R | Micro Iris Scissor, curved shrap tips |
| SurgiPro 7.0 | Medtronic (Coviden) | VP-702-X | Non-Absorbable Monofilament Polypropylene Suture indicated for use in general soft tissue ligation. |
References
- Souza, G. F., Calado, A. A., Delcelo, R., Ortiz, V., Macedo, A. Histopathological evaluation of urethroplasty with dorsal buccal mucosa: an experimental study in rabbits. International Brazilian Journal of Urology. 34 (3), 345-354 (2008).
- Andrich, D. E., Mundy, A. R. Urethral strictures and their surgical treatment. BJU International. 86 (5), 571-580 (2000).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU International. 93 (6), 807-811 (2004).
- Fu, Q., et al. Substitution urethroplasty for anterior urethral stricture repair: comparison between lingual mucosa graft and pedicled skin flap. Scandinavian Journal of Urology. 51 (6), 479-483 (2017).
- Blain, B., et al. Vascular grafts in the rat model: an anatomic study. Microsurgery. 21 (3), 80-83 (2001).
- Schmauss, D., Weinzierl, A., Schmauss, V., Harder, Y. Common rodent flap models in experimental surgery. European Surgical Research. 59 (3-4), 255-264 (2018).
- You, H., et al. A rat orthotopic renal transplantation model for renal allograft rejection. Journal of Visualized Experiments. (180), e63464 (2022).
- Park, J. H., et al. Balloon-expandable biodegradable stents versus self-expandable metallic stents: a comparison study of stent-induced tissue hyperplasia in the rat urethra. Cardiovascular and Interventional Radiology. 42 (9), 1343-1351 (2019).
- Martín-Cano, F., et al. Histological and immunohistochemical changes in the rat oral mucosa used as an autologous urethral graft. Journal of Pediatric Surgery. 48 (7), 1557-1564 (2013).
- Hofer, M. D., et al. Analysis of primary urethral wound healing in the rat. Urology. 84 (1), e1-7 (2014).
- Tavukcu, H. H., et al. Protective effect of platelet-rich plasma on urethral injury model of male rats. Neurourology and Urodynamics. 37 (4), 1286-1293 (2018).
