Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ملاقط مغناطيسية عالية السرعة للقياسات الميكانيكية النانوية على العناصر الحساسة للقوة

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

هنا ، نصف إعداد ملقط مغناطيسي عالي السرعة يقوم بإجراء قياسات ميكانيكية نانوية على جزيئات حيوية حساسة للقوة بمعدل أقصى يبلغ 1.2 كيلو هرتز. نقدم تطبيقه على دبابيس شعر الحمض النووي ومجمعات SNARE كأنظمة نموذجية ، ولكنه سيكون قابلا للتطبيق أيضا على الجزيئات الأخرى المشاركة في الأحداث الميكانيكية البيولوجية.

Abstract

كانت الملقط المغناطيسي أحادي الجزيء (MTs) بمثابة أدوات قوية لاستجواب الجزيئات الحيوية بقوة ، مثل الأحماض النووية والبروتينات ، وبالتالي فهي مستعدة لتكون مفيدة في مجال البيولوجيا الميكانيكية. نظرا لأن الطريقة تعتمد عادة على التتبع القائم على الصور للخرز المغناطيسي ، فإن الحد الأقصى للسرعة في تسجيل الصور وتحليلها ، وكذلك التقلبات الحرارية للخرز ، قد أعاق تطبيقه منذ فترة طويلة في مراقبة التغيرات الهيكلية الصغيرة والسريعة في الجزيئات المستهدفة. توضح هذه المقالة طرقا مفصلة لبناء وتشغيل إعداد MT عالي الدقة يمكنه حل ديناميكيات النانو بالمللي ثانية للجزيئات الحيوية ومجمعاتها. كأمثلة تطبيقية ، يتم عرض التجارب مع دبابيس شعر الحمض النووي ومجمعات SNARE (آلية الاندماج الغشائي) ، مع التركيز على كيفية اكتشاف حالاتها العابرة وانتقالاتها في وجود قوى على نطاق piconewton. نتوقع أن تستمر MTs عالية السرعة في تمكين القياسات الميكانيكية النانوية عالية الدقة على الجزيئات التي تستشعر القوى وتنقلها وتوليدها في الخلايا ، وبالتالي تعميق فهمنا على المستوى الجزيئي لعلم الأحياء الميكانيكي.

Introduction

تستشعر الخلايا بنشاط وتستجيب للمنبهات الميكانيكية. عند القيام بذلك ، تعرض العديد من الجزيئات الحيوية خصائص تعتمد على القوة تمكن من إجراء تغييرات هيكلية ديناميكية. تشمل الأمثلة التي تحظى بتقدير جيد القنوات الأيونية الحساسة للميكانيكا والعناصر الهيكلية الخلوية التي تزود الخلايا بالمعلومات الميكانيكية الرئيسية من البيئة المحيطة بها.

بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا اعتبار الجزيئات التي تظهر طبيعة فريدة تحمل القوة حساسة ميكانيكيا بمعنى أوسع. على سبيل المثال ، يلعب التكوين المحلي وذوبان دوبلكس الحمض النووي ، بالإضافة إلى الهياكل ذات الترتيب الأعلى مثل G-quadruplexes ، أدوارا حاسمة في النسخ المتماثل والنسخ وإعادة التركيب ، ومؤخرا تحرير الجينوم. علاوة على ذلك ، تؤدي بعض البروتينات العصبية المشاركة في الاتصالات المشبكية وظائفها عن طريق توليد قوى فيزيائية تتجاوز مستويات التفاعلات النموذجية بين الجزيئات. بغض النظر عن المثال الذي يدرسه المرء ، فإن التحقيق في الميكانيكا النانوية للجزيئات الحيوية المعنية بدقة مكانية زمانية عالية سيثبت أنه مفيد للغاية في الكشف عن الآليات الجزيئية للعمليات الميكانيكية البيولوجية المرتبطة1،2،3.

عملت طرق التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء كأدوات قوية لفحص الخواص الميكانيكية للجزيئات الحيوية2،4،5،6. يمكنهم مراقبة التغيرات الهيكلية في الأحماض النووية والبروتينات بالتزامن مع تطبيق القوة ، وبالتالي فحص الخصائص المعتمدة على القوة. هناك إعدادان معروفان هما الملقط البصري والملاقط المغناطيسية (MTs) ، والتي تستخدم حبات بحجم ميكرون لمعالجة الجزيئات5،6،7،8. في هذه المنصات ، يتم ربط البوليسترين (للملاقط البصرية) أو الخرز المغناطيسي (ل MTs) للجزيئات المستهدفة (مثل الأحماض النووية والبروتينات) عبر "مقابض" جزيئية ، مصنوعة عادة من شظايا قصيرة من الحمض النووي المزدوج (dsDNA). ثم يتم نقل الخرزات لممارسة القوة وتصويرها لتتبع مواقعها التي تبلغ عن التغيرات الهيكلية في الجزيئات المستهدفة. الملقط البصري والمغنطيسي قابل للتبديل إلى حد كبير في تطبيقاته ، ولكن توجد اختلافات مهمة في مناهجها للتحكم في القوة. الملقط البصري هي في جوهرها أدوات تثبيت موضعية تحبس الخرز في موضعها ، والتي بسببها تتقلب القوة المطبقة عندما يتغير شكل بناء الهدف ؛ زيادة التمديد ، مثل من تتكشف ، يخفف الحبل ويقلل من التوتر ، والعكس صحيح. على الرغم من أنه يمكن تنفيذ التغذية المرتدة النشطة للتحكم في القوة في الملقط البصري ، إلا أن MTs على النقيض من ذلك تعمل بشكل طبيعي كجهاز مشبك للقوة ، مستفيدة من القوى المغناطيسية المستقرة بعيدة المدى بواسطة مغناطيس دائم ، والذي يمكنه أيضا تحمل الاضطرابات البيئية.

على الرغم من تاريخها الطويل وتصميمها البسيط ، فقد تخلفت MTs عن الملقط البصري في تطبيقاتها للقياسات عالية الدقة ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التحديات التقنية في تتبع الخرز السريع. ومع ذلك ، في الآونة الأخيرة ، قادت عدة مجموعات بشكل مشترك تحسينا متعدد الأوجه لكل من الأجهزة والبرامج لأدوات MT2،9،10،11،12،13،14،15،16،17،18،19. في هذا العمل ، نقدم مثالا على مثل هذا الإعداد الذي يعمل عند 1.2 كيلو هرتز ونصف كيفية استخدامه لإجراء قياسات ميكانيكية نانوية على الجزيئات الحيوية الحساسة للقوة. كأنظمة نموذجية ، نستخدم دبابيس شعر الحمض النووي ومجمعات SNARE العصبية ونفحص تغييراتها الهيكلية السريعة في نظام piconewton. تظهر دبابيس شعر الحمض النووي انتقالات بسيطة من حالتين في نطاق قوة محدد جيدا20,21 ، وبالتالي فهي بمثابة نماذج ألعاب للتحقق من أداء إعداد الملقط. عندما تتجمع بروتينات SNARE في مركب حساس للقوة يدفع اندماج الغشاء 22 ، فقد تمت دراستها أيضا على نطاق واسع بواسطة التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء 14،23،24،25. يتم تقديم الأساليب القياسية لتحليل البيانات واستخراج معلومات مفيدة عن الديناميكا الحرارية والحركية. نأمل أن تسهل هذه المقالة اعتماد MTs عالية الدقة في الدراسات الميكانيكية البيولوجية وتحفيز القراء على استكشاف أنظمة اهتمامهم الحساسة للقوة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم سرد جميع المواد والمعدات الموضحة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يتم إيداع برنامج LabVIEW لتشغيل إعداد MT عالي السرعة الموضح أدناه ، بالإضافة إلى البرامج النصية MATLAB لتحليل بيانات العينة ، على GitHub (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) ومتاح للجمهور.

1. بناء الجهاز

ملاحظة: يشبه المبدأ العام لبناء MT عالي السرعة أنظمة MT التقليدية القياسية ، باستثناء استخدام كاميرا أشباه موصلات أكسيد المعادن التكميلية عالية السرعة (CMOS) ومصدر ضوء متماسك عالي الطاقة (الشكل 1). ارجع إلى مصادر أخرى لمزيد من الأوصاف لأدوات MT القياسية5،26،27.

  1. قم بإعداد مجهر مقلوب على طاولة بصرية مضادة للاهتزاز. قم بتثبيت كاميرا CMOS عالية السرعة وملتقط الإطار.
  2. بناء مرحلة ترجمة لمعالجة المغناطيس في 3D. قم بتركيب مرحلة خطية آلية (مسافة انتقال > 20 مم) عموديا أعلى مرحلة XY اليدوية.
    ملاحظة: تتحكم الحركة الرأسية في القوة ، في حين أن المرحلة XY مخصصة للمحاذاة اليدوية للمغناطيس إلى المحور الأصلي للبناء الأولي للإعداد.
  3. قم بتركيب محرك متدرج دوار ونظام حزام وبكرة للمغناطيس الدوار.
    ملاحظة: ينقل الحزام الحركة الدورانية بين عمود المحرك والمغناطيس الذي يفصل بينهما بضعة سنتيمترات. دوران المغناطيس داخلي للتلاعب الانتقالي.
  4. جبل المغناطيس. استخدم حامل أكريليك (مطلوب من شركة تصنيع ؛ انظر الشكل التكميلي S1) يمكنه إيواء مغناطيسين متطابقين بإحكام بالتوازي ، مع وجود فجوة محددة جيدا تبلغ 1 مم بين المغناطيس (الشكل 1 ب). للاستفادة من أقصى قوة يمكن الحصول عليها مع زوج معين من المغناطيسات ، اضبط الموضع الرأسي لمرحلة الترجمة بحيث يحاذي السطح السفلي للمغناطيس مستوى العينة عند نقله إلى أدنى موضع.
    ملاحظة: ارجع إلى Lipfert et al. لمزيد من المعلومات حول تصميم الحامل وتكوين المغناطيس28. يتم التحكم في ارتفاع واتجاه المغناطيس بواسطة برنامج LabVIEW بالتزامن مع الحصول على البيانات.
  5. المشاهدة باستخدام عدسة موضوعية منخفضة التكبير ، قم بمحاذاة المغناطيس إلى مركز مجال الرؤية. تأكد من أن تدوير المغناطيس لا يسبب إزاحة كبيرة لمركز زوج المغناطيس.
    ملاحظة: إذا كانت نقطة المنتصف بين المغناطيس تدور حول محور الدوران ، فمن المحتمل أن يكون المغناطيس بعيدا عن المركز بسبب حامل غير كامل. يمكن قبول مستوى صغير من عدم المحاذاة بالنسبة لحجم الفجوة ، حيث أن دوران المغناطيس مخصص فقط لفحص الحبال وتطبيق عزم الدوران في تطبيقات محددة.
  6. قم بتركيب صمام ثنائي فائق الإضاءة (SLD) لإضاءة الخرز. مرر الحزمة عبر فجوة 1 مم بين المغناطيسين. تأكد من أن الحزمة موازية بشكل صحيح لتناسب الفجوة وأن الإضاءة ليست مظللة بالمغناطيس.
  7. قم بتثبيت ماسح ضوئي لعدسة بيزو على قطعة الأنف وقم بتركيب عدسة موضوعية للغمر بالزيت 100x (الفتحة العددية [NA]: 1.45) لتتبع الخرز. لتجنب القطع الأثرية المحتملة في تتبع النتائج ، تأكد من الحفاظ على الإضاءة بشكل موحد عند تحريك المغناطيس. أخيرا ، اضبط مستوى الإضاءة على أقصى سطوع دون تشبع وحدات البكسل.
    ملاحظة: لمقارنة مصادر الضوء المختلفة لتتبع الخرز عالي السرعة ، راجع Dulin et al.29.

2. معايرة القوة المغناطيسية

  1. باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR ؛ انظر الجدول 1) ، قم بإعداد شظايا dsDNA 5 kbp (باستخدام Primer B و Primer Z_5k و λ-DNA) التي تم تمييزها بالبيوتين في أحد طرفيها (لربط السطح) و azide على الطرف الآخر (لتعلق الخرزة).
  2. بعد القسم 6 ، قم بإعداد خلية تدفق بجزيئات 5 kbp.
  3. بعد القسم 7 ، حدد بنية حبال حبة جيدة من خلال التحقق من امتدادها ودورانها. على وجه الخصوص ، تأكد من اختيار حبة ذات مسار دوران ضئيل (أي بنصف قطر <200 نانومتر) لتقليل إزاحة ارتفاع الخرزة بسبب المرفق خارج المركز30,31. بمجرد تحديد الحبل الجيد ، ابدأ في تتبع الخرز ، بالإشارة إلى القسم 9.
  4. إذا كان الإعداد جديدا ، فقم بتمييز الضوضاء والثبات للحصول على قياسات موثوقة عالية الدقة. ضع المغناطيس ~ 3 مم من سطح خلية التدفق (لتطبيق >10 pN وقمع الحركة البراونية للخرزة) ، وتتبع موضع z للحبة عند 1.2 كيلو هرتز ، واحسب انحراف ألان (AD) من السلسلة الزمنية z-إحداثيات 32,33 (الشكل 2C). تحقق من أن قيم AD لبضعة نانومترات قابلة للتحقيق في نظام السرعة العالية (<0.1 ثانية) ، وأن التتبع التفاضلي (موضع الخرزة المغناطيسية بالنسبة إلى حبة مرجعية) يقلل من AD في النطاق الزمني الأطول.
    ملاحظة: نحصل عادة على AD يبلغ <3 نانومتر بأقصى معدل (دقة 1.2 كيلو هرتز أو 0.83 مللي ثانية) ، ويستمر AD في الانخفاض حتى 10 ثوان على الأقل ، مما يعني الحد الأدنى من الانجراف. أبلغ آخرون عن قيم مماثلة في إعدادات مماثلة9،10،11،12،34.
  5. مع وجود مغناطيس في وضع الراحة (F ~ 0 pN) ، قم بتسجيل إحداثيات x و y للحبة المربوطة عند 1.2 كيلو هرتز. سجل الموضع لفترة طويلة بما فيه الكفاية (أي أطول بما فيه الكفاية من وقت الاسترخاء المميز للتذبذب35) بحيث يتم أخذ عينات كافية من الحركة البراونية.
    ملاحظة: هنا ، يكون الاتجاه x على طول اتجاه المجال المغناطيسي ، في حين أن الحركة في y تمثل الحركة المستعرضة العمودية على المجال.
  6. حرك المغناطيس بالقرب من خلية التدفق وكرر قياسات موضع الخرزة حتى يلمس المغناطيس الجزء العلوي من خلية التدفق برفق. تحرك بخطوات كبيرة (على سبيل المثال ، 1-2 مم) عندما يكون المغناطيس على بعد أكثر من 7 مم من مستوى العينة (نظرا لأن القوة المطبقة تزداد ببطء في المجال البعيد للمغناطيس) ، ولكن قلل حجم الخطوة تدريجيا (على سبيل المثال ، 0.1-0.5 مم) كلما اقتربت من الاقتراب من أجل معايرة أدق عند مستويات قوة أعلى (الشكل 2 ب).
  7. احسب القوة عند كل موضع مغناطيسي ، d ، باستخدام أي من الطريقتين البديلتين (يتم توفير برنامج نصي MATLAB "force calibration.m" بما في ذلك كلتا الطريقتين ؛ انظر الملف التكميلي 1).
    1. قم بقياس تباين إحداثيات الخرزة y ، (الشكل 2D) ومتوسط موضع z للحبة بالنسبة إلى أدنى موضع Equation 2 (الشكل 2B ، Equation 1 أسفل). ثم استخدم المعادلة (1) 7،27،36 لتقدير القوة (مع نصف قطر حبة ثابتة R = 1,400 نانومتر والطاقة الحرارية kRT = 4.11 pN∙nm):
      Equation 3(1)
    2. بدلا من ذلك ، احسب الكثافة الطيفية للقدرة (PSD) للإحداثيات y ، Sy (الشكل 2E). أوجد القوة المطبقة F عن طريق تركيب نموذج لورنتزيان مزدوج37 مع Sy المقاس باستخدام المعادلة (2).
      Equation 4(2)
      هنا ، R هو نصف قطر حبة ، γ yو γφ هما معاملات السحب الانتقالية والدورانية ، على التوالي (مقدرة من معادلة ستوكس أينشتاين) ، kRT هي الطاقة الحرارية ، Equation 5f + و f- هما ترددان مميزان تم الحصول عليهما باستخدام المعادلة (3).
      Equation 6 (3)
      ملاحظة: نظرا لأن امتداد الحبل L هو دالة للقوة تتبع نموذج السلسلة الشبيهة بالديدان (WLC) الراسخ ، فإن التعبيرات أعلاه تترك F كمعلمة مناسبة وحيدة (نصلح R لتكون 1,400 نانومتر للبساطة لأنها مشتركة عبر جميع مستويات القوة ولا تؤثر القيمة الدقيقة على النتائج بشكل ملحوظ). عند الضرورة ، يجب اعتبار ضبابية الحركة والتعرج من الحصول على الصور المستندة إلى الكاميرا38,39 ، ولكن هذا التأثير لا يكاد يذكر في قياساتنا عالية السرعة فوق 1 كيلو هرتز مع حبال 5 كيلو بكسل.
  8. كرر الخطوات 2.4-2.7 للحصول على بعض البنيات الأخرى. دقق في ثلاث إلى خمس حبات مختلفة لحساب متوسط تباين القوة بين الخرزات المغناطيسية.
    ملاحظة: يجب مراعاة تباين القوة بين الخرزات المغناطيسية المستخدمة لتحديد العدد المناسب من التركيبات للمتوسط. هذا التباين صغير ولكن يمكن أن يؤدي إلى أكثر من 1 pN من الخطأ في القوة المقاسة ، حتى بالنسبة للمنتجات التجارية31. بالنسبة لمعظم التطبيقات ، حيث لا يكون التحديد المطلق للقوى المعنية أمرا بالغ الأهمية ، فإن متوسط نتائج المعايرة من ثلاث إلى خمس حبات يكفي بشكل عام. هناك طريقة بديلة لتفسير هذا الاختلاف وهي قياس القوة باستخدام الحبال الفردية في بداية التجربة ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا. خيار آخر هو تضمين هياكل دبوس الشعر التي يتم فك ضغطها عند مستويات القوة المعروفة في كل بناء31.
  9. ارسم القوة المقاسة كدالة لمسافة المغناطيس وقم بملاءمة دالة أسية مزدوجة للبيانات (الشكل 2F) باستخدام المعادلة (4).
    Equation 7(4)
    هنا ، F0 (خط الأساس) ، A 1 و A 2 (السعة) ، و d 1 و d2 (ثوابت الاضمحلال) هي معلمات مناسبة. تأكد من أن قيم القوة من الطريقتين ، بالإضافة إلى النوبات الأسية المزدوجة الناتجة ، تتفق إلى حد كبير (الشكل 2F ، G).
    ملاحظة: للتأكد من إجراء معايرة القوة بشكل صحيح ، تحقق من علاقة امتداد القوة للتركيبات التي تم فحصها عن طريق رسم الامتداد مقابل القوة المقاسة.
  10. لتصحيح إزاحة ارتفاع الخرزة z الناتجة عن الإمالة المعتمدة على القوة للخرز المغناطيسي30,31 ، قم بتقديرz من الإزاحة الجانبية x ، مع الأخذ في الاعتبار هندسة الحبل غير المركزي مع نصف قطر حبة باستخدام المعادلة (5) ، وتطبيق القيم على قيم الامتداد المقاسة. يتم تنفيذ هذه الخطوة في البرنامج النصي MATLAB "force calibration.m" (الأسطر 252-254).
    Equation 8(5)
    ملاحظة: على الرغم من أن هذا التصحيح يحدث تغييرات صغيرة على التمديد ، خاصة بالنسبة للخرزات ذات نصف قطر دوران صغير (<200 نانومتر) ، فإن هذا الإزاحة غالبا ما يؤثر بشكل خطير على الاستجابة المرنة ، كما هو موضح في التغيير من الشكل 2H إلى الشكل 2I 30,31.
  11. تحقق من طول الثبات Lp عن طريق تركيب نموذج WLC قابل للتوسيع للبيانات باستخدام المعادلة (6).
    Equation 9(6)
    هنا ، L 0 هو طول الكفاف (1.7 ميكرومتر ل 5 kbp) و K0 هو معامل تمدد المحتوى الحراري.
    ملاحظة: على الرغم من أن L p من dsDNA مقبول جيدا ليكون 40-50 نانومتر في مخزن مؤقت نموذجي مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، فإن صيغة WLC المطبقة على الجزيئات القصيرة (<5 kbp) تقلل بشكل منهجي من L p حيث ينخفض L0 31,40. وذلك لأن نموذج WLC الكلاسيكي يفترض وجود بوليمر طول سلسلته أطول بما فيه الكفاية من طول ثباته. هنا ، حصلنا على L p = 40 ± 3 نانومتر لبناء 5 kbp (الشكل 2H) ، وأسفر تصحيح التمديد عن K 0 متجانس من 1100 ± 200 pN (الشكل 2I). سيؤدي تطبيق نموذج WLC المحدود 31,40 ، بالإضافة إلى تصحيح غير Gaussianity في توزيع الامتداد 41 ، إلى زيادة طفيفة Lp.
  12. بمجرد التحقق من معايرة القوة ، قم بتطبيق معلمات التركيب التي تم الحصول عليها للنموذج الأسي المزدوج على برنامج LabVIEW المقدم (الملف التكميلي 2) وانتظر حتى يقوم البرنامج بحساب القوة الحالية في الوقت الفعلي من قراءات المحرك (أي موضع المغناطيس). نظرا لعدم توفر تعبير تحليلي للدالة العكسية d (F) ، قم بإعداد جدول بحث ل d مقابل F بخطوات 0.1 pN عن طريق التقدير العددي لمستويات القوة المستهدفة d. قم بتخزين هذا الجدول في البرنامج أيضا لقيادة التحكم في القوة.

3. تخليق دبابيس الشعر الحمض النووي

ملاحظة: يتم تحضير تركيبات دبوس شعر الحمض النووي لتجارب MT عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة 510 bp في λ-DNA مع اثنين من البادئات المخصصة ، أحدهما يحتوي على بنية دبوس الشعر على نهايته 5 (الشكل 3 أ). بهذه الطريقة ، يتم وضع شكل دبوس الشعر في أحد طرفي منتج PCR.

  1. تحضير الاشعال.
    1. التمهيدي الأمامي: التمهيدي B_hp الذي يحمل علامة 5 ′ بيوتين لربط سطح الزجاج ويرتبط ب λ-DNA. يحتوي هذا التمهيدي على شكل دبوس شعر بساق 8 bp وحلقة 6 nt ، 5 ′ إلى منطقة الارتباط λ.
    2. التمهيدي العكسي: التمهيدي Z_hp المسمى 5 ′ azide لمرفق حبة مغناطيسية ويرتبط ب λ-DNA 1 kbp بعيدا عن التمهيدي الأمامي.
  2. قم بإعداد وتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام λ-DNA (قالب) ، وبوليميراز nTaq ، وظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية (انظر الجدول 1). نظف المنتج باستخدام مجموعة تنقية تجارية.
  3. قم بقياس تركيز الحمض النووي عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند 260 نانومتر (A260) وقم بإجراء الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (2٪ هلام) (انظر الجدول 2) للتحقق من حجم المنتج. العائد النموذجي هو ~ 35 ميكرولتر من محلول ~ 600 نانومتر.

4. إعداد بروتينات SNARE

ملاحظة: يتم تجميع معقدات SNARE العصبية من خلال الجمع بين ثلاثة بروتينات فئران منقاة يتم التعبير عنها من الإشريكية القولونية: VAMP2 / synaptobrevin-2 و syntaxin-1A و SNAP-25 (الشكل 3B). لتسهيل تجميعها ، يتم التعبير عن بناء الجملة و SNAP-25 مع جزء VAMP2 (يفتقر إلى منطقة N-terminal ؛ تسمى "ΔN-VAMP2") في بنية تسمى "ΔN-complex" ، ثم يتم خلطها مع VAMP2 كامل الطول بعد ارتباط مقبض الحمض النووي لتشكيل مجمعات كاملة.

  1. تحضير البلازميدات التي تحتوي على cDNA للتعبير عن بروتينات SNARE (يتم إعطاء تسلسل الحمض النووي لجميع البلازميدات في جدول المواد).
    1. تحضير 6×His-Taged VAMP2 الذي يفتقر إلى المجال عبر الغشاء (2-97; L32C/I97C لوصلات ثاني كبريتيد) المستنسخة في ناقل pET28a.
    2. تحضير syntaxin-1A الذي يفتقر إلى Habc والمجال عبر الغشاء (191-267 ، بدائل I202C / I266C لروابط ثاني كبريتيد) المستنسخة مع 6×His-Taged ΔN-VAMP2 (49-96) في متجه pETDuet-1.
    3. قم بإعداد الشكل المتماثل SNAP-25 كامل الطول b (2-206 ، كل C إلى A) المستنسخ في متجه pET28a. سيتم استخدام هذا لإعداد مجمعات ΔN.
    4. قم بإعداد الشكل المتماثل SNAP-25 كامل الطول 6× له (1-206 ، كل C إلى A) المستنسخ في متجه pET28a للإضافة المباشرة إلى المخزن المؤقت لمقايسة MT لإعادة تجميع مجمعات SNARE بعد الكشف.
  2. تحضير أنبوبين من خلايا Rosetta (DE3) E. coli. قم بتحويل مجموعة واحدة باستخدام بلازميدات VAMP2 (من الخطوة 4.1.1) ، واحدة مع كل من syntaxin-1A / ΔN-VAMP2 وبلازميدات SNAP-25 غير الموسومة (من الخطوتين 4.1.2 و 4.1.3) للتعبير عن مركب ΔN ، والأخرى مع بلازميدات SNAP-25 الموسومة به (من الخطوة 4.1.4).
  3. انقل الخلايا المحولة إلى مرق لوريا بيرتاني (LB) بالمضادات الحيوية المناسبة (هنا ، كاناميسين وكلورامفينيكول ل VAMP2 و SNAP-25 الموسوم به ؛ كاناميسين ، كلورامفينيكول ، وأمبيسيلين لمركب ΔN). قم بزراعتها عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (220 دورة في الدقيقة) حتى تصل الكثافة البصرية (OD) للمرق إلى 0.7-0.9.
  4. أضف 1 mM isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) للحث على التعبير عن البروتين واحتضان الخلايا لمدة 3-4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (220 دورة في الدقيقة).
  5. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي للمزرعة عند 4500 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. تحضير المخازن المؤقتة لتنقية البروتين (انظر الجدول 2).
  7. تعليق كريات الخلايا المعبرة عن SNARE في 40 مل من محلول التحلل المثلج البارد وتحلل الخلايا عن طريق الصوتنة على الجليد (سعة 15٪ ، 5 ثوان و 5 ثوان ، إجمالي 30 دقيقة).
  8. أجهزة الطرد المركزي المحللة عند 15000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
  9. مرر المادة الطافية من خلال عمود جاذبية مملوء ب 1 مل من راتنج Ni-NTA. اغسل الراتنج بمحلول الغسيل A ، ثم باستخدام المخزن المؤقت للغسيل B ، وقم بإزالة البروتينات ب 10 مل من محلول الشطف.
  10. قم بإزالة tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) والإيميدازول من المحلول باستخدام عمود تحلية (اتبع تعليمات الشركة المصنعة). قم بسحب العينة باستخدام برنامج تلفزيوني.
  11. ركز البروتينات باستخدام مرشحات الطرد المركزي (قطع 10 كيلو دالتون) إلى ~ 70 ميكرومتر مع الحفاظ على البروتينات في PBS (عادة ما تنتج 2 مل). قم بقياس تركيز البروتين إما عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (UV) عند 280 نانومتر (A280) أو عن طريق فحص برادفورد.
  12. تحضير الحصصات الصغيرة، وتجميدها في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: سيتم تجميع مجمعات SNARE الكاملة بعد اقتران مركب ΔN على مقبض الحمض النووي (انظر أدناه).

5. ربط مقابض الحمض النووي

ملاحظة: يتم أولا تحضير مقبضين dsDNA 510 bp يحتويان على مجموعات أمينية أولية في أحد طرفيه بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم يتم تحويل مجموعات الأمين إلى مجموعات ماليميد باستخدام رابط متشابك ثنائي الوظيفة ، SM (PEG) 2. ثم يتم ربط المقبضين تساهميا بمعقدات SNARE عبر مجموعات السيستين الخاصة بهم للاقتران الخاص بالموقع (الشكل 3B).

  1. تحضير الاشعال.
    1. تحضير الاشعال الأمامية: التمهيدي B (لتضخيم المقبض B) الذي يحمل علامة 5 ′ البيوتين لربط سطح الزجاج ويرتبط ب λ-DNA ؛ التمهيدي Z (لتضخيم المقبض Z) المسمى 5 ′ azide لمرفق حبة مغناطيسية وله نفس تسلسل التمهيدي B.
    2. قم بإعداد التمهيدي العكسي: التمهيدي N (مشترك للمقبض B والمقبض Z) المسمى 5 ′ أمين لاقتران البروتين ويرتبط ب λ-DNA 510 bp بعيدا عن التمهيدي الأمامي.
  2. قم بإعداد وتشغيل مجموعتين من تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (18 أنبوبا من تفاعل 200 ميكرولتر لكل مقبض) باستخدام λ-DNA (قالب) ، وبوليميراز nTaq ، وظروف تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسية (انظر الجدول 1). نظف المنتج باستخدام مجموعة تنظيف PCR وقم بإزالة كل مقبض ب 45 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. استخدم كمية صغيرة من الماء للحصول على تركيزات عالية من المقابض للحصول على تفاعل فعال في خطوات لاحقة.
  3. قم بقياس تركيز الحمض النووي بواسطة A260. العائد النموذجي هو ~ 650 ميكرولتر من محلول ~ 2 ميكرومتر لكل مقبض. احتفظ بالعينات الصغيرة بعيدا عن بعضها البعض للتحقق لاحقا في الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.
  4. تفاعل مع كل مقبض (1 ميكرومتر في PBS) مع 5 مللي متر SM (PEG) 2. احتضان في درجة حرارة الغرفة مع دوران لطيف. بعد 1 ساعة ، استخدم مجموعة تنقية الحمض النووي لإزالة SM (PEG) 2 غير المتفاعل. قم بسحب كل مقبض ب 250 ميكرولتر من PBS للحصول على حلول ~ 2 ميكرومتر.
  5. امزج محاليل المقبض B ومركب ΔN بنسبة مولية تبلغ 1:16 (على سبيل المثال ، 1 ميكرومتر مقبض B و 16 ميكرومتر مركب ΔN) في PBS واحتضانها لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة. احفظ عينة صغيرة عن الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.
  6. أضف محلول VAMP2 في فائض مولي 2.5 أضعاف فوق مركب ΔN المستخدم في الخطوة السابقة. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة. يتم تجميع مجمعات SNARE الكاملة في هذه الخطوة.
  7. قم بإزالة البروتينات الحرة عن طريق التبادل العازل مع برنامج تلفزيوني جديد ومرشح طرد مركزي (قطع 100 كيلو دالتون): جهاز طرد مركزي عند 14000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، كرر 6x على الأقل ، وقم بتشغيله لمدة 15 دقيقة لآخر دورة. قم بقياس الزيادة في نسبة A260 / A280 لمراقبة إزالة البروتينات الحرة. احفظ عينة صغيرة عن الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز.
  8. أضف المقبض Z إلى المحلول في فائض مولي بمقدار 15 ضعفا على المقبض B. حافظ على تركيز المقبض Z أعلى من 1 ميكرومتر على الأقل لتسهيل التفاعل. احتضان الخليط طوال الليل على حرارة 4 درجات مئوية مع التقليب.
  9. تحقق من المواد الوسيطة (المقبض B واتحادات البروتين) والمنتج النهائي (مركب SNARE بمقبضين) عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز (الشكل 3B ، أقحم) (انظر الجدول 2).
    ملاحظة: إذا تم ربط البروتينات بنجاح بالمقبض B ، اكتشاف تحول في الحركة. على وجه الخصوص ، يمكن تأكيد تكوين معقدات SNARE الكاملة على مقابض الحمض النووي من خلال مقاومتها لكبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ، على عكس مجمعات ΔN ، التي يتم تفكيكها في SDS وتترك فقط بناء الجملة مرتبطا بالحمض النووي (قارن b و c في الشكل 3B).
  10. تحضير الحصصات الصغيرة، وتجميدها في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظة: على الرغم من أن الحل النهائي يحتوي على مقابض غير متفاعلة ، إلا أنه سيتم اختيار البنية المطلوبة التي تحمل علامة مزدوجة بالبيوتين والأزيد فقط أثناء تجميع العينة في خلية التدفق.

6. تصنيع خلايا التدفق

ملاحظة: يتم إنشاء خلايا التدفق لقياسات MT من خطتين زجاجيتين مرتبطتين معا بشريط على الوجهين (الشكل 3C). يتم طلاء غطاء واحد بمزيج من PEG والبولي إيثيلين جلايكول البيوتينيل (PEG) لتجنب الارتباط غير المحدد ولتمكين الربط المحدد للجزيئات المستهدفة عبر ارتباط البيوتين والنيوترافيدين (الشكل 3D). بعد ذلك ، يتم غرس محاليل المواد الخاصة بتجارب MT بالتتابع في خلية تدفق باستخدام مضخة حقنة (الشكل 3C ، D).

  1. قم بإعداد غطاءين زجاجيين ، أحدهما لكل من السطح العلوي (24 مم × 50 مم ، رقم 1.5 سمك) والسطح السفلي (24 مم × 60 مم ، رقم 1.5 سمك). قم بتنظيف أغطية الغطاء عن طريق الصوتنة في 1 M KOH لمدة 30 دقيقة. بعد صوتنة ، شطف الغطاءزلات بالماء المقطر والاحتفاظ بها في الماء حتى الخطوة التالية.
  2. PEGylate الغطاء السفلي باتباع البروتوكولات المنشورة42,43. استخدم N- [3- (تريميثوكسي سيليل) بروبيل] إيثيلين ديامين للسيلانا وخليط 1: 100 (ww) من البيوتين-PEG-SVA و mPEG-SVA في مخزن مؤقت بيكربونات 100 مللي متر. حافظ على أغطية PEGylated جافة عند -20 درجة مئوية وقم بتخزينها لبضعة أسابيع.
  3. في يوم التجارب ، أخرج أغطية PEGylated وجففها بمسدس النيتروجين. افحصها بصريا بحثا عن الأوساخ للتأكد من نظافتها.
  4. لعمل قنوات العينة ، قم بإعداد شرائط بعرض ~ 2 مم من الشريط على الوجهين ووضع أربعة شرائط على غطاء سفلي (سطح PEGylated لأعلى) ، بالتوازي مع بعضها البعض ومفصولة عن بعضها البعض بواسطة ~ 5 مم (الشكل 3C).
    ملاحظة: بهذه الطريقة ، يمكن إنشاء ثلاث قنوات عينة بعرض 5 مم في خلية تدفق واحدة.
  5. ضع غطاء علوي في وسط قسيمة الغطاء السفلية ، مع ترك ~ 5 مم من المساحة على الحواف القصيرة لمداخل ومنافذ القناة. اضغط برفق على الجزء الخلفي من الغطاء العلوي باستخدام ملاقط لإغلاق القنوات بإحكام.
  6. لعمل خزان مدخل ، قم بقص حافة طرف ماصة 200 ميكرولتر. اقطع ~ 10 مم من الفتحة الأوسع للسماح بالاحتفاظ ~ 200 ميكرولتر من المحلول. اصنع ثلاثة منهم لقنوات التدفق الثلاثة. لتكوين المنافذ ، قم بإعداد ثلاث إبر حقنة تناسب الأنبوب لمضخة المحقنة.
  7. باستخدام 5 دقائق من الإيبوكسي ، قم بلصق الخزانات ومحاور الإبرة بخلية التدفق. تأكد من تشكيل ختم كامل لتجنب التسرب ، وأن القنوات ليست مسدودة بالغراء الزائد. اتركه يجف لمدة 30 دقيقة على الأقل.

7. تجميع بنى حبة الحبل

ملاحظة: يتم إدخال حلول المواد لتجارب MT ، بما في ذلك تلك الخاصة بتركيبات حبال الخرز ، بالتتابع في خلايا التدفق باستخدام مضخة حقنة (الشكل 3C ، D).

  1. تحضير الخرز المغناطيسي. خذ 5 ملغ من حبات الإيبوكسي M270 من محلول مخزون (~ 3.3 × 108 حبات في 167.5 ميكرولتر من ثنائي ميثيل فورماميد) واستبدل المذيب بمحلول فوسفات (انظر الجدول 2) عن طريق الفصل المغناطيسي للخرز.
  2. تحضير الخرز في ~ 1.1 × 109 حبات mL−1 في مخزن فوسفات مع 1 M كبريتات الأمونيوم وتفاعلها مع 2 mM dibenzocyclooctyne (DBCO) -NH2. احتضان الخليط لمدة 3 ساعات على خلاط دوار في درجة حرارة الغرفة. بعد التفاعل ، اغسل الخرزات 3x بمحلول فوسفات طازج لإزالة الجزيئات غير المتفاعلة.
    ملاحظة: يمكن تخزين الخرزات المغسولة دون دوران إضافي عند 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قبل الاستخدام.
  3. قم بتوصيل إبرة على مخرج قناة خلية التدفق بمضخة المحقنة باستخدام أنابيب البولي إيثيلين. موازنة القنوات مع برنامج تلفزيوني.
  4. أدخل الحلول التالية بالتتابع في القناة عن طريق الشفط بالمضخة: NeutrAvidin ، التركيبات المستهدفة (دبابيس شعر الحمض النووي أو مجمعات SNARE بمقابض الحمض النووي) ، حبات البوليسترين المرجعية ، والخرز المغناطيسي المطلي ب DBCO. قبل الاستخدام ، دوامة محاليل الخرزة تماما لتفريق مجاميع الخرز المحتملة.
  5. اغسل الخرزات غير المنضمة أثناء تطبيق 0.1 pN من القوة.
    ملاحظة: يسهل تطبيق قوة تصاعدية صغيرة إزالة الخرز غير المنضم ويساعد على تجنب تمزق تركيبات حبال الخرز المربوطة على وجه التحديد.
  6. للتجارب مع مجمعات SNARE ، قم بتضمين 1.5 ميكرومتر SNAP-25 في المخزن المؤقت النهائي.
    ملاحظة: يمكن لجزيئات SNAP-25 الحرة إعادة ربط مجمعات SNARE بعد الكشف عنها والسماح بإجراء قياسات متكررة على مركب واحد.

8. تحديد التركيبات المستهدفة

  1. على سطح قناة خلية التدفق ، ابحث عن الخرزات المغناطيسية المربوطة بجزيئات مفردة من البنية المستهدفة. تأكد من وجود حبة مرجعية في مكان قريب.
  2. قم بتدوير حبة مرشحة وتأكد من أنها تدور بحرية. إذا كانت الخرزة مربوطة بجزيئات متعددة ، فإنها تظهر حركة مقيدة.
  3. قم بتدوير الخرزة لبضع لفات كاملة واكتشف نصف قطر الدوران (يتم تنفيذ هذه الوظيفة في البرنامج المقدم). على نحو مفضل ، اختر حبة ذات نصف قطر دوران صغير.
    ملاحظة: يشير نصف القطر هذا إلى مقدار انحراف الخرزة عن محور الحبل ، والذي يتم تحديده عشوائيا أثناء تجميع حبل الخرز30,31. في جميع التجارب ، يخفف الحد الأدنى من التمركز للخرزة من العديد من القطع الأثرية المرتبطة بنصف قطر الخرزة العالي إلى نسبة تمديد الحبل التي نستخدمها.
  4. قم بزيادة القوة من 0 إلى 5 pN لتحديد حبات جيدة مربوطة واحدة. ابحث عن تغيير كبير في نمط الحيود للحبة الناتجة عن تمدد حبل 1 كيلو بايت (أو ما يعادل مقبضين 510 bp). إذا لم يتغير نمط الحيود بشكل كبير ، فقم بخفض القوة إلى الصفر وابحث عن حبة مرشح أخرى.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة رفع حبة ~ 300 نانومتر بسهولة من الصور الأولية دون البدء فعليا في عملية التتبع.

9. تتبع حبة لقياسات التمديد

ملاحظة: يتم إجراء تتبع الخرز عن طريق تحليل صور الخرز في الوقت الفعلي في برنامج LabVIEW المزود مع هذه المقالة. تم استخدام طريقة التتبع ومتغيراتها في معظم أنظمة MT التقليدية وتم شرحها في الأدبيات السابقة2،5،7،26. من خلال قياس موضع حبة مغناطيسية بالنسبة إلى حبة مرجعية ثابتة (أي التتبع التفاضلي) ، تصبح قياسات الموضع قوية للغاية لاضطراب خارجي.

  1. بمجرد وضع حبة مغناطيسية مناسبة مع حبة مرجعية ، انقر فوق الزر معايرة لبدء التحضير لتتبع الخرزة.
  2. انقر على الخرز في الصورة لتحديد مواقع الخرز. سيتم بعد ذلك اقتصاص الصور إلى مناطق الاهتمام (ROIs) (على سبيل المثال ، 150 × 150 بكسل لحبة 3 ميكرومتر) حول الخرز ثم تحليلها بشكل أكبر لاستخراج إحداثيات الخرزة الدقيقة.
  3. انتظر حتى يكتمل دوران المغناطيس. تسجل هذه العملية إحداثيات x و y للخرزة (عن طريق حساب الارتباط المتقاطع 2D44 أو باستخدام التماثل الشعاعي45 لصور الخرز ، مع أداء مماثل) أثناء تدوير المغناطيس لتوثيق المرفق خارج المركز للحبة31.
  4. للتتبع في الاتجاه z ، انتظر حتى يقوم البرنامج بإنشاء جدول بحث لصور حيود الخرز على مسافات مختلفة من المستوى البؤري. يتم ذلك عن طريق تحريك العدسة الموضوعية باستخدام ماسح بيزو في خطوات متساوية البعد وتسجيل صور حبة متوسط التذبذب في كل موضع. بعد ذلك ، يتم تحديد إحداثيات z للخرز في التجارب الفعلية من خلال مقارنة صور الخرز في الوقت الفعلي بجدول البحث مع الاستيفاء7.
  5. عند الانتهاء من إنشاء جدول البحث، قم بتمكين التتبع والتركيز التلقائي (اضغط على الزر تعقب ؟ والتركيز البؤري التلقائي؟ الأزرار) وانقر على زر الاستحواذ لبدء تسجيل مواضع الخرز.
    ملاحظة: التركيز البؤري التلقائي اختياري ولكن يوصى بتصحيحه لانحراف المرحلة في z أثناء الاستحواذ.

10. فرض مخططات التطبيق

  1. تجارب منحدر القوة: للتحقق من علاقة امتداد القوة للبناء ، قم بتطبيق منحدر القوة لأعلى ولأسفل بمعدل تحميل ثابت (± 1.0 pN s−1) (الشكل 4A). على سبيل المثال ، قم بتطبيق ثلاث جولات من دورة 0-20-0 pN للتحقق من الطول الإجمالي للبنية ومنحنى تمديد القوة للمقابض.
  2. من خلال تحديد معلمات الحبل في البرنامج ، قم بتراكب منحنى تمديد قوة WLC أعلى البيانات المقاسة ، وحدد ما إذا كانت حبة الهدف مربوطة ببناء عينة حقيقية بمقابض الحمض النووي المناسبة. استخدم طول الكفاف المعروف (على سبيل المثال ، ~ 340 نانومتر ل 1 كيلو بايت dsDNA) وطول ثبات WLC (30-45 نانومتر ل dsDNA31 القصير) للبناء كنقطة بداية. قم بتطبيق طريقة تصحيح التمديد الموضحة في الخطوة 2.11 إذا لزم الأمر.
  3. إذا تم التحقق من البنية ، فقم بفحص استجابة امتداد القوة بالتفصيل للبحث عن امتداد إضافي ناتج عن دبابيس الشعر للجزيئات المستهدفة أو مجمعات SNARE.
  4. تجارب القوة الثابتة: قم بتغيير القوة المطبقة تدريجيا في خطوات منفصلة للتحقق من حساسية قوة الجزيئات المستهدفة (الشكل 4B).
    ملاحظة: تتيح MTs إجراء تجارب بسيطة وفعالة للقوة الثابتة لأن القوة المطبقة تظل ثابتة عندما يظل المغناطيس ثابتا.
    1. بالنسبة لدبابيس شعر الحمض النووي ، قم بتطبيق 4-8 pN من القوة بخطوات 0.2-0.5 pN ، وقم بقياس موضع الخرزة ل ~ 10 s عند كل مستوى قوة.
    2. بالنسبة لمجمعات SNARE ، قم بتطبيق 14-16 pN من القوة بخطوات 0.1-0.2 pN ، وقم بقياس موضع الخرزة ل ~ 10 s عند كل مستوى قوة.
  5. تجارب القفز بالقوة: مراقبة الأحداث الانتقالية لمجمعات SNARE.
    ملاحظة: تتضمن تجارب القفز بالقوة، مثل تجارب القوة الثابتة، تغييرات في مستويات القوة. ومع ذلك ، فإن قفزات القوة تستخدم المزيد من التغييرات المفاجئة في القوة المطبقة ، مما يسمح بمراقبة الأحداث التي تسببها القوة في الجزيئات التي تم فحصها ، مثل التمزق المفاجئ لمجمعات البروتين. على سبيل المثال ، نظرا لأن مجمعات SNARE تظهر تباطؤا هيكليا في دورة القوة23 ، فمن المفيد إجراء تجارب القفز بالقوة وقياس زمن الانتقال إلى الانتقال (الشكل 4C).
    1. حيويي: تقشير جزيء VAMP2 من مركب SNARE ثلاثي سليم ، تاركا معقدا ثنائيا من syntaxin-1A و SNAP-25.
    2. إعادة الضغط: ضغط جزيء VAMP2 غير المضغوط لتجديد مركب SNARE سليم.
      1. تتكشف: التفكيك الكامل لمجمع SNARE مصحوبا بتفكك كامل ل SNAP-25. تبقى جزيئات VAMP2 و syntaxin فقط في البناء بعد أن تتكشف.
      2. إعادة الطي: تجديد مركب SNARE عند ربط جزيء SNAP-25 الحر من المخزن المؤقت.
  6. عند 2 pN ، قم بتحفيز تجميع مجمع SNARE سليم عن طريق الانتظار (~ 30 ثانية) لارتباط جزيء SNAP25 الحر. لوحظ انخفاض مفاجئ في التمديد عند تكوين مجمع SNARE.
  7. لمراقبة أحداث فك الضغط ، انتظر بضع ثوان عند 10-12 pN ، ثم انتقل إلى 14-15 pN فجأة بأقصى سرعة ممكنة للمحرك. اعتمادا على القوة المستهدفة ، سيظهر مجمع SNARE إما انتقالا عكسيا بين المواد الوسيطة غير المضغوطة جزئيا (كما هو الحال في تجارب القوة الثابتة) أو قفزة ~ 25 نانومتر إلى حالة أعلى غير مضغوطة بعد وقت انتظار عشوائي (أو زمن انتقال).
  8. لمراقبة أحداث إعادة الضغط ، قم بخفض القوة إلى 10-12 pN فور ملاحظة فك الضغط. مرة أخرى ، يظهر مجمع SNARE انتقالا عشوائيا إلى الحالة السفلية بسحاب بعد بعض الكمون العشوائي. إذا حدث التكشف بعد فك الضغط ، فسوف يفشل المجمع في إعادة الضغط ، حيث سيكون جزيء SNAP-25 مفقودا.
  9. لمراقبة الأحداث التي تتكشف ، انتظر لفترة أطول بعد ملاحظة فك الضغط لاكتشاف زيادة أخرى في الامتداد (~ 2 نانومتر).

11. تحليل البيانات

ملاحظة: تعتمد أنواع التحليل التي يمكن للمرء إجراؤها باستخدام بيانات الترجمة الآلية على النظام المستهدف. ومع ذلك ، هناك طرق شائعة لاستخراج معلومات مفيدة من التجارب المعنية الموضحة في الشكل 4. يتم إجراء جميع التحليلات باستخدام MATLAB (R2021a) باستخدام الرموز المخصصة المتوفرة مع هذه المقالة. تقوم هذه الرموز بإنشاء مؤامرات باستخدام نفس البيانات الواردة في هذه المقالة. لاحظ أنه بينما تم أخذ البيانات الأولية من تتبع 100 هرتز مباشرة للتحليل ، فإن البيانات من تتبع 1.2 كيلو هرتز كانت عادة ما تتم تصفيتها بشكل متوسط (مع نافذة منزلقة من خمس نقاط) قبل التحليل لتقليل الضوضاء (باستثناء تحليل الضوضاء).

  1. تجارب منحدر القوة: تحليل العلاقة بين القوة والتوسع (على سبيل المثال ، مرونة البوليمرات) ونقل القوة لاستخراج المعلومات حول الخواص الميكانيكية النانوية.
  2. تجارب القوة الثابتة: تحليل سكان الولاية ووقت السكون (أو معدل الانتقال) كدالة للقوة لاستخراج المعلمات الهيكلية (على سبيل المثال ، المناطق المشاركة في المرحلة الانتقالية) ، والديناميكا الحرارية (على سبيل المثال ، فرق الطاقة الحرة) ، والمعلمات الحركية (على سبيل المثال ، حاجز الطاقة) للتغيرات المطابقة.
  3. تجارب القفز بالقوة: تحليل حركية التمزق (على سبيل المثال ، تفاعلات البروتين والبروتين وربط مستقبلات اليجند) أو عمر الوسيطات العابرة (على سبيل المثال ، تكشف الجزيئات الحيوية) لاستخراج استقرار الجزيئات المستهدفة وحالاتها.
  4. كتطبيقات تمثيلية ، قم بتحليل بيانات العينة لدبابيس شعر الحمض النووي ومجمعات SNARE:
    1. انتقالات الدولتين لدبوس شعر الحمض النووي: قوة فك الضغط ، ومسافة الفتح ، واعتماد القوة على التحول السكاني ، وتعيين الحالة وقياسات معدل الانتقال باستخدام نموذج ماركوف المخفي (HMM) (رموز MATLAB المقدمة).
    2. التغييرات التوافقية لمجمعات SNARE: قوة فك الضغط ، واعتماد القوة على الحالات الوسيطة وزمن انتقال فك الضغط ، والتباطؤ في إعادة الضغط ، وسلوك التكشف / إعادة الطي.
      ملاحظة: تم إعطاء نماذج تمديد القوة لمقابض الحمض النووي ودبابيس شعر الحمض النووي والمطابقات المعقدة SNARE في المراجع السابقة14،31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

معايرة القوة
اختلفت النتائج من طريقتي قياس القوة (تباين الإزاحة الجانبية للخرز وتحليل طيف القدرة) بمقدار 0-2 pN (الشكل 2G). وفقا للنتائج الواردة في الشكل 2F ، يمكننا الوصول بشكل موثوق إلى 30 pN باستخدام مغناطيس النيوديميوم العادي.

انتقالات الحالتين لدبوس شعر الحمض النووي 8 bp
قمنا أولا بالتحقيق في الميكانيكا النانوية لدبوس شعر الحمض النووي القصير (الشكل 5). تم تمييز دبابيس شعر الحمض النووي على نطاق واسع من خلال التحليل الطيفي التقليدي للقوة أحادية الجزيء ، وبالتالي يتوفر مصدر واسع من المراجع للمقارنة معها. عادة ما يكون فك ضغط دبوس الشعر القصير قابلا للانعكاس ، لذلك يتم أيضا ملاحظة أحداث إعادة الضغط في نفس نطاق القوة الذي يحدث فيه فك الضغط (الشكل 5 أ). من خلال تطبيق منحدر قوة بين 0 pN و 20 pN (الشكل 5B) ، تم التحقق من الامتداد الناجم عن القوة لبناء دبوس الشعر لاتباع نموذج WLC ، والذي يمكن أن يعزى فقط إلى مرونة مقابض الحمض النووي (الشكل 5C ، "مغلق"). عند حوالي 6 pN ، أظهر البناء تقلبات إضافية في التمديد ، مرتبطة بفك ضغط عكسي لهيكل دبوس الشعر (الشكل 5C ، أقحم). أخيرا ، عند ~ 8 pN ، اختفى الانتقال في النهاية واستقر الامتداد على الحالة العليا التي تم تمديدها بمقدار ~ 7 نانومتر. وبالتالي ، فإن ملف تعريف امتداد القوة المقاس فوق 8 pN قد انقطع على منحنى نموذج جديد (الشكل 5C ، "مفتوح") يتضمن طول المنطقة المفردة التي تقطعت بها السبل من دبوس الشعر غير المضغوط.

ثم أجرينا تجارب القوة الثابتة لفحص انتقال دبوس الشعر بشكل منهجي. تم قياس موضع الخرزة في نطاق القوة من 4-8 pN مع خطوات 0.5 pN ل ~ 10 s في كل مستوى. بعد ذلك ، تم جمع قيم الامتداد وتحليلها لقياس توزيع توازنها كدالة للقوة. أشارت نتائج تتبع 100 هرتز إلى تحول تدريجي نحو حالة أكثر امتدادا في نظام القوة هذا (الشكل 5D) ، لكن الرسوم البيانية التي تم الحصول عليها للامتداد لم تكن واضحة بما يكفي لحل مجموعات سكانية متميزة (الشكل 5E). في تناقض صارخ ، عندما أجريت نفس التجارب عند 1.2 كيلو هرتز (الشكل 5F) ، كشفت المسارات عالية السرعة لتغيرات الامتداد بعد الترشيح اللطيف (مرشح متوسط من خمس نقاط) عن مجموعتين متميزتين تم وصفهما جيدا بمزيج من توزيعين غاوسيين (الشكل 5G). ظل الفصل بين المجموعتين ، مما يشير إلى مسافة فتح دبوس الشعر ، دون تغيير عند ~ 7 نانومتر في نظام قوة فك الضغط (الشكل 5H). كان الانحراف في الأطراف (4 pN و 8 pN) بسبب التوطين غير الدقيق لحالة واحدة بسبب ندرتها.

كشفت البيانات أن القوة المتوسطة للانتقال غير المضغوط (القوة التي يصبح عندها السكان المغلقون والمفتوحون متساوين) F1/2 كانت ~ 6 pN ، وأصبحت الحالة العلوية المفتوحة مهيمنة تدريجيا مع زيادة القوة عبر 4-8 pN (الشكل 5I). عند تزويدها بعلاقة بولتزمان للاحتمال المفتوح ، Equation 10تم الحصول على القيم الدقيقة ل F 1/2 = 5.9 pN و Δz = 7.1 نانومتر ، بما يتفق مع الملاحظات المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن قوة الفتح التي تم الحصول عليها من بنية واحدة قد لا تكون دقيقة بسبب تباين حبة إلى حبة في توليد القوة ، والتي تم قياسها لتكون ~ 4٪ لخرز M270 التجاري31. علاوة على ذلك ، نظرا لأن طول الساق (8 bp) قصير ، فإن قوة فتح الحقيقة الأرضية لدبابيس الشعر الأخرى ذات 8 bp ذات تكوين النوكليوتيدات المختلفة قد تختلف كثيرا20. أخيرا ، قمنا بتطبيق HMM على آثار الامتداد لتعيين انتقال الحالة وبالتالي قياس معدلات الانتقال (الشكل 5F ، التتبع الأحمر). اختلفت معدلات فك الضغط وإعادة الضغط بشكل كبير مع القوة المطبقة (الشكل 5J) ، بحيث تعزز القوة فك الضغط وتمنع إعادة الضغط. إذا لزم الأمر ، يمكن للمرء استخدام تعبير Bell الكلاسيكي لاستخراج معلمات مشهد الطاقة (على سبيل المثال ، ارتفاع الحاجز والمسافة)46.

توصيف التذبذب الحراري في قياسات التمديد
باستخدام بنية دبوس الشعر ، قمنا بتعريف الضوضاء المعتمدة على القوة في قياسات التمديد. أولا ، تم حساب التقلبات الحرارية للحبة المربوطة من المعادلات باستخدام المعلمات (على سبيل المثال ، نصف قطر الخرزة ، طول الحبل) المناسبة لهذه التجارب 2,5 (الشكل 5K ، منحنيات صلبة). رسمنا أيضا الانحراف المعياري للامتداد Equation 11 المقاس من الأثر الزمني لبناء دبوس الشعر عند مستويات قوة متميزة. نظرا لأن هذا الجزيء كان له شكل دبوس شعر ، فقد تم استخدام استجابته تحت 4 pN (الحالة المغلقة) لقياس الضوضاء الجوهرية ، في حين تم اكتشاف ديناميكيات دبوس الشعر ~ 6 pN ، كما هو متوقع ، وكانت بمثابة فحص. كما لوحظ قمع التذبذب المعتمد على القوة بعد أن أصبح دبوس الشعر مفتوحا في الغالب (قارن 8 pN مقابل 4 pN). تشير المقارنة مع الحد الحراري إلى أن هناك مجالا للتحسين ، ولكن غالبا ما ترتبط هذه الضوضاء المتبقية بالتذبذب الدوراني للحبة المغناطيسية30 ، وهو أمر عشوائي ويصعب حله. لمزيد من التحليل المنهجي للضوضاء البراونية عبر وقت المراقبة ، يتم استخدام حساب انحراف آلان بشكل متكرر32,33. قمنا بحساب تباين ألان لبيانات دبوس الشعر المعروضة في الشكل 5F ، على غرار قياسات 5 كيلوبايت في الشكل 2C. تظهر النتائج في الشكل 5L أنه في نطاق القوة المتوسطة من 4-8 pN ، حصلنا على 2-3 نانومتر من انحراف آلان عند السرعة القصوى (1.2 كيلو هرتز) ، وانخفضت هذه القيمة إلى أقل من 1 نانومتر لوقت المراقبة (τ) أطول من 0.1 ثانية. ومن المثير للاهتمام ، أن ديناميكيات دبوس الشعر ظهرت حول 5-7 pN ل ~ 0.01 ثانية (الشكل 5L ، أقحم) ، بما يتفق مع قوة الانتقال المقاسة والمعدلات في الشكل 5I ، J.

التغيرات التوافقية لمجمعات SNARE العصبية
ثم استخدمنا معقدات SNARE العصبية كنموذج للبروتين وفحصنا خصائصها الميكانيكية المعتمدة على القوة. على عكس بنية دبوس الشعر ، تم الاحتفاظ بمعقدات SNARE المفردة بين مقبضين dsDNA 510 bp (الشكل 6A). وتجدر الإشارة إلى أن تيرميني من syntaxin-1A و VAMP2 ، بعيدا عن المقابض ، تم تشابكهما بواسطة رابطة ثاني كبريتيد بين بقايا السيستين الاصطناعية لتجنب التمزق وتمكين جولات متعددة من نتف بنية معينة.

قمنا أولا بتطبيق منحدر القوة ، مع زيادة وخفض مستويات القوة (± 1 pN s−1) لتمديد وتخفيف بنية الهدف ، على التوالي. في نظام القوة المنخفضة إلى المتوسطة (0-10 pN) ، تصرف المقبضان بشكل مستقل كبوليمرات WLC ، مما شكل بشكل عام منحنى تمديد القوة الذي لا يمكن تمييزه عن منحنى dsDNA 1 kbp (الشكل 6B ، أسود). ومع ذلك ، عندما تمت زيادة القوة إلى أعلى من 10 pN ، انحرفت قيم الامتداد بشكل ملحوظ عن نموذج WLC ، مما يشير إلى أن مجمع SNARE المضمن أظهر زيادة إضافية في الامتداد. وبشكل أكثر تحديدا ، يمكن تلخيص زيادة الامتداد في ثلاث مراحل متميزة: (أ) زيادة طفيفة وتدريجية في 11-13 نيوتن ، (ب) تقلبات سريعة وأكبر (~ 10 نانومتر) في 14-16 نيوتن ، و (ج) فك الضغط النهائي الذي لا رجعة فيه لحوالي ~ 20 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، عندما تم خفض القوة لتخفيف البناء ، عاد الامتداد إلى منحنى تمديد القوة الأصلي بقوة أقل (<15 نيوتن) أو اتبع منحنى نموذج جديد بامتداد أكبر (الشكل 6 ب ، أزرق). تمت استعادة الامتداد الكلي في النهاية إلى القيم الأدنى (من الأزرق إلى الأسود في الشكل 6B) أقل من 5 pN ويمكن تطبيق نفس دورات منحدر القوة ، والتي أظهرت اتجاها مشابها.

من النموذج الجزيئي للتشكل المعقد SNARE ، يمكننا حساب قيم الامتداد المحتملة للوسيطة المحتملة بدقة (الشكل 6C). علاوة على ذلك ، بافتراض سلوك WLC لعديد الببتيدات غير الملفوفة ، يمكن تقدير الامتدادات كدالة للقوة ، وبالتالي توليد نماذج تمديد القوة الكاملة لمختلف المطابقات (الشكل 6B ، الخطوط المنقطة). بأخذ هذه القيم كمرجع ، قمنا بتفسير التحولات المذكورة أعلاه على النحو التالي 14,23: (أ) التحول التدريجي من حالة السحاب الكامل (FZ) إلى حالة فتح الرابط (LO) في 11-13 pN ، مما يعني فتح مناطق الرابط ل syntaxin-1A و VAMP2 ؛ (ب) الانتقال السريع بين LO والحالة نصف المضغوطة (HZ) ، مما يعني فتح مجمع SNARE حتى الطبقة الأيونية الصفرية ؛ و (ج) الانتقال النهائي إما إلى الحالة غير المضغوطة (UZ) أو الحالة غير المطوية (UF) ، مما يعني تفككا كاملا ل VAMP2 من بقية المجمع. تختلف حالة UZ عن UF في أن الجزيء المرتبط ب SNAP-25 لا يزال مرتبطا ب syntaxin-1A ، مع الحفاظ على مركب ثنائي. في حالة UF (بدون SNAP-25) ، لا يمكن إعادة إنشاء مركب SNARE الكامل إلا بعد إعادة دمج جزيء SNAP-25 الحر من المحلول ، حيث يكون خفض القوة المطبقة للسماح بإعادة الربط هذه أمرا بالغ الأهمية.

للتحقق من التغييرات التوافقية لمجمعات SNARE بطريقة أكثر منهجية ، أجرينا بعد ذلك تجارب قفزة القوة في نظام القوة ، حيث لوحظت تقلبات المطابقة بشكل متكرر عند 14-15 pN (الشكل 6D). عادة ، بدأنا أولا بقياس موضع الخرزة عند 10 pN وتحققنا من الامتداد المستقر ، مما يشير إلى عدم وجود تغييرات متعلقة ب SNARE. بعد ذلك ، تم زيادة مستوى القوة فجأة إلى 14-15 pN ، حيث تم مراقبة الامتداد حتى حدث فك الضغط ، إن وجد. أخيرا ، تم تخفيض القوة مرة أخرى إلى 10 pN للتحقق من أي زيادة مستمرة في الامتداد المرتبط بالتكشف. عند 14 pN ، بقيت آثار الامتداد في الغالب في حالة LO ، مع ارتفاعات عرضية إلى حالة HZ. وتجدر الإشارة إلى أنه من المحتمل أن يتم تفويت هذه الرحلات القصيرة إلى حالة هرتز في تتبع 100 هرتز ، والذي يقوم بمتوسط وخفض عينات صور الخرز بعامل 12. على الرغم من الزيارات الواضحة والمتكررة لحالة HZ ، فشل المجمع في الانتقال الكامل إلى حالة UZ (الشكل 6E) ، مما يشير إلى أن القوة الخارجية لم تكن قوية بما يكفي للتغلب على حاجز الطاقة لفك الضغط. في المقابل ، حتى الزيادة الطفيفة في القوة (إلى 14.3 pN) جعلت الانتقال فعالا للغاية بحيث تم الوصول إلى حالة UZ في الغالب في غضون ثوان قليلة (الشكل 6F). باستمرار ، تم الانتهاء من فك الضغط في الغالب في غضون 1 ثانية عندما طبقنا 14.5 pN على المجمع (الشكل 6G ، H). والجدير بالذكر أن فك الضغط عند قوى أعلى أدى في كثير من الأحيان إلى الكشف الكامل عن المجمع بأكمله (مصحوبا بإزالة SNAP-25) ، كما يتضح من الزيادة الإضافية الصغيرة في الامتداد فوق UZ (الشكل 6H) وتوقيع إعادة الطي الذي لوحظ عند 2 pN (الشكل 6I). بشكل عام ، تظهر هذه البيانات سلوك الرابطة المنزلقة الكلاسيكي47 لتكشف مجمعات SNARE ، بما يتفق مع التقارير السابقة14،23،48.

Figure 1
الشكل 1: إعداد الأداة. تخطيطي (A) وصورة فوتوغرافية (B) لإعداد MT عالي السرعة. توجد مغناطيسات يتم التحكم فيها بواسطة محرك خطي ودوران فوق مرحلة العينة لمجهر مقلوب مزود بعدسة غمر بالزيت 100x وكاميرا CMOS عالية السرعة. يمر شعاع الضوء من الصمام الثنائي فائق الإضاءة عبر المغناطيس ويضيء المجال. أقحم: صور حيود تمثيلية للخرز تقع على مسافات مختلفة من المستوى البؤري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: معايرة القوة. أ: رسم تخطيطي لعينة معايرة القوة. يتم قياس مقادير القوة التي يمارسها زوج من المغناطيسات المضادة للتوازي مع فصل 1 مم كدالة لمسافة المغناطيس d من إزاحة حبة مغناطيسية (M270) مربوطة بجزء dsDNA 5 kbp. (ب) بيانات تمثيلية من إجراء معايرة القوة. تشير الأسهم الملونة إلى المناطق التي يتم توسيعها في (D) (مطابقة الألوان). (ج) انحراف ألان عن الموضع z لحبة مربوطة 5 kbp مقاسة ب 15-20 pN. يتم عرض منحنيات إحداثيات الخرزة المغناطيسية z قبل (الأزرق) وبعد (الأحمر) طرح موضع الخرزة المرجعية. (د) السلاسل الزمنية التمثيلية للموضع y المقاسة عند مسافة المغناطيس المشار إليها d. يظهر الرسم البياني المقابل لتوزيع إحداثيات y على اليمين مع ملاءمة Gaussian (أحمر). (ه) شعبة القطاع الخاص الممثلة من البيانات المبينة في الفقرة (د). يتم إعطاء قيم القوة التي تم الحصول عليها عن طريق تركيب نموذج (أحمر) على PSDs المعنية في الأعلى. (و) معايرة القوة المغناطيسية كدالة لمسافة المغناطيس. تم قياس القوى إما من التباين (يسار) أو من طريقة PSD (يمين). يشير الملاءمة (الأحمر) إلى نموذج أسي مزدوج مع المعادلة المشروحة. (ز) الفرق في القوة المقيسة الناتج عن التباين وPSD. يتم حساب منحنى أحمر للنوبات الموضحة في (F). (ح، ط) التحقق من علاقة تمديد القوة لبنية معايرة 5 كيلو برميل. تم استخدام قيم الامتداد المتوسطة عند مستويات قوة مميزة (مقاسة من التباين) إما مباشرة (H) أو بعد تصحيح إزاحة ارتفاع الخرزة (I) بسبب إمالة حبةخارج المركز 31. تم تركيب بيانات امتداد القوة لجزيئات n = 5 بواسطة نموذج WLC قابل للتوسيع وتم شرح المعلمات المجهزة (طول الثبات Lp ومعامل التمدد Ko) في الأعلى (متوسط ± s.d.). الاختصار: PSD = الكثافة الطيفية للطاقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحضير العينة . (أ) تحضير تركيبات دبوس شعر الحمض النووي 8 bp عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لمنطقة 1 kbp من λ-DNA. (ب) تحضير تركيبات معقدة SNARE بمقبضي DNA 510 bp. أقحم: التحقق من مقابض الحمض النووي وارتباطها بالبروتينات عن طريق الرحلان الكهربائي هلام الأغاروز (2 ٪ هلام). تشير الأسهم إلى تحول التنقل (المرمز بالألوان) لأنواع المنتجات: مقابض مجانية 510 bp (أرجواني) ؛ مقبض B متصل بالتركيب (أحمر) ، إلى مركب ΔN (أخضر) ، ومجمع SNARE (أزرق) ؛ ومجمع SNARE النهائي ذو المقبضين (الأخضر). تؤدي إضافة SDS إلى تعطيل معقدات ΔN (الموجودة في b) ولكن ليس مجمعات SNARE الكاملة التي تشكلها VAMP2 كاملة الطول (موجودة في c). (ج) تصميم خلية تدفق وتصويرها لتجارب الترجمة الآلية. د: رسم تخطيطي للإدخال المتسلسل لمحاليل العينات في قناة خلية سريان. اختصار: MT = ملقط مغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أنواع التجارب التمثيلية. (A-C) مخططات تجارب منحدر القوة ومشبك القوة والقفز بالقوة (أعلى) مع آثار زمنية تمثيلية للامتداد من القياسات المقابلة (وسط). يتم عرض أنواع التحليل التي يمكن إجراؤها في الأسفل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: انتقال الحالتين لدبوس شعر الحمض النووي (DNA) بمقدار 8 bp. (أ) رسم تخطيطي لتجارب MT على دبوس شعر الحمض النووي مع الانتقال المتوقع لفك الضغط وإعادة الضغط. (ب) تتبع تمثيلي لامتداد البناء من تجارب منحدر القوة مع زيادة مستويات القوة (~ 0.25 pN s−1). (ج) إعادة بناء منحنى القوة التمثيلية الممتدة من البيانات الواردة في (ب). تشير المنحنيات الصفراء إلى نماذج WLC لبناء دبوس الشعر مع دبوس الشعر في التشكيل المغلق (الصلب) والمفتوح (المتقطع). (د) تتبع الامتداد التمثيلي من تجارب القوة الثابتة ذات مستويات القوة المتزايدة، ويقاس عند 100 Hz. (ه) الرسوم البيانية لبيانات الامتداد في (د). (و ، ز) نتائج لنفس التجارب في (D) و (E) ولكن مع تتبع 1.2 كيلو هرتز. تم تنعيم السلسلة الزمنية الخام 1.2 كيلو هرتز من خلال تطبيق مرشح متوسط من خمس نقاط. تم الحصول على آثار حمراء في العرض الموسع ل (F) من HMM. تشير الخطوط الحمراء في (G) إلى مواقع السكان الغاوسيين. (ح) المسافة بين المجموعتين في (ز). (I) الاحتمال في الحالة المفتوحة كدالة للقوة المؤثرة. المنحنى الأحمر هو نموذج بولتزمان المجهز (Equation 10 ) مع القوة المتوسطة F1/2 = 5.9 pN. (ي) فك الضغط وإعادة ضغط معدلات الانتقال المقاسة من نتائج HMM. تشير الخطوط الصلبة إلى الاعتماد الأسي على القوة. (ك) التذبذب الحراري في قياسات التمديد. تظهر الانحرافات المعيارية لبيانات تمديد دبوس الشعر (بدون تصفية) كدالة للقوة. تم تقدير حد الدقة الحرارية الذي يمثل الحجم النظري للتقلبات الحرارية من Eq. 9 في عمل Choi et al.2 لحبة 2.8 ميكرومتر مع حبل 1 kbp. (L) انحرافات ألان المحسوبة من بيانات دبوس الشعر 1.2 كيلو هرتز في (F) (بدون تصفية). يظهر الجزء الداخلي انحراف آلان عند 0.01 ثانية كدالة للقوة ، مما يدل على زيادة ونقصان تدريجي في التذبذب بسبب ديناميكيات دبوس الشعر. اختصار: MT = ملقط مغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التغيرات التوافقية لمعقدات SNARE العصبية. (أ) رسم تخطيطي لتجارب MT على معقدات SNARE. (ب) منحنيات تمديد القوة التمثيلية لبناء SNARE. تم الحصول على آثار سوداء وزرقاء (100 هرتز) من فترات التمدد والاسترخاء في تجارب منحدر القوة ، على التوالي. تشير الخطوط المتقطعة إلى نماذج التمديد ، وهو ما يمثل المطابقات المختلفة لمعقدات SNARE الموضحة في (C). (ج) النماذج الجزيئية للمطابقات المعقدة SNARE مع الامتدادات المحسوبة المقابلة. تم تقدير القيم من المعلمات الهندسية للحزم الحلزونية ونموذج WLC لمنطقة عديد الببتيد14. (د) رسم تخطيطي لتجارب القفز بالقوة للتحقيق في المطابقات المعقدة SNARE. (ه-ح) آثار تمديد تمثيلية من تجارب القفز بالقوة التي أجريت عند مستويات القوة المشار إليها. في (ه) ، لم يلاحظ فك الضغط. في (F) و (G) ، لوحظ فك الضغط متبوعا بإعادة الضغط عند 10 pN. في (H) ، أعقب فك الضغط حدث آخر يتكشف. (I) إعادة طي مجمع SNARE عند 2 pN. لوحظ انخفاض واضح في الامتداد من UF إلى حالة FZ عند 5 pN. اختصار: MT = ملقط مغناطيسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعداد PCR شرط
المواد 1.25 ميكروغرام / مل λ-DNA (قالب) ، 1 ميكرومتر بادئات أمامية وخلفية ، 0.2 مللي متر dNTP ، 0.05 وحدة / ميكرولتر nTaq ، 1x nTaq عازلة
تمسخ 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
الصلب بناء المعايرة: 55 °C لمدة 30 ثانية
دبوس شعر الحمض النووي: 57 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
مقابض الحمض النووي: 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية
امتداد دبوس شعر الحمض النووي والمقابض: 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة
بناء المعايرة: 72 °C لمدة 5 دقائق
دور 30–34
الاغاروز هلام الكهربائي
هلام 2٪ أغاروز في 0.5x tris-borate-EDTA (TBE ، درجة الحموضة 8.3) تحتوي على 1x SYBR آمن
تشغيل الطاقة الكاملة (متوسط 108 فولت) على Mupid-2plus (متقدم) ، 40-50 دقيقة

الجدول 1: شروط تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز. معلمات التفاعل ل PCR لتركيبات الحمض النووي ، بما في ذلك 5 kbp dsDNA لمعايرة القوة ، وبناء دبوس شعر الحمض النووي ، ومقابض الحمض النووي لربط SNAREs. يتم إعطاء تسلسلات التمهيدي في جدول المواد.

عازلة لتنقية البروتين تكوين
غسل العازلة أ 50 مللي مول تريس حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) ، 500 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 7 ملليمتر β-ميركابتوإيثانول (BME) ، 10٪ جلسرين ، و 20 مللي مول إيميدازول
غسل العازلة ب 50 مللي مول HEPES (درجة الحموضة 7.2) ، 150 مللي مول كلوريد الصوديوم ، 1 مللي مول TCEP ، 10٪ جلسرين ، و 20 مللي مول إيميدازول
تحلل العازلة Wash Buffer A المكمل ب 1٪ Triton X-100 ، 1 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) ، وكوكتيل مثبط للإنزيم البروتيني 1x
الشطف العازلة غسل عازلة B تستكمل مع 400 mM إيميدازول
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 81 مللي مول فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2 HPO 4) ، 19 مللي متر فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH 2 PO4) (درجة الحموضة7.2) ، 150 مللي متر كلوريد الصوديوم
عازلة الفوسفات 81 مللي مولNa2 HPO 4 ، 19 مللي متر NaH2PO 4 ، درجة الحموضة7.4

الجدول 2: المخازن المؤقتة وتكوينها. تكوين المخازن المؤقتة المستخدمة لتنقية البروتين.

الشكل التكميلي S1: رسم حامل مغناطيسي. يتم عرض أبعاد حامل الأكريليك لمغناطيسين 10 مم × 10 مم × 12 مم مع فجوة 1 مم. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: ملف مضغوط يحتوي على رموز MATLAB. نصوص MATLAB لتحليل البيانات الناتجة عن تجارب الملقط المغناطيسي عالي السرعة ، بما في ذلك معايرة القوة ، ودبوس الشعر ، وتحليل SNARE المعقد. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ملف مضغوط لحزمة برامج LabVIEW. حزمة كاملة من أكواد LabVIEW لتشغيل إعداد ملقط مغناطيسي عالي السرعة والحصول على البيانات معه. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذا العمل ، قدمنا إعداد التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء الذي يمكنه مراقبة التغيرات الهيكلية للجزيئات الحيوية بدقة مكانية زمانية عالية. تكتسب كاميرا CMOS عالية السرعة المستخدمة 1200 إطار s−1 بدقة 1280 × 1024 ، مما يتيح تتبع حبة 1.2 كيلو هرتز. ومع ذلك ، فإن سرعة القياسات محدودة حاليا بواسطة برنامج تتبع الخرز ، لذلك يتم تقليل عائد الاستثمار عادة إلى مناطق أصغر في القياسات عالية السرعة. توفر الطاقة العالية ل SLD إضاءة ساطعة ضرورية للتصوير السريع بالخرز حتى عرض النطاق الترددي بضعة كيلوهرتز. علاوة على ذلك ، فإن التماسك المكاني للحزمة يولد حلقات حيود متحدة المركز عالية التباين حول الخرز (الشكل 1 أ ، أقحم) ، والتي تتيح التحديد الدقيق لموضع الخرزة بناء على التماثل.

يمكن تحديد القوة المغناطيسية التي تمارس على بنية حبل الخرز عن طريق قياس التقلبات البراونية للحبة المربوطة35،37،38. نظرا لأن تحليل القوة في الوقت الفعلي ثقيل الحساب ، يتم قياس القوة المطبقة عادة مسبقا باستخدام بنية مرجعية. على سبيل المثال ، يتم ربط الحبيبات المغناطيسية التي سيتم استخدامها بشظايا dsDNA طويلة (>5 كيلو بايت) ، ويتم قياس التقلبات الحرارية المقابلة في موضع الخرزة كدالة لمسافة المغناطيس (الشكل 2 أ). عادة ما يتم إجراء معايرة القوة مرة واحدة بعد إنشاء الإعداد ، ولكن ليس من الضروري تكرارها بانتظام ما لم يتم تعديل الإعداد ، على سبيل المثال ، عن طريق استبدال المغناطيس. نظرا لأن التردد المميز لتذبذب الخرز يزداد مع القوة المطبقة2 ، فإن الإعداد عالي السرعة مفيد بشكل خاص لالتقاط الديناميكيات السريعة في نظام عالي القوة وقياس القوة بدقة. يعد تقدير القوة من التباين أبسط بكثير في تنفيذه من التحليل الطيفي في مجال التردد ، ولكنه عرضة للقطع الأثرية من الانجراف ، والاستحواذ القائم على الكاميرا ، وتغييرات الامتداد بسبب مرفق حبة خارج المركز31،37،38. ومع ذلك ، فإن النتائج من الطريقتين تختلف بمقدار 0-2 pN فقط إذا تم الحصول عليها بشكل صحيح (الشكل 2G) ؛ لذلك ، فإن طريقة التباين موثوقة بدرجة كافية عندما لا يكون التحديد المطلق للقوة أمرا بالغ الأهمية.

بالنسبة للقوى الأعلى فوق 30 pN وعند حوالي 65 pN (حيث يعمل التمدد الزائد ل dsDNA كمعيار) ، يجب تثبيت مغناطيسات عالية الجودة (N50-N52) متوفرة تجاريا ، أو يجب تقليل الفجوة بين المغناطيسات ، أو يجب هندسة المجال المغناطيسيبشكل أكبر 28,49. في هذا الإعداد ، تبلغ أسرع سرعة للمحرك الرأسي 30 مم / ثانية ، مما يسمح بقفزة القوة من 0 pN إلى 20 pN في ~ 0.6 ثانية. يمكن تفويت بعض التغييرات الهيكلية السريعة المعتمدة على القوة إذا كانت حركة المحرك تحد من معدل تحميل القوة. اعتمادا على التطبيق ، قد يكون من الضروري إجراء تغييرات على الطريقة التي يتم بها نقل المغناطيس وزيادة تحسينها. أحد الأمثلة على ذلك يتضمن الاستخدام الإبداعي لرأس الشريط المغناطيسي15.

بالنسبة للقياسات عالية الدقة باستخدام MTs ، من المهم تقييم مستوى الضوضاء من مصادر مختلفة. بمجرد تكوين المكونات البصرية (مجهر بعدسة عالية التكبير ومصدر ضوء ساطع وكاميرا سريعة) بشكل صحيح ، يمكن تحقيق دقة دون نانومتر في تتبع الخرز. بعد ذلك ، يصبح المصدر الرئيسي للضوضاء هو الحركة البراونية للحبة ، والتي تستخدم لقياس القوة المطبقة. يعتمد التذبذب الحراري للحبة المربوطة على نصف قطرها وطول الحبل والقوة المطبقة. على الرغم من أن التذبذب الجوهري في الاتجاه z (أي تغييرات التمديد) يعتمد فقط على الطاقة الحرارية وصلابة الحبل ، فإن ديناميكيات حبال الخرز ومعدل الاستحواذ القائم على الكاميرا ترشح حركة الخرزة وبالتالي مراقبة الجزيئات الحيوية المستهدفة بدورها. لذلك ، يجب اختيار حجم الخرزة ومعدل أخذ العينات بشكل استراتيجي لتحقيق دقة مكانية زمانية جيدة. كبديل للخرزة 2.8 ميكرومتر التي استخدمناها ، فإن حبات 1 ميكرومتر الأصغر شائعة أيضا ويمكن أن تكون مفيدة للقياسات السريعة بسبب استجابتها السريعة. ومع ذلك ، فإن نقطة الضعف الحرجة هي المحتوى المغناطيسي الصغير ، مما يحد من القوة القصوى التي يمكن توليدها (Equation 12 ). نظرا لأن الخرزات الأصغر لا تزال قادرة على ممارسة قوة تصل إلى 10 pN على الأقل ، فقد تكون مناسبة لدراسة ظواهر القوة الضعيفة ، كما هو الحال في الالتفاف الفائق للحمض النووي. في المقابل ، تتطلب التحقيقات في المحركات الجزيئية أو طي البروتين (على سبيل المثال ، SNAREs ، كما هو موضح هنا) ، أو ميكانيكا الخلية50 تطبيق قوى أعلى ، وفي هذه الحالة يمكن للمرء أن يفكر في تعديل تكوين المغناطيس (على سبيل المثال ، تقليل الفجوة أو المسافة) لتوسيع نطاق القوة المطبقة 28,51.

نظرا لأن هذه التقنية تبحث في الاستجابات الميكانيكية النانوية للجزيئات المستهدفة أثناء تطبيق قوة على النطاق ذي الصلة بالفيزياء الحيوية ، فهي مناسبة بشكل مثالي لدراسة العناصر الحساسة للقوة التي تلعب أدوارا محورية في العمليات الميكانيكية البيولوجية. لتوضيح قابلية التطبيق الواسعة لمقايسة MT عالية الدقة ، استخدمنا كلا من الحمض النووي ونموذج البروتين الذي يظهر تغييرات توافقية ديناميكية وسريعة عند تطبيق قوة مقياس piconewton. أحد قيود هذه التقنية هو متطلبات الأحماض والبروتينات النووية المنقاة ، والتي تثبطت بشكل خاص امتدادها الواسع إلى مجموعة واسعة من البروتينات. سيستمر تقدم تقنيات التعبير والاقتران في البروتين في المختبر في توفير الوصول إلى البروتينات الأقل دراسة. ومن القضايا ذات الصلة أن المعرفة المسبقة بالهيكل المستهدف غالبا ما تكون حاسمة لتجارب التصميم (على سبيل المثال ، ربط المقابض). نتوقع أن ظهور cryo-EM 52 أحادي الجسيم وAlphaFold2 53 سيدعم بقوة تصميم وتحليل القياسات الميكانيكية على جزيئات البروتين المفردة ويطلق العنان لتطبيقات أكثر قوة ل MT عالية الدقة.

تعتمد قوة فك ضغط دبابيس شعر الحمض النووي على العديد من العوامل ، بما في ذلك التسلسل والبنية وتكوين المخزن المؤقت ، ولكن الأكثر أهمية على طول الساق ومحتوى الجوانين والسيتوزين (GC)20. لإثبات قوة التتبع عالي السرعة ، قمنا عمدا بتصميم جذع 8 bp (مع ثلاثة أزواج أساسية GC) كان من المتوقع أن يتكشف بقوة منخفضة مع ديناميكيات سريعة. في الواقع ، تظهر النتائج في الشكل 5 أنه كان من الصعب حل مثل هذه الديناميكيات السريعة باستخدام التقنيات القياسية التي تتميز بدقة 10 مللي ثانية أو أقل. يتم تأكيد هذا الجانب بشكل أكبر من خلال معدلات الانتقال المقاسة من تحليل HMM ، والتي تراوحت معدلاتها العالية بين 100 و 200 s−1 (الشكل 5J).

يعتقد أن SNAREs العصبية تدفع الحويصلة المشبكية إلى الإخراج الخلوي للحويصلة المشبكية. على وجه الخصوص ، تحفز بروتينات SNARE اندماج الغشاء عن طريق خفض حاجز الطاقة المرتبط ، مثل التنافر الكهروستاتيكي بين الحويصلة وأغشية البلازما. وفقا لذلك ، تم العثور على تقلبات مطابقة لمجمعات SNARE تحدث في نطاق قوة ضيق من 12-15 pN ، وهو ما يتوافق مع المستوى المتوقع لقوى التنافر14,23. باستخدام MTs عالي السرعة الموصوف هنا ، قمنا بتلخيص النتائج الرئيسية حول السلوك المعتمد على القوة لمجمعات SNARE العصبية. يشير تباطؤ القوة في فك الضغط وإعادة الضغط (الشكل 6 ب) إلى أن إعادة الضغط تحدث بقوة أقل من فك الضغط ، وبالتالي يتم العمل خلال هذه الدورة. يتم التعامل مع مثل هذه التحولات غير المتوازنة بشكل أفضل من خلال تجارب القفز بالقوة ، حيث يمكن قياس زمن الانتقال للانتقال تحت الحمل (على غرار حدث تمزق الرابطة) أو التقلبات التوافقية قبل فك الضغط. تستفيد كلتا الحالتين من الإعدادات عالية السرعة ، كما هو موضح في الدراسات الحديثة حول الحالات العابرة للجزيئات الحيوية ومجمعاتها15،17،54،55،56.

بشكل جماعي ، تتفق هذه النتائج مع التغييرات المميزة المعتمدة على القوة لدبابيس شعر الحمض النووي ومجمعات SNARE العصبية التي تم الإبلاغ عنها باستخدام التحليل الطيفي التقليدي للقوة أحادية الجزيئ. في الوقت نفسه ، يؤكدون على فائدة القياسات الميكانيكية عالية الدقة للكشف عن حساسية قوة الجزيئات الحيوية وتجميعاتها. نأمل أن تجذب هذه المقالة المزيد من الأشخاص من مجال علم الأحياء الميكانيكي ، مما يحفز الباحثين على استخدام MTs عالية السرعة في التحقيق في أنظمة اهتمامهم الفريدة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منحة المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) الممولة من الحكومة الكورية (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176 و NRF-2021R1A4A1031754 و NRF- 2021R1A6A1A10042944). تم دعم S.-H.R. من خلال منحة NRF (2021R1C1C2009717).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

هذا الشهر في JoVE ، العدد 195 ، ملاقط مغناطيسية عالية السرعة ، مطيافية قوة أحادية الجزيء ، دبوس شعر الحمض النووي ، مجمع SNARE
ملاقط مغناطيسية عالية السرعة للقياسات الميكانيكية النانوية على العناصر الحساسة للقوة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter