Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/65137
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2,3, 2,3, 1,4
1Department of Physics, Pohang University of Science and Technology (POSTECH), 2School of Biological Sciences, Seoul National University, 3Institute for Molecular Biology and Genetics, Seoul National University, 4School of Interdisciplinary Bioscience and Bioengineering, Pohang University of Science and Technology (POSTECH)
* These authors contributed equally

Summary

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Abstract

Tek moleküllü manyetik cımbızlar (MT'ler), nükleik asitler ve proteinler gibi biyomolekülleri zorla sorgulamak için güçlü araçlar olarak hizmet etmiştir ve bu nedenle mekanobiyoloji alanında yararlı olmaya hazırdır. Yöntem genellikle manyetik boncukların görüntü tabanlı izlenmesine dayandığından, görüntülerin kaydedilmesi ve analiz edilmesindeki hız sınırının yanı sıra boncukların termal dalgalanmaları, hedef moleküllerdeki küçük ve hızlı yapısal değişiklikleri gözlemlemede uygulanmasını uzun zamandır engellemiştir. Bu makalede, biyomoleküllerin ve komplekslerinin nano ölçekli, milisaniyelik dinamiklerini çözebilen yüksek çözünürlüklü bir MT kurulumunun yapımı ve işletilmesi için ayrıntılı yöntemler açıklanmaktadır. Uygulama örnekleri olarak, DNA saç tokaları ve SNARE kompleksleri (membran-füzyon makineleri) ile yapılan deneyler, geçici durumlarının ve geçişlerinin pikonewton ölçekli kuvvetlerin varlığında nasıl tespit edilebileceğine odaklanarak gösterilmiştir. Yüksek hızlı MT'lerin, hücrelerdeki kuvvetleri algılayan, ileten ve üreten moleküller üzerinde yüksek hassasiyetli nanomekanik ölçümler yapmaya devam edeceğini ve böylece moleküler düzeyde mekanobiyoloji anlayışımızı derinleştireceğini umuyoruz.

Introduction

Hücreler mekanik uyaranları aktif olarak algılar ve bunlara yanıt verir. Bunu yaparken, birçok biyomolekül dinamik yapısal değişiklikleri mümkün kılan kuvvete bağımlı özellikler gösterir. İyi takdir edilen örnekler arasında, hücrelere çevrelerinden önemli mekanik bilgiler sağlayan mekanosensitivite iyon kanalları ve sitoiskelet elemanları bulunur.

Ek olarak, benzersiz bir kuvvet taşıyan nitelik gösteren moleküller, daha geniş anlamda mekanosensitif olarak da kabul edilebilir. Örneğin, nükleik asit dublekslerinin lokal oluşumu ve erimesi, ayrıca G-dörtlüleri gibi daha yüksek dereceli yapılar, replikasyon, transkripsiyon, rekombinasyon ve daha yakın zamanda genom düzenlemede çok önemli roller oynamaktadır. Dahası, sinaptik iletişimde yer alan bazı nöronal proteinler, tipik moleküller arası etkileşimlerin seviyelerini aşan fiziksel kuvvetler üreterek işlevlerini yerine getirirler. Hangi örnek üzerinde çalışılırsa çalışılsın, ilgili biyomoleküllerin nanomekaniğini yüksek uzaysal zamansal hassasiyetle araştırmak, ilişkili mekanobiyolojik süreçlerin moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmada oldukça yararlı olacaktır 1,2,3.

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi yöntemleri, biyomoleküllerin mekanik özelliklerini incelemek için güçlü araçlar olarak hizmet etmiştir 2,4,5,6. Nükleik asit ve proteinlerdeki yapısal değişiklikleri kuvvet uygulamasıyla eşzamanlı olarak izleyebilir, böylece kuvvete bağlı özellikleri inceleyebilirler. İyi bilinen iki kurulum, moleküllerimanipüle etmek için mikron boyutunda boncuklar kullanan optik cımbız ve manyetik cımbızdır (MT'ler), 5,6,7,8 moleküllerini manipüle eder. Bu platformlarda, polistiren (optik cımbız için) veya manyetik boncuklar (MT'ler için), tipik olarak çift sarmallı DNA'nın (dsDNA) kısa parçalarından yapılmış moleküler "tutamaklar" aracılığıyla hedef moleküllere (örneğin, nükleik asitler ve proteinler) bağlanır. Boncuklar daha sonra kuvvet uygulamak için hareket ettirilir ve hedef moleküllerdeki yapısal değişiklikleri bildiren konumlarını izlemek için görüntülenir. Optik ve manyetik cımbızlar uygulamalarında büyük ölçüde birbirinin yerine geçebilir, ancak kuvveti kontrol etme yaklaşımlarında önemli farklılıklar vardır. Optik cımbızlar, boncukları pozisyonda tutan doğal olarak pozisyon kelepçeli aletlerdir, çünkü bir hedef yapı şekil değişikliklerine uğradığında uygulanan kuvvet dalgalanır; Açılma gibi uzatma artışı, bağlantıyı gevşetir ve gerginliği azaltır ve bunun tersi de geçerlidir. Optik cımbızdaki kuvveti kontrol etmek için aktif geri bildirim uygulanabilse de, MT'ler aksine, doğal olarak çevresel bozulmaya da dayanabilen kalıcı mıknatısların kararlı, uzak alan manyetik kuvvetlerinden yararlanan bir kuvvet kelepçeleme cihazı olarak çalışır.

Uzun geçmişlerine ve basit tasarımlarına rağmen, MT'ler, büyük ölçüde hızlı boncuk izlemedeki teknik zorluklar nedeniyle, yüksek hassasiyetli ölçümlere uygulamalarında optik cımbızların gerisinde kalmıştır. Bununla birlikte, son zamanlarda, birkaç grup MT enstrümanları için hem donanım hem de yazılımın çok yönlü bir şekilde geliştirilmesine öncülük etmiştir 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Bu çalışmada, 1.2 kHz'de çalışan böyle bir kurulumun bir örneğini tanıtıyoruz ve kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde nanomekanik ölçümler yapmak için nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. Model sistemler olarak, DNA saç tokalarını ve nöronal SNARE komplekslerini kullanıyoruz ve pikonewton rejimindeki hızlı, yapısal değişikliklerini inceliyoruz. DNA saç tokaları, iyi tanımlanmış bir kuvvet aralığı20,21'de basit iki durumlu geçişler sergiler ve bu nedenle cımbız kurulumunun performansını doğrulamak için oyuncak modeller olarak hizmet eder. SNARE proteinleri, membran füzyonu22'yi yönlendiren kuvvete duyarlı bir kompleks halinde bir araya geldikçe, tek moleküllü kuvvet spektroskopisi 14,23,24,25 ile de kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Verileri analiz etmek ve termodinamik ve kinetik hakkında yararlı bilgiler çıkarmak için standart yaklaşımlar sunulmaktadır. Bu makalenin, mekanobiyolojik çalışmalarda yüksek hassasiyetli MT'lerin benimsenmesini kolaylaştırabileceğini ve okuyucuları kendi kuvvete duyarlı ilgi sistemlerini keşfetmeye motive edebileceğini umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu protokolde açıklanan tüm malzeme ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Aşağıda açıklanan yüksek hızlı MT kurulumunu çalıştırmak için LabVIEW yazılımı ve örnek verileri analiz etmek için MATLAB betikleri GitHub'da (https://github.com/ShonLab/Magnetic-Tweezers) depolanır ve genel kullanıma sunulur.

1. Aparat yapımı

NOT: Yüksek hızlı MT yapısının genel prensibi, yüksek hızlı tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kamera ve yüksek güçlü, tutarlı bir ışık kaynağının kullanılması dışında, standart, geleneksel MT sistemlerine benzerdir (Şekil 1). Standart MT cihazlarının daha fazla açıklaması için diğer kaynaklara bakın 5,26,27.

  1. Titreşim önleyici optik masaya ters çevrilmiş bir mikroskop kurun. Yüksek hızlı bir CMOS kamera ve bir çerçeve tutucu takın.
  2. Mıknatısları 3D olarak manipüle etmek için bir çeviri aşaması oluşturun. Motorlu bir lineer sahneyi (>20 mm hareket) manuel bir XY aşamasının üzerine dikey olarak monte edin.
    NOT: Dikey hareket kuvveti kontrol ederken, XY aşaması kurulumun ilk yapımı için mıknatısların optik eksene manuel olarak hizalanması içindir.
  3. Mıknatısları döndürmek için bir döner step motor ve bir kayış ve kasnak sistemi takın.
    NOT: Kayış, motor mili ile birbirinden birkaç santimetre uzaklıktaki mıknatıslar arasındaki döner hareketi iletir. Mıknatısların dönüşü, translasyonel manipülasyonun içindedir.
  4. Mıknatısları monte edin. İki özdeş mıknatısı paralel olarak sıkıca barındırabilen, mıknatıslar arasında iyi tanımlanmış 1 mm'lik bir boşluk bulunan bir akrilik tutucu kullanın (Şekil 1B). Belirli bir mıknatıs çifti ile elde edilebilecek maksimum kuvveti kullanmak için, çeviri aşamasının dikey konumunu, mıknatısların alt yüzeyi en düşük konuma taşındığında örnek düzlemle hizalanacak şekilde ayarlayın.
    NOT: Mıknatıslar28'in tutucu tasarımı ve konfigürasyonu hakkında daha fazla bilgi için Lipfert ve ark.'ya bakınız. Mıknatısların yüksekliği ve yönü, veri toplama ile birlikte LabVIEW yazılımı tarafından kontrol edilir.
  5. Düşük büyütmeli objektif lensle görüntüleme yaparak, mıknatısları görüş alanının merkezine hizalayın. Mıknatısların döndürülmesinin, mıknatıs çiftinin merkezinin büyük bir yer değiştirmesine neden olmadığını kontrol edin.
    NOT: Mıknatıslar arasındaki orta nokta dönme ekseni etrafında dönerse, kusurlu bir tutucu nedeniyle mıknatısların merkezden uzak olması muhtemeldir. Mıknatıs dönüşü sadece bağları kontrol etmek ve belirli uygulamalarda tork uygulamak için olduğundan, boşluk boyutuna göre küçük bir yanlış hizalama seviyesi tolere edilebilir.
  6. Boncukların aydınlatılması için bir süper lüminesan diyot (SLD) takın. Kirişi iki mıknatıs arasındaki 1 mm'lik boşluktan geçirin. Kirişin boşluğa sığacak şekilde düzgün bir şekilde harmanlandığından ve aydınlatmanın mıknatıslar tarafından gölgelenmediğinden emin olun.
  7. Burun parçasına bir piezo lens tarayıcı takın ve boncuk izleme için 100x yağa daldırma objektif lens (sayısal diyafram [NA]: 1.45) takın. İzleme sonuçlarında olası yapıları önlemek için, mıknatıslar hareket ettirildiğinde aydınlatmanın eşit şekilde korunduğundan emin olun. Son olarak, pikselleri doyurmadan ışık seviyesini maksimum parlaklığa ayarlayın.
    NOT: Boncukların yüksek hızlı takibi için farklı ışık kaynaklarının karşılaştırılması için, Dulin ve ark.29'a bakınız.

2. Manyetik kuvvetin kalibrasyonu

  1. Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak (PCR; bakınız Tablo 1), bir ucunda biyotin (yüzey bağlantısı için) ve diğer ucunda azid (boncuk bağlantısı için) ile etiketlenmiş 5 kbp dsDNA fragmanları (Primer B, Primer Z_5k ve λ-DNA kullanarak) hazırlayın.
  2. Bölüm 6'yı takiben, 5 kbp molekülleri ile bir akış hücresi hazırlayın.
  3. Bölüm 7'yi takiben, uzantısını ve dönüşünü doğrulayarak iyi bir boncuk bağı yapısını tanımlayın. Özellikle, merkezsiz bağlantı 30,31 nedeniyle boncuk yüksekliği ofsetini en aza indirmek için minimum dönme yörüngesine sahip (yani, yarıçap <200 nm) bir boncuk seçtiğinizden emin olun. İyi bir tether tanımlandıktan sonra, bölüm 9'a atıfta bulunarak boncuk izlemeye başlayın.
  4. Kurulum yeniyse, güvenilir yüksek çözünürlüklü ölçümler için gürültüsünü ve kararlılığını karakterize edin. Mıknatısı akış hücresi yüzeyinden ~3 mm uzağa yerleştirin (>10 pN uygulamak ve bir boncuğun Brownian hareketini bastırmak için), boncuğun z-konumunu 1,2 kHz'de izleyin ve z-koordinat zaman serisi32,33'ten Allan sapmasını (AD) hesaplayın (Şekil 2C). Birkaç nanometrenin AD değerlerinin yüksek hızlı rejimde (<0.1 s) elde edilebildiğini ve diferansiyel izlemenin (referans boncuğa göre manyetik boncuk konumu) AD'yi daha uzun zaman ölçeğinde azalttığını kontrol edin.
    NOT: Genellikle maksimum hızda (1,2 kHz veya 0,83 ms çözünürlük) <3 nm'lik bir AD elde ederiz ve AD en az 10 sn'ye kadar azalmaya devam eder, bu da minimum sapma anlamına gelir. Diğerleri benzer kurulumlarda benzer değerler bildirmiştir 9,10,11,12,34.
  5. Dinlenme konumundaki mıknatıslarla (F ~ 0 pN), bağlı boncuğun x ve y koordinatlarını 1,2 kHz'de kaydedin. Brownian hareketinin yeterince örneklenmesi için pozisyonu yeterince uzun bir süre (yani, dalgalanma35'in karakteristik gevşeme süresinden yeterince uzun) kaydedin.
    NOT: Burada, x yönü manyetik alanın yönü boyuncadır, oysa y'deki hareket alana dik olan enine hareketi temsil eder.
  6. Mıknatısları akış hücresine yaklaştırın ve mıknatıslar akış hücresinin üst kısmına hafifçe dokunana kadar boncuk pozisyonu ölçümlerini tekrarlayın. Mıknatıslar numune düzleminden 7 mm'den daha uzaktayken (uygulanan kuvvet mıknatısların uzak alanında yavaşça arttığından) büyük adımlarla (örneğin, 1-2 mm) hareket edin, ancak daha yüksek kuvvet seviyelerinde daha ince kalibrasyon için yaklaştıkça adım boyutunu kademeli olarak azaltın (örneğin, 0,1-0,5 mm).
  7. İki alternatif yöntemden birini kullanarak her mıknatıs konumundaki kuvveti hesaplayın, d) (her iki yöntemi de içeren bir MATLAB betiği "force calibration.m" sağlanır; Ek Dosya 1'e bakınız).
    1. Boncuğun y-koordinatlarınınEquation 1 varyansını (Şekil 2D) ve boncuğun ortalama z-konumunuEquation 2 en düşük konuma göre ölçün (Şekil 2B, alt). Ardından, kuvveti tahmin etmek için (1)7,27,36 denklemini kullanın (sabit boncuk yarıçapı R = 1,400 nm ve termal enerji kR T = 4,11 pN∙nm ile):
      Equation 3(1)
    2. Alternatif olarak, y koordinatlarının güç spektral yoğunluğunu (PSD) hesaplayın, Sy (Şekil 2E). Denklemi (2) kullanarak ölçülen Sy'ye bir çift-Lorentzian model37 takarak uygulanan kuvvet F'yi belirleyin.
      Equation 4(2)
      Burada, R boncuk yarıçapıdır, γ yve γφ sırasıyla translasyonel ve rotasyonel sürükleme katsayılarıdır (Stokes-Einstein denkleminden tahmin edilmiştir), kRT termal enerjidir, Equation 5f + ve f - denklem kullanılarak elde edilen iki karakteristik frekanstır (3).
      Equation 6 (3)
      NOT: Tether uzantısı L, iyi kurulmuş solucan benzeri zincir (WLC) modelini izleyen bir kuvvet fonksiyonu olduğundan, yukarıdaki ifadeler F'yi tek uygun parametre olarak bırakır (R'yi basitlik için 1.400 nm olarak sabitleriz, çünkü tüm kuvvet seviyelerinde paylaşılır ve kesin değer sonuçları önemli ölçüde etkilemez). Gerektiğinde, kamera tabanlı görüntü alımından kaynaklanan hareket bulanıklığı ve örtüşme38,39 olarak düşünülmelidir, ancak bu etki, 5 kbp bağlamalarla 1 kHz'in üzerindeki yüksek hızlı ölçümlerimizde ihmal edilebilir.
  8. Birkaç yapı daha için 2.4-2.7 arasındaki adımları yineleyin. Manyetik boncuklar arasındaki kuvvet değişkenliğinin ortalamasını almak için üç ila beş farklı boncuğu araştırın.
    NOT: Ortalama için uygun yapı sayısını belirlemek için kullanılan manyetik boncuklar arasındaki kuvvet değişimi dikkate alınmalıdır. Bu değişkenlik küçüktür, ancak ticari ürünler için bile ölçülen kuvvette 1 pN'den fazla hataya yol açabilir31. İlgili kuvvetlerin mutlak olarak belirlenmesinin çok önemli olmadığı çoğu uygulama için, üç ila beş boncuğun kalibrasyon sonuçlarının ortalamasının alınması genellikle yeterlidir. Bu varyasyonu açıklamak için alternatif bir yaklaşım, deneyin başlangıcında kuvveti bireysel bağlarla ölçmektir, bu da zaman alıcı olabilir. Diğer bir seçenek, her yapı31'de bilinen kuvvet seviyelerinde açılan saç tokası yapılarını gömmektir.
  9. Ölçülen kuvveti mıknatıs mesafesinin bir fonksiyonu olarak çizin ve denklemi (4) kullanarak verilere çift üstel bir fonksiyon sığdırın (Şekil 2F).
    Equation 7(4)
    Burada, F0 (taban çizgisi), A 1 ve A2 (genlikler) ve d 1 ve d 2 (bozunma sabitleri) uygun parametrelerdir. İki yöntemden gelen kuvvet değerlerinin ve bunun sonucunda ortaya çıkan çift üstel uyumların büyük ölçüde aynı fikirde olduğundan emin olun (Şekil 2F, G).
    NOT: Kuvvet kalibrasyonunun düzgün bir şekilde yapıldığını doğrulamak için, ölçülen kuvvete karşı uzantıyı çizerek problanan yapıların kuvvet-uzatma ilişkisini doğrulayın.
  10. Manyetik boncukların30,31 kuvvete bağlı eğilmesindenkaynaklanan boncuk yüksekliği ofseti z'yi düzeltmek için, denklemi (5) kullanarak boncuk yarıçapına sahip merkezsiz bir bağlantının geometrisini göz önünde bulundurarak, yanal ofset xkapalıdan z'yi tahmin edin ve değerleri ölçülen uzatma değerlerine uygulayın. Bu adım, "force calibration.m" (satır 252-254) MATLAB betiğinde uygulanır.
    Equation 8(5)
    NOT: Bu düzeltme, özellikle küçük bir dönme yarıçapına (<200 nm) sahip boncuklar için uzantıda küçük değişiklikler yapsa da, bu ofset genellikle Şekil 2H'den Şekil 2I 30,31'e yapılan değişiklikte görüldüğü gibi elastik yanıtı kritik olarak etkiler.
  11. Denklemi (6) kullanarak verilere genişletilebilir bir WLC modeli takarak L p kalıcılık uzunluğunu kontrol edin.
    Equation 9(6)
    Burada, L 0 kontur uzunluğudur (5 kbp için 1.7 μm) ve K0 entalpik germe modülüdür.
    NOT: Her ne kadar dsDNA'nın L p'sinin fosfat tamponlu salin (PBS) gibi tipik bir tamponda 40-50 nm olduğu kabul edilse de, kısa moleküllere (<5 kbp) uygulanan WLC formülü, L0 31,40'ı azalttığı için Lp'yi sistematik olarak hafife almaktadır. Bunun nedeni, klasik WLC modelinin, zincir uzunluğu kalıcılık uzunluğundan yeterince uzun olan bir polimeri varsaymasıdır. Burada, 5 kbp yapısı için Lp = 40 ± 3 nm elde ettik (Şekil 2H) ve uzatma düzeltmesi ayrıca 1.100 ± 200 pN'lik homojen bir K0 verdi (Şekil 2I). Sonlu bir WLC modeli 31,40'ın yanı sıra uzatma dağılımı 41'de Gaussiyanlık olmayan bir düzeltme uygulanması, Lp'yi biraz artıracaktır.
  12. Kuvvet kalibrasyonu doğrulandıktan sonra, çift üstel modelin elde edilen uydurma parametrelerini sağlanan LabVIEW yazılımına (Ek Dosya 2) uygulayın ve yazılımın mevcut kuvveti motor okumalarından (yani mıknatıs konumu) gerçek zamanlı olarak hesaplamasını bekleyin. d(F) ters fonksiyonu için analitik bir ifade mevcut olmadığından, d hedef kuvvet düzeylerinin sayısal tahminini yaparak 0,1 pN adımlarında d'ye karşı F'nin bir arama tablosunu hazırlayın. Kuvvet kontrolünü komuta etmek için bu tabloyu yazılımda da saklayın.

3. DNA saç tokalarının sentezi

NOT: MT deneyleri için DNA saç tokası yapıları, λ-DNA'daki 510 bp'lik bir bölgenin PCR amplifikasyonu ile iki özel primer ile hazırlanır, bunlardan biri 5'-ucunda bir saç tokası yapısı içerir (Şekil 3A). Bu sayede PCR ürününün bir ucuna saç tokası motifi yerleştirilmiş olur.

  1. Astarları hazırlayın.
    1. İleri astar: Cam yüzey bağlantısı için 5′-biotin etiketli ve λ-DNA'ya bağlanan astar B_hp. Bu astar, λ-bağlama bölgesine 5′ 8 bp saplı ve 6 nt ilmekli bir saç tokası motifi içerir.
    2. Ters astar: Manyetik boncuk bağlantısı için 5′-azid etiketli olan ve ileri astardan 1 kbp uzakta λ-DNA'ya bağlanan astar Z_hp.
  2. PCR'yi λ-DNA (şablon), nTaq polimeraz ve standart PCR koşullarıyla ayarlayın ve çalıştırın (bkz. Tablo 1). Ürünü ticari bir arıtma kiti ile temizleyin.
  3. DNA konsantrasyonunu 260 nm'de (A260) UV absorpsiyonu ile ölçün ve ürün boyutunu doğrulamak için agaroz jeli elektroforezi (% 2 jel) uygulayın (bakınız Tablo 2). Tipik bir verim ~ 35 μL ~ 600 nM çözeltidir.

4. SNARE proteinlerinin hazırlanması

NOT: Nöronal SNARE kompleksleri, E. coli'den eksprese edilen üç saflaştırılmış sıçan proteininin birleştirilmesiyle birleştirilir: VAMP2 / synaptobrevin-2, syntaxin-1A ve SNAP-25 (Şekil 3B). Montajlarını kolaylaştırmak için, sözdizimi ve SNAP-25, bir VAMP2 parçası (N-terminal bölgesinden yoksun; "ΔN-VAMP2" olarak adlandırılır) ile "ΔN-kompleksi" adı verilen bir yapıya birlikte ifade edilir ve daha sonra tam kompleksler oluşturmak için DNA kolu bağlantısından sonra tam uzunlukta VAMP2 ile karıştırılır.

  1. SNARE proteinlerinin ekspresyonu için cDNA içeren plazmidler hazırlayın (tüm plazmidler için DNA dizileri Malzeme Tablosunda verilmiştir).
    1. Transmembran etki alanından yoksun 6×His-etiketli VAMP2'yi hazırlayın (2-97; Disülfür bağlantıları için L32C/I97C) bir pET28a vektörüne klonlanmıştır.
    2. Habc ve transmembran alanından (191-267, disülfit bağları için I202C / I266C ikameleri) yoksun olan sözdizimi-1A'yı, 6×His-etiketli ΔN-VAMP2 (49-96) ile birlikte klonlanmış bir pETDuet-1 vektörüne hazırlayın.
    3. Tam uzunluktaki SNAP-25 izoform b'yi (2-206, tüm C'den A'ya) bir pET28a vektörüne klonlanmış olarak hazırlayın. Bu, ΔN komplekslerini hazırlamak için kullanılacaktır.
    4. SNARE komplekslerini açıldıktan sonra yeniden birleştirmek üzere MT tahlil tamponuna doğrudan eklenmek üzere bir pET28a vektörüne klonlanmış 6×His-etiketli tam uzunlukta SNAP-25 izoform b'yi (1-206, tüm C'den A'ya) hazırlayın.
  2. Rosetta (DE3) E. coli hücrelerinin iki tüpünü hazırlayın. ΔN kompleksini ifade etmek için bir grubu VAMP2 plazmidleriyle (adım 4.1.1'den), biri hem sözdizimi-1A/ΔN-VAMP2 hem de etiketsiz SNAP-25 plazmidleriyle (adım 4.1.2 ve 4.1.3'ten) ve diğeri His etiketli SNAP-25 plazmidleriyle (adım 4.1.4'ten) dönüştürün.
  3. Dönüştürülmüş hücreleri uygun antibiyotiklerle Luria-Bertani suyuna (LB) aktarın (burada, VAMP2 için kanamisin ve kloramfenikol ve His-etiketli SNAP-25; kanamisin, kloramfenikol ve ΔN kompleksi için ampisilin). Et suyunun optik yoğunluğu (OD) 0.7-0.9'a ulaşana kadar onları bir sallama inkübatöründe (220 rpm) 37 ° C'de büyütün.
  4. Protein ekspresyonunu indüklemek için 1 mM izopropil β-d-1-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 3-4 saat boyunca çalkalayan bir inkübatörde (220 rpm) inkübe edin.
  5. Kültürü 4.500 × g'da 4 ° C'de 15 dakika boyunca santrifüj ederek hücreleri pelet haline getirin.
  6. Protein saflaştırma için tamponlar hazırlayın (bakınız Tablo 2).
  7. SNARE eksprese eden hücre peletlerini 40 mL buz gibi soğuk lizis tamponunda askıya alın ve hücreleri buz üzerinde sonikasyonla lize edin (% 15 genlik, 5 s açık ve 5 s kapalı, toplam 30 dakika).
  8. Çözünmeyen malzemeleri gidermek için lizatı 15.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin.
  9. Süpernatantı 1 mL Ni-NTA reçinesi ile doldurulmuş bir yerçekimi sütunundan geçirin. Reçineyi yıkama tamponu A, ardından yıkama tamponu B ile yıkayın ve proteinleri 10 mL elüsyon tamponu ile boşaltın.
  10. Bir tuzdan arındırma sütunu kullanarak tris (2-karboksiyetil) fosfin (TCEP) ve imidazolün elüentten çıkarılması (üreticinin talimatlarını izleyin). PBS ile numuneyi boşaltın.
  11. Proteinleri PBS'de tutarken (tipik olarak 2 mL üreten) proteinleri santrifüj filtrelerle (10 kDa kesme) ~ 70 μM'ye kadar konsantre edin. Protein konsantrasyonunu 280 nm'de (A280) ultraviyole (UV) absorpsiyonu veya Bradford testi ile ölçün.
  12. Küçük alikotlar hazırlayın, sıvı azotta flaş dondurun ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Tam SNARE kompleksleri, ΔN kompleksini bir DNA tutamağı üzerinde konjuge ettikten sonra birleştirilecektir (aşağıya bakınız).

5. DNA tutamaçlarının bağlanması

NOT: Bir ucunda primer amin grupları içeren iki adet 510 bp dsDNA tutamacı önce PCR ile hazırlanır ve amin grupları daha sonra iki işlevli bir çapraz bağlayıcı olan SM (PEG)2 kullanılarak maleimid gruplarına dönüştürülür. İki tutamak daha sonra bölgeye özgü konjugasyon için sistein grupları aracılığıyla SNARE komplekslerine kovalent olarak bağlanır (Şekil 3B).

  1. Astarları hazırlayın.
    1. İleriye doğru astarları hazırlayın: Cam yüzey bağlantısı için 5′-biotin etiketli olan ve λ-DNA'ya bağlanan Astar B (Sap B'yi yükseltmek için); Primer Z (Handle Z'yi yükseltmek için), manyetik boncuk bağlantısı için 5'-azid etiketlidir ve Primer B ile aynı sıraya sahiptir.
    2. Bir ters astar hazırlayın: Primer N (Handle B ve Handle Z için paylaşılan), protein konjugasyonu için 5′-amin etiketlidir ve ileri astardan uzakta λ-DNA 510 bp'ye bağlanır.
  2. λ-DNA (şablon), nTaq polimeraz ve standart PCR koşulları ile iki set PCR reaksiyonu (her tutamak için 200 μL reaksiyonun 18 tüpü) ayarlayın ve çalıştırın (bkz. Tablo 1). Ürünü bir PCR temizleme kiti ile temizleyin ve her bir kolu 45 μL ultra saf su ile temizleyin. Sonraki adımlarda etkili bir reaksiyon için yüksek konsantrasyonlarda tutamak elde etmek için minimum miktarda su kullanın.
  3. DNA konsantrasyonunu A260 ile ölçün. Tipik verim, her sap için ~650 μL ~2 μM çözeltidir. Agaroz jeli elektroforezinde daha sonra doğrulamak için küçük numuneleri ayrı tutun.
  4. Her tutamağı (PBS'de 1 μM) 5 mM SM(PEG)2 ile reaksiyona sokun. Nazik rotasyonla oda sıcaklığında inkübe edin. 1 saat sonra, reaksiyona girmemiş SM (PEG)2'yi çıkarmak için bir DNA saflaştırma kiti kullanın. ~2 μM çözeltileri elde etmek için her bir kolu 250 μL PBS ile aşın.
  5. PBS'de B sapı ve ΔN kompleksi çözeltilerini 1:16 molar oranında (örneğin, 1 μM Sap B ve 16 μM ΔN kompleksi) karıştırın ve oda sıcaklığında ajitasyonla 2 saat inkübe edin. Agaroz jeli elektroforezi için küçük bir örneği ayrı tutun.
  6. Önceki adımda kullanılan ΔN kompleksi üzerine 2,5 kat azı dişi fazlalığına bir VAMP2 çözeltisi ekleyin. Karışımı oda sıcaklığında ajitasyonla 1 saat daha inkübe edin. Tam SNARE kompleksleri bu adımda monte edilir.
  7. Taze PBS ve santrifüj filtre (100 kDa kesme) ile tampon değişimi yoluyla serbest proteinleri çıkarın: 4 ° C'de 5 dakika boyunca 14.000 × g'da santrifüj, en az 6x tekrarlayın ve son dönüş için 15 dakika çalıştırın. Serbest proteinlerin uzaklaştırılmasını izlemek için A260 / A280 oranındaki artışı ölçün. Agaroz jeli elektroforezi için küçük bir örneği ayrı tutun.
  8. Çözeltiye Sap Z'yi Sap B'nin üzerinde 15 kat azı dişi fazlalığında ekleyin. reaksiyonu kolaylaştırmak için Z Sapının konsantrasyonunu en az 1 μM'nin üzerinde tutun. Karışımı gece boyunca 4 ° C'de çalkalama ile inkübe edin.
  9. Ara ürünleri (Handle B ve protein konjugatları) ve nihai ürünü (iki kulplu SNARE kompleksi) agaroz jel elektroforezi (Şekil 3B, iç kısım) ile doğrulayın (bakınız Tablo 2).
    NOT: Proteinler Sap B'ye başarıyla bağlanırsa, bir hareketlilik kayması tespit edilecektir. Özellikle, DNA saplarında tam SNARE komplekslerinin oluşumu, SDS'de demonte edilen ve DNA'ya bağlı sadece sözdizimi bırakan ΔN komplekslerinin aksine, sodyum dodesil sülfata (SDS) karşı dirençleri ile doğrulanabilir ( Şekil 3B'deki b ve c'yi karşılaştırın).
  10. Küçük alikotlar hazırlayın, sıvı azotta flaş dondurun ve kullanıma kadar -80 ° C'de saklayın.
    NOT: Nihai çözelti reaksiyona girmemiş tutamaklar içermesine rağmen, bir akış hücresindeki numune montajı sırasında yalnızca biyotin ve azid ile iki kez etiketlenmiş istenen yapı seçilecektir.

6. Akış hücrelerinin imalatı

NOT: MT ölçümleri için akış hücreleri, çift taraflı bantla birbirine bağlanmış iki cam kapaktan yapılmıştır (Şekil 3C). Bir kapak kayması, spesifik olmayan bağlanmayı önlemek ve hedef moleküllerin biyotin-NeutrAvidin bağlantısı yoluyla spesifik olarak bağlanmasını sağlamak için PEG ve biyotinile polietilen glikol (PEG) karışımı ile kaplanmıştır (Şekil 3D). Daha sonra, MT deneyleri için malzemelerin çözeltileri, bir şırınga pompası kullanılarak sırayla bir akış hücresine enjekte edilir (Şekil 3C, D).

  1. Her biri üst (24 mm × 50 mm, No. 1.5 kalınlık) ve alt (24 mm × 60 mm, No. 1.5 kalınlık) yüzey için birer tane olmak üzere iki cam kapak fişi hazırlayın. Kapak fişlerini 30 dakika boyunca 1 M KOH'da sonikasyonla temizleyin. Sonikasyondan sonra, kapakları damıtılmış suyla durulayın ve bir sonraki adıma kadar suda tutun.
  2. Yayınlanan protokoller42,43'ü izleyerek alt kapak kapağını PEGylate edin. Silanizasyon için N-[3- (trimetoksisilil)propil]etilendiamin ve 100 mM bikarbonat tamponunda 1:100 (ww) biotin-PEG-SVA ve mPEG-SVA karışımı kullanın. PEGile edilmiş kapak fişlerini -20 °C'de kuru tutun ve birkaç hafta saklayın.
  3. Deneylerin yapıldığı gün, PEGylated kapak fişlerini çıkarın ve bir azot tabancasıyla kurutun. Temiz olduklarından emin olmak için kir olup olmadığını görsel olarak kontrol edin.
  4. Numune kanallarını yapmak için, ~2 mm genişliğinde çift taraflı bant şeritleri hazırlayın ve birbirine paralel ve birbirinden ~5 mm ile ayrılmış bir alt kapak kayması (PEGylated yüzey yukarı) üzerine dört şerit yerleştirin (Şekil 3C).
    NOT: Bu şekilde, tek bir akış hücresinde 5 mm genişliğinde üç numune kanalı oluşturulabilir.
  5. Alt kapak kapağının ortasına bir üst kapak kayması yerleştirin ve kanal giriş ve çıkışları için kısa kenarlarda ~5 mm boşluk bırakın. Kanalları sıkıca kapatmak için üst kapak kapağının arkasına cımbızla hafifçe bastırın.
  6. Giriş haznesi yapmak için 200 μL pipet ucunun kenarını kesin. ~200 μL çözeltinin tutulmasına izin vermek için daha geniş açıklıktan ~10 mm kesin. Üç akış kanalı için bunlardan üçünü yapın. Çıkışları yapılandırmak için, şırınga pompasının borusuna uyan üç şırınga iğnesi hazırlayın.
  7. 5 dakikalık epoksi kullanarak, rezervuarları ve iğne göbeklerini akış hücresine yapıştırın. Sızıntıyı önlemek için tam bir conta oluşturulduğundan ve kanalların fazla yapıştırıcı ile tıkanmadığından emin olun. En az 30 dakika kurumaya bırakın.

7. Boncuk-bağ yapılarının montajı

NOT: MT deneyleri için malzemelerin çözeltileri, boncuk bağı yapıları için olanlar da dahil olmak üzere, bir şırınga pompası kullanılarak akış hücrelerine sırayla verilir (Şekil 3C, D).

  1. Manyetik boncuklar hazırlayın. Bir stok çözeltisinden 5 mg M270-epoksi boncuk alın (167.5 μL dimetilformamid içinde ~ 3.3 ×10 8 boncuk) ve çözücüyü boncukların manyetik olarak ayrılmasıyla fosfat tamponu ile değiştirin ( bakınız Tablo 2).
  2. Boncukları ~ 1.1 × 109 boncuk mL-1'de 1 M amonyum sülfat içeren bir fosfat tamponunda hazırlayın ve 2 mM dibenzosiklooktin (DBCO)- NH2 ile reaksiyona sürün. Karışımı oda sıcaklığında dönen bir karıştırıcı üzerinde 3 saat inkübe edin. Reaksiyondan sonra, reaksiyona girmemiş molekülleri çıkarmak için boncukları taze fosfat tamponu ile 3 kat yıkayın.
    NOT: Yıkanan boncuklar, kullanımdan önce birkaç hafta boyunca 4 °C'de ekstra rotasyon olmaksızın saklanabilir.
  3. Akış hücresi kanal çıkışındaki bir iğneyi polietilen borulu şırınga pompasına bağlayın. PBS ile kanalları dengeleyin.
  4. Aşağıdaki çözeltileri pompa ile emerek kanala sırayla uygulayın: NeutrAvidin, hedef yapılar (DNA saç tokaları veya DNA kulplu SNARE kompleksleri), referans polistiren boncuklar ve DBCO kaplı manyetik boncuklar. Kullanmadan önce, potansiyel boncuk agregalarını dağıtmak için boncuk çözeltilerini iyice vorteksleyin.
  5. 0,1 pN kuvvet uygularken bağlanmamış boncukları yıkayın.
    NOT: Küçük bir yukarı doğru kuvvet uygulanması, bağlanmamış boncukların çıkarılmasını kolaylaştırır ve özel olarak bağlanmış boncuk bağı yapılarının kopmasını önlemeye yardımcı olur.
  6. SNARE kompleksleri ile yapılan deneyler için, son tampona 1,5 μM SNAP-25 ekleyin.
    NOT: Serbest SNAP-25 molekülleri, açıldıktan sonra SNARE komplekslerini yeniden bağlayabilir ve tek bir kompleks üzerinde tekrarlanan ölçümlere izin verebilir.

8. Hedef yapıların belirlenmesi

  1. Bir akış hücresi kanalının yüzeyinde, hedef yapının tek molekülleri tarafından bağlanan manyetik boncukları arayın. Yakınlarda bir referans boncuk bulunduğundan emin olun.
  2. Bir aday boncuğu döndürün ve serbestçe dönüp dönmediğini kontrol edin. Boncuk birden fazla molekül tarafından bağlanırsa, kısıtlı bir hareket sergiler.
  3. Boncuğu birkaç tam tur için döndürün ve dönme yarıçapını bulun (bu işlev sağlanan yazılımda uygulanır). Tercihen, küçük bir dönme yarıçapına sahip bir boncuk seçin.
    NOT: Bu yarıçap, boncuğun bağ ekseninden ne kadar merkezsiz olduğunu gösterir ve bu, boncuk-bağ montajı30,31 sırasında rastgele belirlenir. Tüm deneylerde, bir boncuğun minimum merkezden ayrılması, kullandığımız yüksek boncuk yarıçapı - tether uzatma oranı ile ilişkili birçok eseri hafifletir.
  4. İyi tek bağlı boncukları tanımlamak için kuvveti 0'dan 5 pN'ye yükseltin. 1 kbp'lik bir bağın (veya eşdeğer iki 510 bp tutamacının) gerilmesinden kaynaklanan bir boncuğun kırınım düzeninde büyük bir değişiklik olup olmadığına bakın. Kırınım deseni önemli ölçüde değişmezse, kuvveti sıfıra indirin ve başka bir aday boncuk için tarama yapın.
    NOT: Bir boncuğun ~ 300 nm kaldırılması, izleme işlemine gerçekten başlamadan ham görüntülerden kolayca fark edilebilir.

9. Uzatma ölçümleri için boncuk izleme

NOT: Boncukların izlenmesi, bu makaleyle birlikte verilen LabVIEW yazılımında boncuk görüntüleri gerçek zamanlı olarak analiz edilerek gerçekleştirilir. İzleme yöntemi ve varyantları konvansiyonel MT sistemlerinin çoğunda kullanılmıştır ve önceki literatürdeaçıklanmıştır 2,5,7,26. Manyetik bir boncuğun sabit bir referans boncuğa göre konumunu ölçerek (yani, diferansiyel izleme), konum ölçümleri harici bir bozulmaya karşı son derece sağlam hale gelir.

  1. Uygun bir manyetik boncuk bir referans boncukla birlikte yerleştirildikten sonra, boncuk izlemeye hazırlanmaya başlamak için Kalibre Et düğmesine tıklayın.
  2. Boncukların yerlerini tanımlamak için resimdeki boncuklara tıklayın. Görüntüler daha sonra boncukların etrafındaki ilgi çekici bölgelere (ROI'ler) (örneğin, 3 μm boncuk için 150 x 150 piksel) kırpılır ve daha sonra kesin boncuk koordinatlarını çıkarmak için daha fazla analiz edilir.
  3. Mıknatıs dönüşünün tamamlanmasını bekleyin. Bu işlem, boncuk31'in merkezsiz bağlantısını belgelemek için mıknatısları döndürürken boncuğun x ve y koordinatlarını kaydeder (2D çapraz korelasyon44'ü hesaplayarak veya boncuk görüntülerinin radyal simetri45'ini kullanarak, karşılaştırılabilir performansla).
  4. Z yönünde izleme için, yazılımın odak düzleminden farklı mesafelerdeki boncukların kırınım görüntülerinin bir arama tablosunu oluşturmasını bekleyin. Bu, objektif lensi eşit mesafeli adımlarla bir piezo tarayıcı ile basamaklandırarak ve her konumda dalgalanma ortalamalı boncuk görüntüleri kaydederek gerçekleştirilir. Daha sonra, gerçek deneylerdeki boncukların z-koordinatları, gerçek zamanlı boncuk görüntüleri interpolasyon7 ile arama tablosuyla karşılaştırılarak belirlenir.
  5. Arama tablosu oluşturma işlemi tamamlandığında, izleme ve otomatik odaklamayı etkinleştirin ( İzle ? ve AF? Düğmeler) tıklayın ve boncuk konumlarını kaydetmeye başlamak için Al düğmesine tıklayın.
    NOT: Otomatik netleme isteğe bağlıdır ancak alma sırasında z cinsinden sahne kayması için düzeltilmesi önerilir.

10. Kuvvet uygulama şemaları

  1. Kuvvet rampası deneyleri: Yapının kuvvet-uzatma ilişkisini doğrulamak için, sabit bir yükleme hızında (± 1,0 pN s−1) yukarı ve aşağı bir kuvvet artışı uygulayın (Şekil 4A). Örneğin, yapının toplam uzunluğunu ve tutamaçların kuvvet uzatma eğrisini doğrulamak için 0-20-0 pN döngüsünün üç turunu uygulayın.
  2. Yazılımdaki tether parametrelerini belirleyerek, ölçülen verilerin üzerine bir WLC kuvvet uzatma eğrisi yerleştirin ve hedef boncuğun uygun DNA tutamaklarına sahip gerçek bir numune yapısı ile bağlanıp bağlanmadığını belirleyin. Yapının bilinen kontur uzunluğunu (örneğin, 1 kbp dsDNA için ~ 340 nm) ve WLC kalıcılık uzunluğunu (kısa dsDNA31 için 30-45 nm) başlangıç noktası olarak kullanın. Gerekirse adım 2.11'de açıklanan uzantı düzeltme yöntemini uygulayın.
  3. Yapı doğrulanırsa, hedef moleküller-saç tokaları veya SNARE komplekslerinden kaynaklanan ek uzantıyı aramak için kuvvet uzatma tepkisini ayrıntılı olarak inceleyin.
  4. Sabit kuvvet deneyleri: Hedef moleküllerin kuvvet duyarlılığını araştırmak için uygulanan kuvveti ayrı adımlarda kademeli olarak değiştirin (Şekil 4B).
    NOT: MT'ler basit ve etkili sabit kuvvet deneylerine olanak tanır, çünkü mıknatıslar sabit tutulduğunda uygulanan kuvvet sabit tutulur.
    1. DNA saç tokaları için, 0.2-0.5 pN adımlarla 4-8 pN kuvvet uygulayın ve her kuvvet seviyesinde ~ 10 s için boncuk pozisyonunu ölçün.
    2. SNARE kompleksleri için, 0.1-0.2 pN adımlarla 14-16 pN kuvvet uygulayın ve her kuvvet seviyesinde ~ 10 s için boncuk pozisyonunu ölçün.
  5. Kuvvet atlama deneyleri: SNARE komplekslerinin geçiş olaylarını gözlemleyin.
    NOT: Sabit kuvvet deneyleri gibi kuvvet atlama deneyleri, kuvvet seviyelerindeki değişiklikleri içerir. Bununla birlikte, kuvvet sıçramaları, uygulanan kuvvette daha ani değişiklikler kullanır ve protein komplekslerinin ani bir kopması gibi araştırılan moleküllerde kuvvetle tetiklenen olayların izlenmesine izin verir. Örneğin, SNARE kompleksleri kuvvet döngüsü23'te yapısal histerezis sergilediğinden, kuvvet atlama deneyleri yapmak ve geçişe gecikmeyi ölçmek bilgilendiricidir (Şekil 4C).
    1. Sıkıştırmayı açma: Bir VAMP2 molekülünün sağlam, üçlü bir SNARE kompleksinden soyulması, ikili bir sözdizimi-1A ve SNAP-25 kompleksi bırakılması.
    2. Rezipleme: Bozulmamış bir SNARE kompleksini yeniden oluşturmak için sıkıştırılmamış VAMP2 molekülünün sıkıştırılması.
      1. Açılım: SNAP-25'in tamamen ayrışması ile birlikte bir SNARE kompleksinin tamamen sökülmesi. Sadece VAMP2 ve sözdizimi molekülleri açıldıktan sonra yapıda kalır.
      2. Yeniden katlama: Tampondan serbest bir SNAP-25 molekülünün bağlanması üzerine bir SNARE kompleksinin rejenerasyonu.
  6. 2 pN'de, serbest bir SNAP25 molekülünün birleşmesini bekleyerek (~ 30 sn) bozulmamış bir SNARE kompleksinin montajını indükleyin. Bir SNARE kompleksinin oluşumu üzerine genişlemede ani bir azalma gözlenir.
  7. Sıkıştırma açma olaylarını gözlemlemek için, 10-12 pN'de birkaç saniye bekleyin ve ardından mümkün olan maksimum motor hızıyla aniden 14-15 pN'ye geçin. Hedef kuvvete bağlı olarak, SNARE kompleksi ya kısmen sıkıştırılmamış ara ürünler arasında (sabit kuvvet deneylerinde olduğu gibi) tersine çevrilebilir bir geçiş sergileyecek ya da rastgele bir bekleme süresinden (veya gecikmeden) sonra daha yüksek, sıkıştırılmamış bir duruma ~ 25 nm'lik bir sıçrama gösterecektir.
  8. Rezipleme olaylarını gözlemlemek için, sıkıştırma gözlendikten hemen sonra kuvveti 10-12 pN'ye düşürün. Yine, SNARE kompleksi, bazı rastgele gecikmelerden sonra daha düşük, fermuarlı duruma stokastik bir geçiş sergiler. Sıkıştırmanın açılmasından sonra açılma meydana gelirse, bir SNAP-25 molekülü eksik olacağından, kompleks yeniden sıkıştırılamaz.
  9. Ortaya çıkan olayları gözlemlemek için, uzantıda (~ 2 nm) daha fazla bir artış tespit etmek için sıkıştırmanın açılması gözlendikten sonra daha uzun bir süre bekleyin.

11. Veri analizi

NOT: MT verileriyle yapılabilecek analiz türleri hedef sisteme bağlıdır. Bununla birlikte, Şekil 4'te açıklanan ilgili deneylerden yararlı bilgiler çıkarmak için yaygın yaklaşımlar vardır. Tüm analizler, bu makalede sağlanan özel kodlar kullanılarak MATLAB (R2021a) ile gerçekleştirilir. Bu kodlar, bu makalede sunulan verilerin aynısını kullanarak grafikler oluşturur. 100 Hz izlemeden elde edilen ham veriler doğrudan analiz için alınırken, 1,2 kHz izlemeden elde edilen verilerin, gürültüyü azaltmak için analizden önce (gürültü analizi hariç) tipik olarak medyan filtreli (beş noktalı bir kaydırma penceresiyle) olduğunu unutmayın.

  1. Kuvvet rampası deneyleri: Kuvvet-uzatma ilişkisini (örneğin, polimerlerin elastikiyeti) analiz edin ve nanomekanik özellikler hakkında bilgi elde etmek için kuvveti değiştirin.
  2. Sabit kuvvet deneyleri: Konformasyonel değişikliklerin yapısal (örneğin, geçişte yer alan bölgeler), termodinamik (örneğin, serbest enerji farkı) ve kinetik (örneğin, enerji bariyeri) parametrelerini çıkarmak için kuvvetin bir fonksiyonu olarak durum popülasyonlarını ve bekleme süresini (veya geçiş oranını) analiz edin.
  3. Kuvvet atlama deneyleri: Hedef moleküllerin ve durumlarının stabilitesini elde etmek için kopma kinetiğini (örneğin, protein-protein etkileşimleri ve reseptör-ligand bağlanması) veya geçici ara ürünlerin ömrünü (örneğin, biyomoleküllerin açılması) analiz edin.
  4. Temsili uygulamalar olarak, DNA saç tokaları ve SNARE kompleksleri için örnek verileri analiz edin:
    1. Bir DNA saç tokasının iki durumlu geçişleri: sıkıştırma kuvveti, açılma mesafesi, popülasyon kaymasının kuvvet bağımlılığı ve gizli bir Markov modeli (HMM) ile durum ataması ve geçiş hızı ölçümleri (MATLAB kodları sağlanır).
    2. SNARE komplekslerinin konformasyonel değişiklikleri: sıkıştırma kuvveti, ara durumların kuvvet bağımlılığı ve sıkıştırma gecikmesini açma, yeniden sıkıştırmada histerezis ve açılma / yeniden katlama davranışı.
      NOT: DNA tutamaçları, DNA saç tokaları ve SNARE kompleks konformasyonları için kuvvet uzatma modelleri önceki referanslardaverilmiştir 14,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kuvvet kalibrasyonu
İki kuvvet ölçüm yönteminden (boncukların yanal yer değiştirme varyansı ve güç spektrumu analizi) elde edilen sonuçlar 0-2 pN arasında farklılık göstermiştir (Şekil 2G). Şekil 2F'deki sonuçlara göre, normal neodimyum mıknatıslarla 30 pN'ye kadar güvenilir bir şekilde ulaşabiliriz.

8 bp DNA saç tokasının iki durumlu geçişleri
İlk önce kısa bir DNA saç tokasının nanomekaniğini araştırdık (Şekil 5). DNA saç tokaları, geleneksel tek moleküllü kuvvet spektroskopisi ile kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir ve bu nedenle karşılaştırılacak geniş bir referans kaynağı mevcuttur. Kısa bir saç tokasının açılması genellikle geri dönüşümlüdür, bu nedenle sıkıştırma olayları, sıkıştırmanın açılmasının gerçekleştiği aynı kuvvet aralığında da gözlenir (Şekil 5A). 0 pN ile 20 pN arasında bir kuvvet rampası uygulanarak (Şekil 5B), saç tokası yapısının kuvvet kaynaklı uzantısının, yalnızca DNA tutamaçlarının esnekliğine atfedilebilecek bir WLC modelini takip ettiği doğrulanmıştır (Şekil 5C, "kapalı"). Yaklaşık 6 pN'de, yapı, saç tokası yapısının geri dönüşümlü olarak açılmasıyla ilişkili olarak uzantıda ek dalgalanmalar gösterdi (Şekil 5C, iç kısım). Son olarak, ~ 8 pN'de, geçiş sonunda ortadan kayboldu ve uzantı, ~ 7 nm daha da uzatılan üst duruma yerleşti. Sonuç olarak, 8 pN'nin üzerinde ölçülen kuvvet uzatma profili, sıkıştırılmamış saç tokasının tek sarmallı bölgesinin uzunluğunu içeren yeni bir model eğrisine (Şekil 5C, "açık") yapıştı.

Daha sonra saç tokası geçişini sistematik olarak incelemek için sabit kuvvet deneyleri yaptık. Boncuk pozisyonu, her seviyede ~ 10 s için 0.5 pN adımlarla 4-8 pN kuvvet aralığında ölçüldü; Daha sonra, uzatma değerleri toplandı ve denge dağılımlarını kuvvetin bir fonksiyonu olarak ölçmek için analiz edildi. 100 Hz izlemeden elde edilen sonuçlar, bu kuvvet rejiminde daha genişletilmiş bir duruma doğru kademeli bir kayma olduğunu düşündürmektedir (Şekil 5D), ancak uzantının elde edilen histogramları farklı popülasyonları çözmek için yeterince net değildi (Şekil 5E). Tam tersine, aynı deneyler 1,2 kHz'de gerçekleştirildiğinde (Şekil 5F), nazik filtrelemeden (beş noktalı medyan filtre) sonra genişleme değişikliklerinin yüksek hızlı yörüngeleri, iki Gauss dağılımının bir karışımı ile iyi tanımlanmış iki ayrı popülasyonu ortaya çıkardı (Şekil 5G). Saç tokasının açılma mesafesini gösteren iki popülasyon arasındaki ayrım, sıkıştırma kuvveti rejiminde ~ 7 nm'de değişmeden kalmıştır (Şekil 5H). Ekstremitelerdeki sapma (4 pN ve 8 pN), kıtlığı nedeniyle bir durumun yanlış lokalizasyonundan kaynaklanıyordu.

Veriler, sıkıştırmayı açma geçişi için orta kuvvetin (kapalı ve açık popülasyonların eşit hale geldiği kuvvet) F1/2'nin ~ 6 pN olduğunu ve kuvveti 4-8 pN'ye yükselttikçe üst, açık durumun kademeli olarak baskın hale geldiğini ortaya koydu (Şekil 5I). Açık olasılık için bir Boltzmann ilişkisi ile donatıldığında, Equation 10yukarıdaki gözlemlerle tutarlı olarak F 1/2 = 5.9 pN ve Δz = 7.1 nm'nin kesin değerleri elde edildi. Bununla birlikte, tek bir yapıdan elde edilen açılma kuvvetinin, ticari M270 boncukları31 için ~% 4 olarak ölçülen kuvvet üretimindeki boncuk-boncuk değişkenliği nedeniyle doğru olmayabileceği belirtilmelidir. Ayrıca, gövde uzunluğu (8 bp) kısa olduğundan, farklı nükleotid bileşimine sahip diğer 8 bp saç tokalarının zemin-gerçek açma kuvvetiçok fazla değişebilir 20. Son olarak, durum geçişini haritalamak için HMM'yi uzantı izlerine uyguladık ve böylece geçiş oranlarını ölçtük (Şekil 5F, kırmızı iz). Hem sıkıştırmayı açma hem de yeniden sıkıştırma oranları, uygulanan kuvvetle katlanarak değişmiştir (Şekil 5J), kuvvet sıkıştırmayı açmayı teşvik edecek ve yeniden sıkıştırmayı engelleyecek şekilde. Gerekirse, enerji manzarasının parametrelerini çıkarmak için klasik Bell ifadesi de kullanılabilir (örneğin, bariyer yüksekliği ve mesafesi)46.

Uzatma ölçümlerinde termal dalgalanmanın karakterizasyonu
Saç tokası yapısını kullanarak, uzatma ölçümlerinde kuvvete bağlı gürültünün profilini çıkardık. İlk olarak, bağlı bir boncuğun termal dalgalanmaları, bu deneyler için uygun parametreler (örneğin, boncuk yarıçapı, tether uzunluğu) kullanılarak denklemlerden hesaplanmıştır2,5 (Şekil 5K, katı eğriler). Ayrıca, farklı kuvvet seviyelerinde bir saç tokası yapısının zaman izinden ölçülen standart uzatma Equation 11 sapmasını da çizdik. Bu molekülün bir saç tokası motifi olduğu için, içsel gürültünün ölçümü için 4 pN'nin (kapalı durum) altındaki tepkisi kullanılırken, saç tokası dinamikleri beklendiği gibi ~ 6 pN tespit edildi ve bir kontrol görevi gördü. Dalgalanmanın kuvvete bağlı baskılanması, saç tokası çoğunlukla açık hale geldikten sonra da gözlendi (8 pN'ye karşı 4 pN'yi karşılaştırın). Termal sınırla karşılaştırma, iyileştirme için bir yer olduğunu gösterir, ancak bu kalan gürültü genellikle rastgele ve çözülmesi zor olan manyetik bir boncuk30'un dönme dalgalanması ile ilişkilidir. Gözlem süresi boyunca Brownian gürültüsünün daha sistematik analizi için, Allan sapmasının hesaplanması sıklıklakullanılır 32,33. Şekil 5F'de sunulan saç tokası verileri için Allan varyansını, Şekil 2C'deki 5 kbp ölçümlerine benzer şekilde hesapladık. Şekil 5L'deki sonuçlar, 4-8 pN'lik ara kuvvet aralığında, maksimum hızda (1.2 kHz) 2-3 nm Allan sapması elde ettiğimizi ve bu değerin 0.1 sn'den daha uzun gözlem süresi (τ) için 1 nm'nin altına düştüğünü göstermektedir. İlginç bir şekilde, saç tokası dinamikleri, Şekil 5I, J'deki ölçülen geçiş kuvveti ve oranlarıyla tutarlı olarak, ~ 0.01 s (Şekil 5L, iç kısım) için 5-7 pN civarında ortaya çıkmıştır.

Nöronal SNARE komplekslerinin konformasyonel değişiklikleri
Daha sonra nöronal SNARE komplekslerini bir protein modeli olarak kullandık ve kuvvete bağımlı mekanik özelliklerini inceledik. Saç tokası yapısından farklı olarak, iki adet 510 bp dsDNA tutamağı arasında tek SNARE kompleksleri tutulmuştur (Şekil 6A). Kulplardan distal olan sözdizimi-1A ve VAMP2 termininin, yırtılmayı önlemek ve belirli bir yapının birden fazla cımbızlanmasını sağlamak için yapay sistein kalıntıları arasında bir disülfit bağı ile çapraz bağlandığı belirtilmelidir.

İlk olarak, hedef yapıyı germek ve gevşetmek için sırasıyla hem artan hem de azalan kuvvet seviyelerine (± 1 pN s−1) sahip bir kuvvet rampası uyguladık. Düşük ila orta kuvvet rejiminde (0-10 pN), iki tutamak bağımsız olarak WLC polimerleri gibi davrandı ve genel olarak 1 kbp dsDNA'nınkinden ayırt edilemeyen kuvvet-uzatma eğrisini şekillendirdi (Şekil 6B, siyah). Bununla birlikte, kuvvet 10 pN'nin üzerine çıkarıldığında, uzantı değerleri WLC modelinden önemli ölçüde saptı ve gömülü SNARE kompleksinin uzantıda ek bir artış gösterdiğini gösterdi. Daha spesifik olarak, genişleme artışı üç ayrı aşamada özetlenebilir: (a) 11-13 pN'de hafif, kademeli bir artış, (b) 14-16 pN'de hızlı ve daha büyük (~ 10 nm) dalgalanmalar ve (c) yaklaşık ~ 20 nm'lik nihai, geri dönüşümsüz sıkıştırma. Ek olarak, yapıyı gevşetmek için kuvvet indirildiğinde, uzantı ya daha düşük bir kuvvette (<15 pN) orijinal kuvvet-uzatma eğrisine geri döndü ya da daha büyük bir uzantıya sahip yeni bir model eğrisi izledi (Şekil 6B, mavi). Toplam uzantı sonunda 5 pN'nin altındaki daha düşük değerlere ( Şekil 6B'de maviden siyaha) geri yüklendi ve benzer bir eğilim gösteren aynı kuvvet-rampa döngüleri uygulanabildi.

SNARE kompleks konformasyonunun moleküler modelinden potansiyel ara ürünlerin olası genişleme değerlerini kesin olarak hesaplayabiliriz (Şekil 6C). Ayrıca, açılmış polipeptitler için WLC davranışını varsayarsak, uzantılar kuvvetin bir fonksiyonu olarak tahmin edilebilir, böylece çeşitli konformasyonlar için tam kuvvet-uzatma modelleri üretilir (Şekil 6B, noktalı çizgiler). Bu değerleri referans alarak, yukarıdaki geçişleri aşağıdaki gibi yorumladık 14,23: (a) sözdizimi-1A ve VAMP2'nin bağlayıcı bölgelerinin açılmasını ima eden11-13 pN'de tam fermuarlı durumdan (FZ) bağlayıcı duruma (LO) kademeli bir geçiş; (b) LO ile yarı fermuarlı durum (HZ) arasında hızlı geçiş, bir SNARE kompleksinin sıfırıncı iyonik tabakaya kadar açılmasını ima eder; ve (c) VAMP2'nin kompleksin geri kalanından tamamen çözülmesi anlamına gelen sıkıştırılmamış (UZ) veya katlanmamış duruma (UF) son geçiş. UZ durumu, UF'den farklıdır, çünkü SNAP-25'in ilişkili molekülü hala bir ikili kompleksi koruyarak sözdizim-1A'ya bağlıdır. UF durumunda (SNAP-25 olmadan), tam SNARE kompleksi ancak çözeltiden serbest bir SNAP-25 molekülü yeniden birleştikten sonra yeniden oluşturulabilir, burada bu tür bir yeniden bağlanmaya izin vermek için uygulanan kuvvetin azaltılması kritik öneme sahiptir.

SNARE komplekslerinin konformasyonel değişikliklerini daha sistematik bir şekilde doğrulamak için, konformasyonel dalgalanmaların sıklıkla 14-15 pN'de gözlendiği kuvvet rejiminde kuvvet atlama deneyleri gerçekleştirdik (Şekil 6D). Tipik olarak, ilk önce boncuk pozisyonunu 10 pN'de ölçerek başladık ve SNARE ile ilgili değişikliklerin olmadığını gösteren kararlı uzantıyı kontrol ettik. Daha sonra, kuvvet seviyesi aniden 14-15 pN'ye yükseltildi ve eğer varsa, sıkıştırma açılana kadar uzatma izlendi. Son olarak, açılma ile ilişkili uzantıda kalıcı bir artış olup olmadığını kontrol etmek için kuvvet 10 pN'ye düşürüldü. 14 pN'de, uzantı izleri çoğunlukla LO durumunda kaldı ve zaman zaman HZ durumuna ani artışlar oldu. HZ durumuna yapılan bu kısa gezilerin, boncuk görüntülerini 12 faktörle ortalamasını ve aşağı örneklemesini sağlayan 100 Hz izlemede kaçırılmasının muhtemel olduğu belirtilmelidir. HZ devletine yapılan açık ve sık ziyaretlere rağmen, kompleks UZ devletine tam bir geçiş yapamadı (Şekil 6E), dış kuvvetin sıkıştırmanın açılması için enerji engelinin üstesinden gelmek için yeterince güçlü olmadığını düşündürmektedir. Buna karşılık, kuvvetteki küçük bir artış bile (14.3 pN'ye) geçişi çok verimli hale getirdi, böylece UZ durumuna çoğunlukla birkaç saniye içinde ulaşıldı (Şekil 6F). Sürekli olarak, komplekse 14.5 pN uyguladığımızda sıkıştırmanın açılması çoğunlukla 1 s içinde tamamlandı (Şekil 6G, H). Özellikle, daha yüksek kuvvetlerde sıkıştırmanın açılması, UZ'un üzerindeki uzantıdaki küçük ek artış (Şekil 6H) ve 2 pN'de gözlenen yeniden katlanma imzası (Şekil 6I) ile kanıtlandığı gibi, sıklıkla tüm kompleksin (SNAP-25'in çıkarılmasıyla birlikte) tamamen açılmasına yol açmıştır. Genel olarak, bu veriler SNARE komplekslerinin ortaya çıkması için klasik kayma-bağ davranışını47 göstermektedir ve önceki raporlarla tutarlı olarak 14,23,48.

Figure 1
Şekil 1: Cihaz kurulumu. Yüksek hızlı MT kurulumunun şeması (A) ve fotoğrafı (B). Bir lineer ve bir rotasyon motoru tarafından kontrol edilen mıknatıslar, 100x yağ daldırma lensi ve yüksek hızlı bir CMOS kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskobun numune aşamasının üzerinde bulunur. Süper ışıldayan bir diyottan gelen ışık demeti mıknatıslardan geçer ve alanı aydınlatır. Giriş: Odak düzleminden farklı mesafelerde bulunan boncukların temsili kırınım görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Kuvvet kalibrasyonu. (A) Bir kuvvet kalibrasyon numunesinin şeması. 1 mm ayırmalı bir antiparalel mıknatıs çifti tarafından uygulanan kuvvetin büyüklükleri, 5 kbp dsDNA parçası ile bağlanmış bir manyetik boncuğun (M270) yer değiştirmelerinden d mıknatıs mesafesinin bir fonksiyonu olarak ölçülür. (B) Kuvvet kalibrasyon prosedüründen elde edilen temsili veriler. Renkli oklar, (D) (eşleşen renkler) içinde genişletilmiş bölgeleri gösterir. (C) 15-20 pN ile ölçülen 5 kbp bağlı bir boncuğun z-pozisyonu için Allan sapması. Referans boncuk pozisyonunun çıkarılmasından önceki (mavi) ve sonra (kırmızı) manyetik boncuk z-koordinatları için eğriler gösterilir. (D) Belirtilen mıknatıs uzaklığında ölçülen y pozisyonunun temsili zaman serileri d. Y-koordinat dağılımının karşılık gelen histogramı, Gauss uyumu (kırmızı) ile sağda gösterilir. (E) (D)'de gösterilen verilerden PSD'yi temsil eder. İlgili PSD'lere bir model (kırmızı) takılarak elde edilen kuvvet değerleri üstte verilmiştir. (F) Mıknatıs mesafesinin bir fonksiyonu olarak manyetik kuvvetin kalibrasyonu. Kuvvetler varyanstan (solda) veya PSD yönteminden (sağda) ölçüldü. Fit (kırmızı), açıklamalı denkleme sahip çift üstel bir modeli gösterir. (G) Varyans ve PSD'den elde edilen ölçülen kuvvetteki fark. (F)'de gösterilen uyumlar için kırmızı bir eğri hesaplanır. (H,I) 5 kbp kalibrasyon yapısının kuvvet-uzatma ilişkisinin doğrulanması. Farklı kuvvet seviyelerindeki (varyanstan ölçülen) ortalama uzatma değerleri, ya doğrudan (H) ya da merkezsiz bir boncuk31'in eğilmesi nedeniyle boncuk yüksekliği ofseti (I) için düzeltildikten sonra kullanılmıştır. N = 5 molekülleri için kuvvet uzatma verileri genişletilebilir bir WLC modeli ile takıldı ve takılan parametreler (kalıcılık uzunluğu Lp ve gerilme modülü Ko) üstte açıklandı (ortalama ± s.d.). Kısaltma: PSD = güç spektral yoğunluğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Numune hazırlama . (A) λ-DNA'nın 1 kbp bölgesinin PCR amplifikasyonu ile 8 bp DNA saç tokası yapılarının hazırlanması. (B) İki adet 510 bp DNA tutamağı ile SNARE kompleks yapılarının hazırlanması. Giriş: DNA tutamaçlarının doğrulanması ve agaroz jel elektroforezi (% 2 jel) ile proteinlere bağlanması. Oklar, ürün türlerinin hareketlilik değişimini (renk kodlu) gösterir: serbest 510 bp tutamaçları (macenta); Sözdizimine (kırmızı), ΔN kompleksine (yeşil) ve SNARE kompleksine (mavi) bağlı B kolu; ve son iki kulplu SNARE kompleksi (yeşil). SDS'nin eklenmesi, ΔN komplekslerini (b'de bulunur) bozar, ancak tam uzunluktaki VAMP2 (c'de bulunur) tarafından oluşturulan tam SNARE komplekslerini bozmaz. (C) MT deneyleri için bir akış hücresinin tasarımı ve fotoğraflanması. (D) Numune çözeltilerinin bir akış hücresi kanalına sıralı olarak sokulmasının şeması. Kısaltma: MT = manyetik arabulucu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Temsili deney türleri. (A-C) Kuvvet rampası, kuvvet kelepçesi ve kuvvet atlama deneylerinin şemaları (üstte), karşılık gelen ölçümlerden (ortada) uzatmanın temsili zaman izleri ile. Yapılabilecek analiz türleri altta gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: 8 bp DNA saç tokasının iki durumlu geçişi. (A) Beklenen sıkıştırma açma ve sıkıştırma geçişi ile bir DNA saç tokası üzerinde MT deneylerinin şeması. (B) Artan (~0.25 pN s−1) kuvvet seviyelerine sahip kuvvet rampası deneylerinden yapı uzantısının temsili izi. (C) (B)'deki verilerden yeniden oluşturulan temsili kuvvet-uzatma eğrisi. Sarı eğriler, saç tokası yapısı için WLC modellerini gösterir ve saç tokası kapalı (katı) ve açık (kesikli) konformasyondadır. (D) 100 Hz'de ölçülen, artan kuvvet seviyelerine sahip sabit kuvvet deneylerinden temsili uzantı izi. (E) (D)'deki uzantı verilerinin histogramları. (F,G) (D) ve (E) sürümlerinde aynı denemeler için ancak 1,2 kHz izleme ile elde edilen sonuçlar. Ham 1,2 kHz zaman serisi, beş noktalı bir medyan filtre uygulanarak düzeltildi. (F)'nin genişletilmiş görünümündeki kırmızı izler bir HMM'den elde edilmiştir. (G)'deki kırmızı çizgiler Gauss popülasyonlarının yerlerini gösterir. (H) (G)'deki iki popülasyon arasındaki mesafe. (I) Uygulanan kuvvetin bir fonksiyonu olarak açık durumdaki olasılık. Kırmızı eğri, orta kuvvet F1/2 = 5.9 pN olan uygun bir Boltzmann modelidir (Equation 10 ). (J) HMM sonuçlarından ölçülen sıkıştırmayı açma ve sıkıştırma geçiş oranları. Düz çizgiler kuvvete üstel bağımlılığı gösterir. (K) Uzatma ölçümlerinde termal dalgalanma. Saç tokası uzatma verilerinin standart sapmaları (filtreleme olmadan) kuvvetin bir fonksiyonu olarak gösterilir. Termal dalgalanmaların teorik büyüklüğünü temsil eden termal çözünürlük sınırı, Choi ve ark.2 tarafından yapılan çalışmada Eq 9'dan 1 kbp bağı olan 2.8 μm boncuk için tahmin edilmiştir. (L) (F)'deki 1,2 kHz saç tokası verisinden hesaplanan Allan sapmaları (filtreleme olmadan). İç kısım, 0.01 s'deki Allan sapmasını, kuvvetin bir fonksiyonu olarak gösterir, bu da saç tokası dinamikleri nedeniyle dalgalanmanın kademeli olarak arttığını ve azaldığını gösterir. Kısaltma: MT = manyetik arabulucu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Nöronal SNARE komplekslerinin konformasyonel değişiklikleri. (A) SNARE kompleksleri üzerindeki MT deneylerinin şeması. (B) SNARE yapısı için temsili kuvvet-uzatma eğrileri. Siyah ve mavi izler (100 Hz), kuvvet-rampa deneylerinde sırasıyla germe ve gevşeme dönemlerinden elde edilmiştir. Kesikli çizgiler, (C)'de gösterilen SNARE komplekslerinin çeşitli konformasyonlarını hesaba katan uzatma modellerini gösterir. (C) SNARE kompleks konformasyonlarının moleküler modelleri, karşılık gelen hesaplanan uzantılarla birlikte. Değerler, helisel demetlerin geometrik parametrelerinden ve polipeptit bölgesi14 için bir WLC modelinden tahmin edildi. (D) SNARE karmaşık konformasyonlarını araştırmak için kuvvet atlama deneylerinin şeması. (E-H) Belirtilen kuvvet seviyelerinde gerçekleştirilen kuvvet atlama deneylerinden temsili uzantı izleri. (E)'de sıkıştırmanın açılması gözlenmedi. (F) ve (G)'de, sıkıştırmanın açılması ve ardından 10 pN'de yeniden sıkıştırılma gözlendi. (H)'de, sıkıştırmanın açılmasını daha da gelişen bir olay izledi. (I) Bir SNARE kompleksinin 2 pN'de yeniden katlanması. 5 pN'de UF'den FZ durumuna genişlemede belirgin bir azalma gözlendi. Kısaltma: MT = manyetik arabulucu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

PCR ayarı Koşul
Malzeme 1,25 μg/mL λ-DNA (şablon), 1 μM ileri ve geri primerler, 0,2 mM dNTP, 0,05 U/μL nTaq, 1x nTaq tampon
Denatürasyon 30 sn esnasında 95 °C
Tavlama Kalibrasyon yapısı: 30 s esnasında 55 °C
DNA saç tokası: 30 sn esnasında 57 °C
DNA tutamakları: 30 sn esnasında 50 °C
Uzantı DNA saç tokası ve kulpları: 1 dakika esnasında 72 °C
Kalibrasyon yapısı: 5 dakika boyunca 72 °C
Devir 30–34
Agaroz jel elektroforezi
Jel 1x SYBR Güvenli içeren 0.5x tris-borat-EDTA'da (TBE, pH 8.3) %2 agaroz
Koşarak Mupid-2plus'ta tam güç (108 V ort.) (Advance), 40-50 dk

Tablo 1: PCR reaksiyonları ve agaroz jel elektroforezi için koşullar. Kuvvet kalibrasyonu için 5 kbp dsDNA, DNA saç tokası yapısı ve SNARE'leri bağlamak için DNA tutamaçları dahil olmak üzere DNA yapılarının PCR'si için reaksiyon parametreleri. Astar dizileri Malzeme Tablosunda verilmiştir.

Protein saflaştırma tamponu Kompozisyon
Yıkama Tamponu A 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 7 mM β-merkaptoetanol (BME), %10 gliserol ve 20 mM imidazol
Yıkama Tamponu B 50 mM HEPES (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, %10 gliserol ve 20 mM imidazol
Lizis Tamponu Yıkama Tamponu A,% 1 Triton X-100, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli ile desteklenmiştir
Elüsyon Tamponu 400 mM imidazol ile desteklenmiş Yıkama Tamponu B
Fosfat tamponlu salin (PBS) 81 mM sodyum fosfat dibazik (Na 2 HPO 4), 19 mM sodyum fosfat monobazik (NaH 2 PO4) (pH7.2),150 mM NaCl
fosfat tamponu 81 mM Na 2 HPO4, 19 mM NaH2PO 4, pH7,4

Tablo 2: Tamponlar ve bileşimleri. Protein saflaştırma için kullanılan tamponların bileşimi.

Ek Şekil S1: Bir mıknatıs tutucunun çizimi. 1 mm boşluklu iki adet 10 mm x 10 mm x 12 mm mıknatıs için bir akrilik tutucunun boyutları gösterilmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: MATLAB kodlarını içeren sıkıştırılmış bir dosya. Kuvvet kalibrasyonu, saç tokası ve SNARE karmaşık analizi dahil olmak üzere yüksek hızlı manyetik cımbız deneyleri tarafından üretilen verileri analiz etmek için MATLAB komut dosyaları. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: LabVIEW yazılım paketi sıkıştırılmış dosya. Yüksek hızlı manyetik cımbız kurulumunu çalıştırmak ve onunla veri almak için eksiksiz bir LabVIEW kodları paketi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmada, biyomoleküllerin yapısal değişikliklerini yüksek uzaysal zamansal hassasiyette gözlemleyebilen tek moleküllü bir kuvvet spektroskopisi kurulumunu tanıttık. Kullanılan yüksek hızlı CMOS kamera, 1.280 x 1.024 çözünürlükte 1.200 kare s−1 elde ederek 1,2 kHz boncuk izleme sağlar. Bununla birlikte, ölçümlerin hızı şu anda boncuk izleme yazılımı ile sınırlıdır, bu nedenle yatırım getirisi genellikle yüksek hızlı ölçümlerde daha küçük alanlara indirgenir. SLD'nin yüksek gücü, birkaç kHz bant genişliğine kadar hızlı boncuk görüntüleme için kritik öneme sahip parlak bir aydınlatma sağlar. Dahası, ışının uzamsal tutarlılığı, boncukların etrafında yüksek kontrastlı, eşmerkezli kırınım halkaları oluşturur (Şekil 1A, iç kısım), bu da boncuk pozisyonunun simetriye dayalı olarak hassas bir şekilde belirlenmesini sağlar.

Bir boncuk bağı yapısına uygulanan manyetik kuvvet, bağlı boncuk35,37,38'in Brownian dalgalanmalarını ölçerek belirlenebilir. Gerçek zamanlı kuvvet analizi hesaplama ağırlıklı olduğundan, uygulanan kuvvet tipik olarak bir referans yapısı kullanılarak önceden ölçülür. Örneğin, kullanılacak manyetik boncuklar uzun (>5 kbp) dsDNA parçaları ile bağlanır ve boncuk pozisyonundaki karşılık gelen termal dalgalanmalar mıknatıs mesafesinin bir fonksiyonu olarak ölçülür (Şekil 2A). Kuvvet kalibrasyonu tipik olarak kurulum yapıldıktan sonra bir kez gerçekleştirilir, ancak kurulum değiştirilmedikçe, örneğin mıknatısları değiştirerek düzenli olarak tekrarlanması gerekmez. Boncuk dalgalanmasının karakteristik frekansı uygulanan kuvvet2 ile arttığından, yüksek hızlı bir kurulum, yüksek kuvvet rejiminde hızlı dinamikleri yakalamak ve kuvveti doğru bir şekilde ölçmek için özellikle yararlıdır. Varyanstan kuvvet tahmini, uygulanmasında frekans alanındaki spektral analizden çok daha basittir, ancak sürüklenme, kamera tabanlı edinim ve merkezsiz boncuk eki31,37,38 nedeniyle uzantı değişikliklerinden kaynaklanan eserlere karşı hassastır. Bununla birlikte, iki yöntemden elde edilen sonuçlar, uygun şekilde elde edilirse sadece 0-2 pN oranında farklılık gösterir (Şekil 2G); Bu nedenle, varyans yöntemi, kuvvetin mutlak belirlenmesi kritik olmadığında yeterince güvenilirdir.

30 pN'nin üzerinde ve yaklaşık 65 pN'de (dsDNA aşırı gerilmesinin bir kriter olarak hizmet ettiği) daha yüksek kuvvetler için, ya ticari olarak temin edilebilen yüksek dereceli (N50-N52) mıknatıslar monte edilmeli, mıknatıslar arasındaki boşluk azaltılmalı ya da manyetik alan 28,49 olarak daha da tasarlanmalıdır. Bu kurulumda, dikey motorun en yüksek hızı 30 mm / s'dir ve bu da ~ 0,6 sn'de 0 pN'den 20 pN'ye bir kuvvet sıçramasına izin verir. Motor hareketi kuvvet yükleme hızını sınırlarsa, hızlı kuvvete bağlı bazı yapısal değişiklikler gözden kaçırılabilir. Uygulamaya bağlı olarak, mıknatısların hareket ettirilme biçiminde değişiklikler ve daha fazla optimizasyon gerekli olabilir. Bir örnek, manyetik bant kafasının yaratıcı kullanımını içerir15.

MT'lerle yüksek çözünürlüklü ölçümler için, çeşitli kaynaklardan gelen gürültü seviyesini değerlendirmek önemlidir. Optik bileşenler (yüksek büyütme lensli, parlak ışık kaynağı ve hızlı kameralı bir mikroskop) düzgün bir şekilde yapılandırıldıktan sonra, boncuk izlemede nanometrenin altında hassasiyet elde edilebilir. Daha sonra, ana gürültü kaynağı, uygulanan kuvveti ölçmek için kullanılan bir boncuğun Brownian hareketi haline gelir. Bağlı bir boncuğun termal dalgalanması, yarıçapına, tether uzunluğuna ve uygulanan kuvvete bağlıdır. Her ne kadar z yönündeki içsel dalgalanma (yani, uzatma değişiklikleri) yalnızca termal enerjiye ve tether sertliğine bağlı olsa da, boncuk-tether dinamikleri ve kamera tabanlı edinim oranı, boncuğun hareketini ve dolayısıyla hedef biyomoleküllerin izlenmesini filtreler. Bu nedenle, boncuk boyutu ve örnekleme oranı, iyi bir uzaysal zamansal çözünürlük elde etmek için stratejik olarak seçilmelidir. Kullandığımız 2,8 μm boncuklara alternatif olarak, daha küçük 1 μm boncuklar da popülerdir ve hızlı tepkileri nedeniyle hızlı ölçümler için avantajlı olabilir. Bununla birlikte, kritik bir zayıflık, üretilebilecek maksimum kuvveti sınırlayan küçük manyetik içeriktir (Equation 12 ). Daha küçük boncuklar hala en az 10 pN'ye kadar kuvvet uygulayabildiğinden, DNA süper sarmalında olduğu gibi zayıf kuvvet fenomenlerini incelemek için uygun olabilirler. Buna karşılık, moleküler motorların, protein katlanmasının (örneğin, SNARE'ler, burada gösterilmiştir) veya hücre mekaniği50'nin araştırılması, daha yüksek kuvvetlerin uygulanmasını gerektirir; bu durumda, uygulanabilir kuvvetaralığını genişletmek için mıknatıs konfigürasyonunu değiştirmeyi (örneğin, boşluğu veya mesafeyi azaltmayı) düşünebilirsiniz.

Teknik, biyofiziksel olarak ilgili ölçekte bir kuvvet uygularken hedef moleküllerin nanomekanik tepkilerini araştırdığından, mekanobiyolojik süreçlerde önemli rol oynayan kuvvete duyarlı elementleri incelemek için idealdir. Yüksek hassasiyetli MT testinin geniş uygulanabilirliğini göstermek için, pikonewton ölçekli bir kuvvetin uygulanması üzerine dinamik ve hızlı konformasyonel değişiklikler sergileyen hem nükleik asit hem de bir protein modeli kullandık. Tekniğin bir sınırlaması, saflaştırılmış nükleik asitlerin ve proteinlerin gerekliliğidir, bu da özellikle geniş bir protein yelpazesine geniş bir şekilde yayılmasını engellemiştir. İn vitro protein ekspresyonu ve konjugasyon teknolojilerinin ilerlemesi, daha az çalışılmış proteinlere erişim sağlamaya devam edecektir. İlgili bir konu, hedef yapı hakkındaki a priori bilginin genellikle tasarım deneyleri için kritik öneme sahip olmasıdır (örneğin, tutamaçların bağlanması). Tek parçacıklı kriyo-EM 52 veAlphaFold2 53'ün ortaya çıkışının, tek protein molekülleri üzerindeki mekanik ölçümlerin tasarımını ve analizini güçlü bir şekilde destekleyeceğini ve yüksek çözünürlüklü MT'nin daha güçlü uygulamalarını ortaya çıkaracağını umuyoruz.

DNA saç tokalarının sıkıştırma kuvveti, dizi, yapı ve tampon bileşimi dahil olmak üzere birçok faktöre bağlıdır, ancak en kritik olarak kök uzunluğu ve guanin-sitozin (GC) içeriği20'ye bağlıdır. Yüksek hızlı izlemenin gücünü göstermek için, hızlı dinamiklerle düşük bir kuvvette ortaya çıkması beklenen 8 bp'lik bir gövdeyi (üç GC baz çifti ile) kasıtlı olarak tasarladık. Gerçekten de, Şekil 5'teki sonuçlar, bu kadar hızlı dinamiklerin 10 ms veya daha düşük çözünürlüğe sahip standart tekniklerle çözülmesinin zor olacağını göstermektedir. Bu husus, yüksek oranları 100 ila 200 s−1 arasında değişen HMM analizinden ölçülen geçiş oranları ile daha da doğrulanmaktadır (Şekil 5J).

Nöronal SNARE'lerin sinaptik vezikül ekzositozunu tetiklediği düşünülmektedir. Özellikle, SNARE proteinleri, vezikül ve plazma membranları arasındaki elektrostatik itme gibi ilişkili enerji bariyerini düşürerek membran füzyonunu katalize eder. Buna göre, SNARE komplekslerinin konformasyonel dalgalanmalarının, beklenen itici kuvvetler seviyesi 14,23'e karşılık gelen 12-15 pN'lik dar bir kuvvet aralığında meydana geldiği bulunmuştur. Burada açıklanan yüksek hızlı MT'leri kullanarak, nöronal SNARE komplekslerinin kuvvete bağımlı davranışları hakkındaki ana bulguları özetledik. Sıkıştırmayı açma ve yeniden sıkıştırmadaki kuvvet histerezisi (Şekil 6B), yeniden sıkıştırmanın sıkıştırmayı açmaktan daha düşük bir kuvvette gerçekleştiğini ve bu nedenle bu döngü sırasında iş yapıldığını gösterir. Bu tür dengesizlik geçişlerine, yük altında geçiş gecikmesinin (bir bağ kopması olayına benzer) veya sıkıştırmadan önce konformasyonel dalgalanmaların ölçülebildiği kuvvet atlama deneyleri ile daha iyi yaklaşılır. Her iki durum da, biyomoleküllerin geçici durumları ve kompleksleri 15,17,54,55,56 üzerine yapılan son çalışmalarda gösterildiği gibi, yüksek hızlı kurulumlardan yararlanmaktadır.

Toplu olarak, bu sonuçlar, geleneksel tek moleküllü kuvvet spektroskopisi ile bildirilen DNA saç tokalarının ve nöronal SNARE komplekslerinin karakteristik kuvvete bağlı değişiklikleri ile aynı fikirdedir. Aynı zamanda, biyomoleküllerin ve bunların montajlarının kuvvet hassasiyetini ortaya çıkarmak için yüksek hassasiyetli mekanik ölçümlerin faydasını vurgulamaktadırlar. Bu makalenin mekanobiyoloji alanından daha fazla insanı çekebileceğini ve araştırmacıları benzersiz ilgi sistemlerini araştırmak için yüksek hızlı MT'ler kullanmaya motive edebileceğini umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Acknowledgments

Bu çalışma, Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi tarafından desteklenmiştir (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 ve NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. NMG hibesi (2021R1C1C2009717) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials for construct synthesis
Agarose gel electrophoresis system Advance Mupid-2plus
DNA ladder Bioneer D-1037
nTaq polymerase Enzynomics P050A
PCR purification kit LaboPass CMR0112
PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2 ThermoFisher Scientific 22102 For SNARE–DNA coupling
Primer B Bioneer 5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For 5-kbp force calibration construct and DNA handles
Primer B_hp IDT 5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT
TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'		 For hairpin construct
Primer N Bioneer 5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3' For DNA handles
Primer Z Bioneer 5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3' For DNA handles
Primer Z_5k Bioneer 5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA
TCG-3'		 For 5-kbp force calibration construct
Primer Z_hp Bioneer 5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3' For hairpin construct
SYBR Safe DNA Gel Stain ThermoFisher Scientific S33102
λ-DNA Bioneer D-2510 Template strand for PCR
DNA sequences for SNARE proteins
6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctat
gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg
aagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCACA
GCAGCGGCCTGGTGCCGCGC
GGCAGCCATACTAGCGGAGAT
ATCGCCGAGGACGCAGACAT
GCGCAATGAGCTGGAGGAGA
TGCAGAGGAGGGCTGACCAG
CTGGCTGATGAGTCCCTGGA
AAGCACCCGTCGCATGCTGC
AGCTGGTTGAAGAGAGTAAA
GATGCTGGCATCAGGACTTT
GGTTATGTTGGATGAGCAAG
GCGAACAACTGGAACGCATT
GAGGAAGGGATGGACCAAAT
CAATAAGGACATGAAAGAAG
CAGAAAAGAATTTGACGGAC
CTAGGAAAATTCGCCGGCCT
TGCCGTGGCCCCCGCCAAC
AAGCTTAAATCCAGTGATGC
TTACAAAAAAGCCTGGGGC
AATAATCAGGATGGAGTAGT
GGCCAGCCAGCCTGCCCG
TGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTG
GCTTCATCCGCAGGGTAAC
AAATGATGCCCGGGAAAAT
GAGATGGATGAGAACCTG
GAGCAGGTGAGCGGCATC
ATCGGAAACCTCCGCCAC
ATGGCTCTAGACATGGGCA
ATGAGATTGACACCCAGA
ATCGCCAGATCGACAGGA
TCATGGAGAAGGCTGATT
CCAACAAAACCAGAATTG
ATGAAGCCAACCAACGTG
CAACAAAGATGCTGGGAA
GTGGTTAAggatccgaattcgag
ctccgtcgacaagcttgcggccgcactc
gagcaccaccaccaccaccactgagat
ccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgag
caataactagcataaccccttggggcct
ctaaacgggtcttgaggggttttttgctga
aaggaggaactatatccggat
6×His-tagged VAMP2 (2-97, L32C/I97C; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca
gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGGCAGC
AGCCATCATCATCATCATCAC
AGCAGCGGCCTGGTGCCGC
GCGGCAGCCATATGGCAGAT
CTCTCGGCTACCGCTGCCAC
CGTCCCGCCTGCCGCCCCG
GCCGGCGAGGGTGGCCCCC
CTGCACCTCCTCCAAATCTTA
CCAGTAACAGGAGATGCCAG
CAGACCCAGGCCCAGGTGG
ATGAGGTGGTGGACATCATG
AGGGTGAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAG
CTATCGGAACTGGATGATCG
CGCAGATGCCCTCCAGGCA
GGGGCCTCCCAGTTTGAAA
CAAGTGCAGCCAAGCTCAA
GCGCAAATACTGGTGGAAA
AACCTCAAGATGATGTGCTA
Aggatccgaattcgagctccgtcg
acaagcttgcggccgcactcgagcaccacca
ccaccaccactgagatccggctgctaacaaa
gcccgaaaggaagctgagttggctgctgcca
ccgctgagcaataactagcataaccccttgg
ggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg
ctgaaaggaggaactatatccggat
6×His-tagged ΔN-VAMP2 (49–96; capitalized) and Syntaxin-1A (191–267, I202C/I266C; capitalized) in pETDuet-1 homemade ggggaattgtgagcggataacaattcccctc
tagaaataattttgtttaactttaagaagga
gatataccATGGGCAGCAGCCATCA
TCATCATCATCACAGCAGCGG
CCTGGAAGTTCTGTTCCAGGG
GCCCGGTAATGTGGACAAGGT
CCTGGAGCGAGACCAGAAGCT
ATCGGAACTGGATGATCGCGC
AGATGCCCTCCAGGCAGGGGC
CTCCCAGTTTGAAACAAGTGC
AGCCAAGCTCAAGCGCAAATAC
TGGTGGAAAAACCTCAAGATGAT
GTAAgcggccgcataatgcttaagtcgaaca
gaaagtaatcgtattgtacacggccgcataa
tcgaaattaatacgactcactataggggaat
tgtgagcggataacaattccccatcttagta
tattagttaagtataagaaggagatatacat
ATGGCCCTCAGTGAGATCGAGA
CCAGGCACAGTGAGTGCATC
AAGTTGGAGAACAGCATCCG
GGAGCTACACGATATGTTCAT
GGACATGGCCATGCTGGTGG
AGAGCCAGGGGGAGATGATT
GACAGGATCGAGTACAATGTG
GAACACGCTGTGGACTACGTG
GAGAGGGCCGTGTCTGACACC
AAGAAGGCCGTCAAGTACCAG
AGCAAGGCACGCAGGAAGAA
GTGCATGATCTAActcgagtc
tggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaa
cgccagcacatggactcgtctactagcgcag
cttaattaacctaggctgctgccaccgctga
gcaataactagcataaccccttggggcctct
aaacgggtcttgaggggttttttgctgaaag
gaggaactatatccggattggcgaatgggac
gcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgg
gtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac
acttgccagcgccctagcgcccgctcctttc
gctttcttcccttcctttctcgccacgttcg
ccggctttccccgtcaagctctaaatcgggg
gctccctttagggttccgatttagtgcttta
cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg
gtgatggttcacgtagtgggccatcgccctg
atagacggtttttcgccctttgacgttggag
tccacgttctttaatagtggactcttgttcc
aaactggaacaacactcaaccctatctcggt
ctattcttttgatttataagggattttgccg
atttcggcctattggttaaaaaatgagctga
tttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaa
aatattaacgtttacaatttctggcggcacg
atggcatgagattatcaaaaaggatcttcac
ctagatccttttaaattaaaaatgaagtttt
aaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt
ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtga
ggcacctatctcagcgatctgtctatttcgt
tcatccatagttgcctgactccccgtcgtgt
agataactacgatacgggagggcttaccatc
tggccccagtgctgcaatgataccgcgagac
ccacgctcaccggctccagatttatcagcaa
taaaccagccagccggaagggccgagcgca
gaagtggtcctgcaactttatccgcctccatc
cagtctattaattgttgccgggaagctagag
taagtagttcgccagttaatagtttgcgcaa
cgttgttgccattgctacaggcatcgtggtg
tcacgctcgtcgtttggtatggcttcattca
gctccggttcccaacgatcaaggcgagttac
atgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggtt
agctccttcggtcctccgatcgttgtcagaa
gtaagttggccgcagtgttatcactcatggt
tatggcagcactgcataattctcttactgtc
atgccatccgtaagatgcttttctgtgactg
gtgagtactcaaccaagtcattctgagaata
gtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccg
gcgtcaatacgggataataccgcgccacata
gcagaactttaaaagtgctcatcattggaaa
acgttcttcggggcgaaaactctcaaggatc
ttaccgctgttgagatccagttcgatgtaac
ccactcgtgcacccaactgatcttcagcatc
ttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaa
aacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagg
gaataagggcgacacggaaatgttgaatact
catactcttcctttttcaatcatgattgaag
catttatcagggttattgtctcatgagcgga
tacatatttgaatgtatttagaaaaataaac
aaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtg
agttttcgttccactgagcgtcagaccccgt
agaaaagatcaaaggatcttcttgagatcct
ttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa
caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttg
tttgccggatcaagagctaccaactcttttt
ccgaaggtaactggcttcagcagagcgcaga
taccaaatactgtccttctagtgtagccgta
gttaggccaccacttcaagaactctgtagca
ccgcctacatacctcgctctgctaatcctgt
taccagtggctgctgccagtggcgataagtc
gtgtcttaccgggttggactcaagacgatag
ttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttgga
gcgaacgacctacaccgaactgagataccta
cagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttccc
gaagggagaaaggcggacaggtatccggta
agcggcagggtcggaacaggagagcgcac
gagggagcttccagggggaaacgcctggtatc
tttatagtcctgtcgggtttcgccacctctg
acttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtca
ggggggcggagcctatggaaaaacgccagc
aacgcggcctttttacggttcctggccttttg
ctggccttttgctcacatgttctttcctgcg
ttatcccctgattctgtggataaccgtatta
ccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgc
agccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtg
agcgaggaagcggaagagcgcctgatgcgg
tattttctccttacgcatctgtgcggtatttc
acaccgcatatatggtgcactctcagtacaa
tctgctctgatgccgcatagttaagccagta
tacactccgctatcgctacgtgactgggtca
tggctgcgccccgacacccgccaacacccgc
tgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccg
gcatccgcttacagacaagctgtgaccgtct
ccgggagctgcatgtgtcagaggttttcacc
gtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcgg
taaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgatt
cacagatgtctgcctgttcatccgcgtccag
ctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtc
tggcttctgataaagcgggccatgttaaggg
cggttttttcctgtttggtcactgatgcctc
cgtgtaagggggatttctgttcatgggggta
atgataccgatgaaacgagagaggatgctca
cgatacgggttactgatgatgaacatgcccg
gttactggaacgttgtgagggtaaacaactg
gcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaa
tcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaa
tacagatgtaggtgttccacagggtagccag
cagcatcctgcgatgcagatccggaacataa
tggtgcagggcgctgacttccgcgtttccag
actttacgaaacacggaaaccgaagaccatt
catgttgttgctcaggtcgcagacgttttgc
agcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtat
cggtgattcattctgctaaccagtaaggcaa
ccccgccagcctagccgggtcctcaacgaca
ggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgc
ccaccggaaggagctgactgggttgaaggct
ctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcct
aatgagtgagctaacttacattaattgcgtt
gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaac
ctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggcc
aacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgg
gcgccagggtggtttttcttttcaccagtga
gacgggcaacagctgattgcccttcaccgcc
tggccctgagagagttgcagcaagcggtcca
cgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctg
tttgatggtggttaacggcgggatataacat
gagctgtcttcggtatcgtcgtatcccacta
ccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccgga
ctcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgcc
atctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgg
gaacgatgccctcattcagcatttgcatggt
ttgttgaaaaccggacatggcactccagtcg
ccttcccgttccgctatcggctgaatttgat
tgcgagtgagatatttatgccagccagccag
acgcagacgcgccgagacagaacttaatggg
cccgctaacagcgcgatttgctggtgaccca
atgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgt
accgtcttcatgggagaaaataatactgttg
atgggtgtctggtcagagacatcaagaaata
acgccggaacattagtgcaggcagcttccac
agcaatggcatcctggtcatccagcggatag
ttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcga
gaagattgtgcaccgccgctttacaggcttc
gacgccgcttcgttctaccatcgacaccacc
acgctggcacccagttgatcggcgcgagatt
taatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtg
cagggccagactggaggtggcaacgccaatc
agcaacgactgtttgcccgccagttgttgtg
ccacgcggttgggaatgtaattcagctccgc
catcgccgcttccactttttcccgcgttttc
gcagaaacgtggctggcctggttcaccacgc
gggaaacggtctgataagagacaccggcata
ctctgcgacatcgtataacgttactggtttc
acattcaccaccctgaattgactctcttccg
ggcgctatcatgccataccgcgaaaggtttt
gcgccattcgatggtgtccgggatctcgacg
ctctcccttatgcgactcctgcattaggaag
cagcccagtagtaggttgaggccgttgagca
ccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaagga
gatggcgcccaacagtcccccggccacgggg
cctgccaccatacccacgccgaaacaagcgc
tcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttc
cccatcggtgatgtcggcgatataggcgcca
gcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccgg
ccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagat
cgatctcgatcccgcgaaattaatacgactc
actata
SNAP-25b (1–206, all C to A; capitalized) in pET28a homemade tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca
ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca
gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc
gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt
ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag
ctctaaatcgggggctccctttagggttccg
atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa
aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg
ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc
tttgacgttggagtccacgttctttaatagt
ggactcttgttccaaactggaacaacactca
accctatctcggtctattcttttgatttata
agggattttgccgatttcggcctattggtta
aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg
cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat
ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc
ggaacccctatttgtttatttttctaaatac
attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt
cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa
ctgcaatttattcatatcaggattatcaata
ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg
aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag
gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt
ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta
atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag
tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc
ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt
tccagacttgttcaacaggccagccattacg
ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa
ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga
gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca
attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc
aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt
cacctgaatcaggatattcttctaatacctg
gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg
agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa
aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc
cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct
gtaacatcattggcaacgctacctttgccat
gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt
cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat
tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc
catataaatcagcatccatgttggaatttaa
tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga
atatggctcataacaccccttgtattactgt
ttatgtaagcagacagttttattgttcatga
ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca
ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa
ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg
taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc
gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa
gagctaccaactctttttccgaaggtaactg
gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt
ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac
ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc
tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc
tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg
ttggactcaagacgatagttaccggataagg
cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg
cacacagcccagcttggagcgaacgacctac
accgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa
ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc
ggaacaggagagcgcacgagggagcttcc
agggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt
cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga
tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc
tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt
acggttcctggccttttgctggccttttgct
cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt
ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg
agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc
gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc
ggaagagcgcctgatgcggtattttctccttac
gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat
ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc
cgcatagttaagccagtatacactccgctat
cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg
acacccgccaacacccgctgacgcgccctga
cgggcttgtctgctcccggcatccgcttaca
gacaagctgtgaccgtctccgggagctgcat
gtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaa
cgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcag
cgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgc
ctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttc
tccagaagcgttaatgtctggcttctgataa
agcgggccatgttaagggcggttttttcctg
tttggtcactgatgcctccgtgtaaggggga
tttctgttcatgggggtaatgataccgatga
aacgagagaggatgctcacgatacgggttac
tgatgatgaacatgcccggttactggaacgt
tgtgagggtaaacaactggcggtatggatgc
ggcgggaccagagaaaaatcactcagggtc
aatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggt
gttccacagggtagccagcagcatcctgcga
tgcagatccggaacataatggtgcagggcgc
tgacttccgcgtttccagactttacgaaaca
cggaaaccgaagaccattcatgttgttgctc
aggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgct
tcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattc
tgctaaccagtaaggcaaccccgccagccta
gccgggtcctcaacgacaggagcacgatcat
gcgcacccgtggggccgccatgccggcgata
atggcctgcttctcgccgaaacgtttggtgg
cgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggc
gtgcaagattccgaataccgcaagcgacagg
ccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggt
cctcgccgaaaatgacccagagcgctgccgg
cacctgtcctacgagttgcatgataaagaag
acagtcataagtgcggcgacgatagtcatgc
cccgcgcccaccggaaggagctgactgggtt
gaaggctctcaagggcatcggtcgagatccc
ggtgcctaatgagtgagctaacttacattaa
ttgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc
gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatga
atcggccaacgcgcggggagaggcggtttgc
gtattgggcgccagggtggtttttcttttca
ccagtgagacgggcaacagctgattgccctt
caccgcctggccctgagagagttgcagcaag
cggtccacgctggtttgccccagcaggcgaa
aatcctgtttgatggtggttaacggcgggat
ataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtat
cccactaccgagatatccgcaccaacgcgca
gcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcc
cagcgccatctgatcgttggcaaccagcatc
gcagtgggaacgatgccctcattcagcattt
gcatggtttgttgaaaaccggacatggcact
ccagtcgccttcccgttccgctatcggctga
atttgattgcgagtgagatatttatgccagc
cagccagacgcagacgcgccgagacagaa
cttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctgg
tgacccaatgcgaccagatgctccacgccca
gtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataat
actgttgatgggtgtctggtcagagacatca
agaaataacgccggaacattagtgcaggcag
cttccacagcaatggcatcctggtcatccag
cggatagttaatgatcagcccactgacgcgt
tgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttac
aggcttcgacgccgcttcgttctaccatcga
caccaccacgctggcacccagttgatcggcg
cgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacg
gcgcgtgcagggccagactggaggtggcaac
gccaatcagcaacgactgtttgcccgccagt
tgttgtgccacgcggttgggaatgtaattca
gctccgccatcgccgcttccactttttcccg
cgttttcgcagaaacgtggctggcctggttc
accacgcgggaaacggtctgataagagacac
cggcatactctgcgacatcgtataacgttac
tggtttcacattcaccaccctgaattgactc
tcttccgggcgctatcatgccataccgcgaa
aggttttgcgccattcgatggtgtccgggat
ctcgacgctctcccttatgcgactcctgcat
taggaagcagcccagtagtaggttgaggccg
ttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcat
gcaaggagatggcgcccaacagtcccccggc
cacggggcctgccaccatacccacgccgaaa
caagcgctcatgagcccgaagtggcgagccc
gatcttccccatcggtgatgtcggcgatata
ggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtg
atgccggccacgatgcgtccggcgtagagga
tcgagatctcgatcccgcgaaattaatacga
ctcactataggggaattgtgagcggataaca
attcccctctagaaataattttgtttaactt
taagaaggagatataccATGGCCGA
GGACGCAGACATGCGCAATG
AGCTGGAGGAGATGCAGAGG
AGGGCTGACCAGCTGGCTGA
TGAGTCCCTGGAAAGCACCC
GTCGCATGCTGCAGCTGGTT
GAAGAGAGTAAAGATGCTGG
CATCAGGACTTTGGTTATGTT
GGATGAGCAAGGCGAACAAC
TGGAACGCATTGAGGAAGGG
ATGGACCAAATCAATAAGGAC
ATGAAAGAAGCAGAAAAGAAT
TTGACGGACCTAGGAAAATTC
GCCGGCCTTGCCGTGGCCCC
CGCCAACAAGCTTAAATCCAG
TGATGCTTACAAAAAAGCCTG
GGGCAATAATCAGGATGGAGT
AGTGGCCAGCCAGCCTGCCC
GTGTGGTGGATGAACGGGAG
CAGATGGCCATCAGTGGTGGC
TTCATCCGCAGGGTAACAAAT
GATGCCCGGGAAAATGAGATG
GATGAGAACCTGGAGCAGGT
GAGCGGCATCATCGGAAACCT
CCGCCACATGGCTCTAGACAT
GGGCAATGAGATTGACACCCA
GAATCGCCAGATCGACAGGAT
CATGGAGAAGGCTGATTCCAA
CAAAACCAGAATTGATGAAGC
CAACCAACGTGCAACAAAGAT
GCTGGGAAGTGGTTAA
ctcgagcaccaccaccaccaccactgag
atccggctgctaacaaagcccgaaagga
agctgagttggctgctgccaccgctgagc
aataactagcataaccccttggggcctc
taaacgggtcttgaggggttttttgctgaa
aggaggaactatatccggat
Materials for protein purificaiton
2-Mercaptoethanol SIGMA M3148-25ML
Agar LPS Solution AGA500
Ampicillin, Sodium salt PLS AC1043-005-00
Chloramphenicol PLS CR1023-050-00
Competent cells (E. coli) Novagen 70956 Rosetta(DE3)pLysS
Glycerol SIGMA G5516-500ML
HEPES SIGMA H4034-100G
Hydrochloric acid / HCl SIGMA 320331-500ML
Imidazole SIGMA I2399-100G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside / IPTG SIGMA 10724815001
Kanamycin Sulfate PLS KC1001-005-02
Luria-Bertani (LB) Broth LPS Solution LB-05
Ni-NTA resin Qiagen 30210
PD MiniTrap G-25 (desalting column) Cytiva GE28-9180-07 For instructions, see: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/chromatography/prepacked-columns/desalting-and-buffer-exchange/pd-minitrap-desalting-columns-with-sephadex-g-25-resin-p-06174
Phenylmethylsulfonyl fluoride / PMSF ThermoFisher Scientific 36978
Plasmids for SNARE proteins cloned in house N/A Available upon request
Protease inhibitor cocktail genDEPOT P3100
Sodium chloride SIGMA S5886-500G
Sodium phosphate dibasic / Na2HPO4 SIGMA S7907-100G
Sodium phosphate monobasic / NaH2PO4 SIGMA S3139-250G
Tris(2-carboxyethyl)phosphine / TCEP SIGMA C4706-2G
Trizma base SIGMA T1503-250G
Materials for sample assembly
Biotin-PEG-SVA LAYSAN BIO BIO-PEG-SVA-5K-100MG & MPEG-SVA-5K-1g For PEGylation
Dibenzocyclooctyne-amine / DBCO-NH2 SIGMA 761540-10MG For bead coating
Double-sided tape 3M 136 For flow cell assembly
Epoxy glue DEVCON S-208 For flow cell assembly
Glass coverslip for bottom surface VWR 48393-251 Rectangular, 60×24 mm, #1.5
Glass coverslip for top surface VWR 48393-241 Rectangular, 50×24 mm, #1.5
Magnetic bead ThermoFisher Scientific 14301 Dynabeads M-270 Epoxy, 2.8 μm
mPEG-SVA LAYSAN BIO mPEG-SVA 1g For PEGylation
N,N-Dimethylformamide / DMF SIGMA D4551-250ML For bead coating
N-[3-(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine SIGMA 104884-100ML For PEGylation
Neutravidin ThermoFisher Scientific 31000 For sample tethering
Phosphate buffered saline / PBS, pH 7.2 PLS PR2007-100-00
Plastic syringe Norm-ject A5 5 ml, luer tip
Polyethylene Tubing SCI BB31695-PE/4 PE-60
Reference bead SPHEROTECH SVP-30-5 Streptavidin-coated Polystyrene Particles; 3.0-3.4 µm
Syringe needle Kovax 21G-1 1/4'' 21 G
Syringe pump KD SCIENTIFIC 788210
Equipment for magnetic tweezer instrument
1-axis motorized microtranslation stage PI M-126.PD1 For vertical positioning of magnets
2-axis manual translation stage ST1 LEE400 For alignment of magnets to the optical axis
Acrylic holder for magnets DaiKwang Precision custum order Drawing available upon request
Frame grabber Active Silicon AS-FBD-4XCXP6-2PE8
High-speed CMOS camera Mikrotron EoSens 3CXP
Inverted microscope Olympus IX73P2F-1-2
Neodymium magnets LG magnet ND 10x10x12t Dimension: 10 mm × 10 mm × 12 mm; two needed
Objective lens Olympus UPLXAPO100XO Oil-immersion, NA 1.45
Objective lens nanopositioner Mad City Labs Nano-F100S
Rotation stepper motor AUTONICS A3K-S545W For rotating magnets
Superluminescent diode QPHOTONICS QSDM-680-2 680 nm
Software
LabVIEW National Instruments v20.0f1
MATLAB MathWorks v2021a

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le, S., Liu, R., Lim, C. T., Yan, J. Uncovering mechanosensing mechanisms at the single protein level using magnetic tweezers. Methods. 94, 13-18 (2016).
  2. Choi, H. -K., Kim, H. G., Shon, M. J., Yoon, T. -Y. High-resolution single-molecule magnetic tweezers. Annual Review of Biochemistry. 91 (1), 33-59 (2022).
  3. Yang, T., Park, C., Rah, S. -H., Shon, M. J. Nano-precision tweezers for mechanosensitive proteins and beyond. Molecules and Cells. 45 (1), 16-25 (2022).
  4. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  5. De Vlaminck, I., Dekker, C. Recent advances in magnetic tweezers. Annual Review of Biophysics. 41 (1), 453-472 (2012).
  6. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nature Reviews Methods Primers. 1, 25 (2021).
  7. Gosse, C., Croquette, V. Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level. Biophysical Journal. 82 (6), 3314-3329 (2002).
  8. Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
  9. Lansdorp, B. M., Tabrizi, S. J., Dittmore, A., Saleh, O. A. A high-speed magnetic tweezer beyond 10,000 frames per second. Review of Scientific Instruments. 84 (4), 044301 (2013).
  10. Cnossen, J. P., Dulin, D., Dekker, N. H. An optimized software framework for real-time, high-throughput tracking of spherical beads. Review of Scientific Instruments. 85 (10), 103712 (2014).
  11. Dulin, D., et al. High spatiotemporal-resolution magnetic tweezers: calibration and applications for DNA dynamics. Biophysical Journal. 109 (10), 2113-2125 (2015).
  12. Huhle, A., et al. Camera-based three-dimensional real-time particle tracking at kHz rates and Ångström accuracy. Nature Communications. 6 (1), 5885 (2015).
  13. Popa, I., et al. A HaloTag anchored ruler for week-long studies of protein dynamics. Journal of the American Chemical Society. 138 (33), 10546-10553 (2016).
  14. Shon, M. J., Kim, H., Yoon, T. -Y. Focused clamping of a single neuronal SNARE complex by complexin under high mechanical tension. Nature Communications. 9 (1), 3639 (2018).
  15. Tapia-Rojo, R., Eckels, E. C., Fernández, J. M. Ephemeral states in protein folding under force captured with a magnetic tweezers design. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7873-7878 (2019).
  16. Löf, A., et al. Multiplexed protein force spectroscopy reveals equilibrium protein folding dynamics and the low-force response of von Willebrand factor. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (38), 18798-18807 (2019).
  17. Tapia-Rojo, R., Alonso-Caballero, A., Fernandez, J. M. Direct observation of a coil-to-helix contraction triggered by vinculin binding to talin. Science Advances. 6 (21), (2020).
  18. Rieu, M., et al. Parallel, linear, and subnanometric 3D tracking of microparticles with Stereo Darkfield Interferometry. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Rieu, M., Valle-Orero, J., Ducos, B., Allemand, J. -F., Croquette, V. Single-molecule kinetic locking allows fluorescence-free quantification of protein/nucleic-acid binding. Communications Biology. 4 (1), 1083 (2021).
  20. Woodside, M. T., et al. Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (16), 6190-6195 (2006).
  21. Camunas-Soler, J., Ribezzi-Crivellari, M., Ritort, F. Elastic properties of nucleic acids by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 45 (1), 65-84 (2016).
  22. Südhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323 (5913), 474-477 (2009).
  23. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337 (6100), 1340-1343 (2012).
  24. Zorman, S., et al. Common intermediates and kinetics, but different energetics, in the assembly of SNARE proteins. eLife. 3, e03348 (2014).
  25. Zhang, Y., Hughson, F. M. Chaperoning SNARE folding and assembly. Annual Review of Biochemistry. 90 (1), 581-603 (2021).
  26. Vilfan, I. D., Lipfert, J., Koster, D. A., Lemay, S. G., Dekker, N. H. Magnetic tweezers for single-molecule experiments. Handbook of Single-Molecule Biophysics. , Springer. New York, NY. 371-395 (2009).
  27. You, H., Le, S., Chen, H., Qin, L., Yan, J. Single-molecule manipulation of G-quadruplexes by magnetic tweezers. Journal of Visualized Experiments. (127), e56328 (2017).
  28. Lipfert, J., Hao, X., Dekker, N. H. Quantitative modeling and optimization of magnetic tweezers. Biophysical Journal. 96 (12), 5040-5049 (2009).
  29. Dulin, D., Barland, S., Hachair, X., Pedaci, F. Efficient illumination for microsecond tracking microscopy. PLoS One. 9 (9), e107335 (2014).
  30. Klaue, D., Seidel, R. Torsional stiffness of single superparamagnetic microspheres in an external magnetic field. Physical Review Letters. 102 (2), 028302 (2009).
  31. Shon, M. J., Rah, S. -H., Yoon, T. -Y. Submicrometer elasticity of double-stranded DNA revealed by precision force-extension measurements with magnetic tweezers. Science Advances. 5 (6), 1697 (2019).
  32. Czerwinski, F., Richardson, A. C., Oddershede, L. B. Quantifying noise in optical tweezers by Allan variance. Optics Express. 17 (15), 13255-13269 (2009).
  33. Lansdorp, B. M., Saleh, O. A. Power spectrum and Allan variance methods for calibrating single-molecule video-tracking instruments. Review of Scientific Instruments. 83 (2), 025115 (2012).
  34. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. High spatiotemporal resolution data from a custom magnetic tweezers instrument. Data in Brief. 30, 105397 (2020).
  35. Yu, Z., et al. A force calibration standard for magnetic tweezers. Review of Scientific Instruments. 85 (12), 123114 (2014).
  36. Strick, T. R., Allemand, J. -F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. Science. 271 (5257), 1835-1837 (1996).
  37. Daldrop, P., Brutzer, H., Huhle, A., Kauert, D. J., Seidel, R. Extending the range for force calibration in magnetic tweezers. Biophysical Journal. 108 (10), 2550-2561 (2015).
  38. te Velthuis, A. J. W., Kerssemakers, J. W. J., Lipfert, J., Dekker, N. H. Quantitative guidelines for force calibration through spectral analysis of magnetic tweezers data. Biophysical Journal. 99 (4), 1292-1302 (2010).
  39. Ostrofet, E., Papini, F. S., Dulin, D. Correction-free force calibration for magnetic tweezers experiments. Scientific Reports. 8 (1), 15920 (2018).
  40. Seol, Y., Li, J., Nelson, P. C., Perkins, T. T., Betterton, M. D. Elasticity of short DNA molecules: theory and experiment for contour lengths of 0.6-7 µm. Biophysical Journal. 93 (12), 4360-4373 (2007).
  41. Burnham, D. R., Vlaminck, I. D., Henighan, T., Dekker, C. Skewed Brownian fluctuations in single-molecule magnetic tweezers. PLoS One. 9 (9), 108271 (2014).
  42. Paul, T., Myong, S. Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements. STAR Protocols. 3 (1), 101152 (2022).
  43. Lee, H. -W., et al. Profiling of protein-protein interactions via single-molecule techniques predicts the dependence of cancers on growth-factor receptors. Nature Biomedical Engineering. 2 (4), 239-253 (2018).
  44. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles. Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  45. Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nature Methods. 9 (7), 724-726 (2012).
  46. Woodside, M. T., Block, S. M. Reconstructing folding energy landscapes by single-molecule force spectroscopy. Annual Review of Biophysics. 43 (1), 19-39 (2014).
  47. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophysical Journal. 72 (4), 1541-1555 (1997).
  48. Zhang, Y. Energetics, kinetics, and pathway of SNARE folding and assembly revealed by optical tweezers. Protein Science. 26 (7), 1252-1265 (2017).
  49. Chen, H., et al. Improved high-force magnetic tweezers for stretching and refolding of proteins and short DNA. Biophysical Journal. 100 (2), 517-523 (2011).
  50. Cho, S., et al. Tension exerted on cells by magnetic nanoparticles regulates differentiation of human mesenchymal stem cells. Biomaterials Advances. 139, 213028 (2022).
  51. Shon, M. J., Cohen, A. E. Nano-mechanical measurements of protein-DNA interactions with a silicon nitride pulley. Nucleic Acids Research. 44 (1), 7 (2016).
  52. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  53. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  54. Neupane, K., et al. Direct observation of transition paths during the folding of proteins and nucleic acids. Science. 352 (6282), 239-242 (2016).
  55. Choi, H. -K., et al. Watching helical membrane proteins fold reveals a common N-to-C-terminal folding pathway. Science. 366 (6469), 1150-1156 (2019).
  56. Kim, C., et al. Extreme parsimony in ATP consumption by 20S complexes in the global disassembly of single SNARE complexes. Nature Communications. 12 (1), 3206 (2021).

Tags

JoVE'de Bu Ay Sayı 195 yüksek hızlı manyetik cımbız tek moleküllü kuvvet spektroskopisi DNA saç tokası SNARE kompleksi
Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, … More

Park, C., Yang, T., Rah, S. H., Kim, H. G., Yoon, T. Y., Shon, M. J. High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements. J. Vis. Exp. (195), e65137, doi:10.3791/65137 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter