Verticale immobilisatiemethode voor time-lapse microscopieanalyse in filamenteuze cyanobacteriën

Summary

We presenteren een eenvoudige en toegankelijke methode voor filamenteuze cyanobacteriële visualisatie in het XY-vlak. Er werd een agarosematrix met een laag smeltpunt gebruikt, waardoor beelden van eiwitten die betrokken zijn bij de deling, in een verticale oriëntatie konden worden verkregen. Daarom kan deze methodologie worden toegepast op elk filamenteus organisme en verschillende soorten eiwitten.

Abstract

Een belangrijke gebeurtenis bij bacteriële celdeling is het septatieproces, waarbij het eiwit FtsZ het belangrijkste element is. FtsZ polymeriseert en vormt een ringachtige structuur (Z-ring) in het midden van de cel die dient als steiger voor andere delingseiwitten. Superresolutiemicroscopie in bacteriële modellen Escherichia coli en Bacillus subtilis toonden aan dat de Z-ring discontinu is, terwijl live cell imaging-studies aantoonden dat FtsZ langs de ring beweegt door een mechanisme dat bekend staat als loopband. Om de dynamica van FtsZ in vivo te bestuderen, is een speciale celplaatsing in een verticale positie nodig om de volledige structuur van de ring in het XY-vlak in beeld te brengen. In het geval van FtsZ-beeldvorming in meercellige cyanobacteriën, zoals Anabaena sp. PCC7120, is het een uitdaging om de filamenten in een verticale positie te houden vanwege de grootte van de cellen en de lengte van de filamenten. In dit artikel beschrijven we een methode die de verticale immobilisatie van Anabaena sp. PCC 7120-filamenten mogelijk maakt met behulp van agarose met een laag smeltpunt en spuiten, om de Z-ring vast te leggen in een mutant die een FtsZ-sfGFP-fusie-eiwit tot expressie brengt. Deze methode is een snelle en goedkope manier om eiwitdynamica op de delingsplaats te registreren met behulp van confocale microscopie.

Introduction

Bacteriële celdeling is het proces waarbij een moedercel twee dochtercellen genereert, in de meeste gevallen door het mechanisme dat bekend staat als binaire splijting. Een van de vroegste gebeurtenissen in het septatieproces is de lokalisatie van FtsZ in het midden van de cel¹. Dit eiwit, dat structureel homoloog is aan tubuline², is geconserveerd en wijd verspreid in de meeste bacteriën, en de polymerisatie ervan genereert een contractiele structuur die bekend staat als de Z-ring³. Deze ring dient als een steiger voor andere delingseiwitten en samen vormen ze een moleculaire machinerie die een divisoom wordt genoemd. Verschillende studies hebben aangetoond dat de Z-ring zeer dynamisch is en dat FtsZ-protofilamenten bewegen door loopband ^4,5,6. Om de Z-ring in time-lapse-experimenten te bestuderen, is het raadzaam om de delingsplaats in het XY-vlak vast te leggen voor een betere resolutie en snelle bemonstering. Om dit te bereiken, is het noodzakelijk om verticale celimmobilisatiemethoden te ontwikkelen die gewoonlijk de nanofabricage van microgatcelvallen en complexe microfluïdische apparaten omvatten⁷.

Cyanobacteriën zijn fotosynthetische micro-organismen die door hun cellulaire morfologie als gramnegatief worden geclassificeerd. Fylogenetisch staan ze echter dichter bij grampositieve bacteriën⁸. Deze organismen hebben celdelingsgenen die veel voorkomen in grampositieve en gramnegatieve bacteriën, maar hun divisoom bevat ook unieke elementen⁹. Anabaena sp. PCC 7120 (hierna Anabaena sp.) is filamenteuze cyanobacteriën met één delingsvlak en is een model voor de studie van celdeling in meercellige cyanobacteriën. In deze stam is het mogelijk geweest om de positionering van FtsZ in het midden van de cellen^{te bepalen 10}. Toch zijn er geen studies die de in vivo dynamiek van FtsZ in dit model aantonen. In ons laboratorium verkregen we door triparentale paring en homologe recombinatie een volledig gescheiden mutant van Anabaena sp. die het FtsZ-eiwit tot expressie brengt dat is gefuseerd met sfGFP, dat het volledige endogene ftsZ-gen verving. We ontwikkelden een snelle en eenvoudige celimmobilisatiemethode die de verticale oriëntatie van de mutante stamfilamenten bevordert voor time-lapse-experimenten om de delingseiwitten in filamenteuze cyanobacteriën te visualiseren. Deze methode heeft geen microfluïdische apparaten nodig die duur en moeilijk te ontwikkelen kunnen zijn. Als voorbeeld gebruikten we dit protocol om de Z-ring in de FtsZ-sfGFP-mutant te visualiseren door confocale microscopie.

Protocol

1. Overwegingen en selectie van het cellulaire model

OPMERKING: Cyanobacteriën hebben een sterke autofluorescentie als gevolg van de aanwezigheid van fotosynthetische pigmenten. Dit signaal bevindt zich in het rode deel van het spectrum, daarom zijn de fluorescerende eiwitten die geschikt zijn voor beeldvorming in cyanobacteriën degenen die ver van de rode emissie verwijderd zijn. Bijvoorbeeld GFP, YFP, Venus, Turquoise en BFP.

1. Selecteer een divisoomcomponent die aanwezig is in de doelfilamenteuze cyanobacteriestam. Voor de experimenten is het noodzakelijk om een filamenteuze cyanobacteriële mutant te construeren die de geselecteerde divisoomcomponent tot expressie brengt die is gefuseerd tot een fluorescerend eiwit. In dit protocol staat een Anabaena sp. mutant die FstZ-sfGFP uitdrukt, als voorbeeld. Deze stam werd verkregen door triparentale paring met E. coli¹¹.
2. Controleer het segregatieniveau van de mutant die zal worden gebruikt. In het voorbeeld werd de segregatie bepaald door PCR-amplificatie van het doelgen. De FtsZ-sfGFP-mutant die in dit protocol wordt gebruikt, is een volledig gescheiden stam die het wild-type ftsZ-gen mist.

2. Groeicondities

1. Maak een verse subcultuur van de mutant met behulp van 10 ml cultuur in stationaire fase (gekweekt gedurende ongeveer 14 dagen in constant licht, bij 25 ° C , voor Anabaena sp.) en voeg toe aan 90 ml BG11 medium aangevuld met antibiotica (Spectinomycine en Streptomycine 10 μl ml-1 voor de FtsZ-sfGFP-mutant).
2. Kweek de nieuwe celcultuur in constant licht en op de optimale temperatuur totdat de exponentiële fase is bereikt. De FtsZ-sfGFP mutant van Anabaena sp. wordt gedurende 7 dagen vóór de monstervoorbereiding bij 25 °C gekweekt.

3. Monstervoorbereiding in een agarosematrix

1. Neem 2 ml van de gehomogeniseerde groeicultuur.
2. Centrifugeer op 2.500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
3. Verwarm ondertussen in een kolf van 50 ml 30 ml agarose met een laag smeltpunt van 3% in vloeibaar BG11-medium. Gebruik een magnetron die is ingesteld op het gemiddelde vermogensniveau en controleer de oplossing elke 15 s totdat deze volledig is opgelost. Zet apart om af te koelen tot 37 °C.
   OPMERKING: Autoclaaf de oplossing van agarose om besmetting te voorkomen.
4. Zodra de centrifugatie is voltooid, gooit u 1,9 ml van het supernatant weg en resuspenseert u de cellen in het resterende volume door ten minste drie keer op en neer te pipetteren.
5. Meng de geresuspendeerde cellen met 900 μL van de 3% agarose-oplossing door minstens drie keer op en neer te pipetteren.
   OPMERKING: De agarose-oplossing moet vloeibaar zijn, maar niet te heet om celbeschadiging te voorkomen. De volgende stap moet snel worden uitgevoerd en voordat de agarose-oplossing een gelachtige consistentie vormt =.
6. Zuig de agarosematrix voorzichtig op in een spuit van 1 ml. Het is belangrijk om het ontstaan van bubbels te voorkomen terwijl het monster met de spuit wordt aangezogen.
   OPMERKING: Zorg er voor deze stap voor dat de punt van de spuit is gesneden om het smalle toegangsgat te elimineren.
7. Laat het monster-agarosemengsel stollen door de spuit gedurende 2 uur in de horizontale positie bij kamertemperatuur te plaatsen.
8. Verwijder de agarosematrix voorzichtig met behulp van de zuiger en leg deze op een schoon en vlak oppervlak.
9. Snijd het gestolde monster in plakjes, in een diktebereik van 0,5 - 1 mm, met behoud van de integriteit van de matrix.
   OPMERKING: Voor betere resultaten, snijd de agarose matrix met behulp van een scalpel of dunne scheermesjes.
10. Leg de plakjes naast elkaar op een coverslip. Het aantal schijven op een coverslip is afhankelijk van de afmetingen.
    OPMERKING: Voor time-lapse microscopie wordt aanbevolen om een celkamer te gebruiken die is gemaakt voor microscopie-analyse (bijv. Attofluor- of Chamlide-magnetische kamers). Deze kamers maken het mogelijk om het monster te verkrijgen en uitdroging te voorkomen. In dit voorbeeld worden de monsters geprepareerd op afgeronde dekstroken (25 mm) met behulp van de Attofluor-kamer.
11. Voeg 2 ml gesmolten 3% agarose-oplossing toe aan het monster dat in de kamer is geplaatst om uitdroging te voorkomen.
12. Wacht tot de agarose-oplossing volledig is gestold om een gel te vormen.

4. Beeldacquisitie

1. Standaardiseer de parameters om het fluorescerende eiwit van belang in de mutante stam in een confocale microscoop te visualiseren. Zorg ervoor dat de microscoop zowel de autofluorescentie als de geselecteerde fluorescerende marker kan detecteren.
2. Visualiseer het monster in de heldere veldconformatie met maximale vergroting en zoek een verticaal georiënteerde gloeidraad zoals weergegeven in figuur 1.
3. Zoek de divisiesite van belang met een eerste scan met behulp van het autofluorescentiesignaal langs het Z-vlak.
4. Gebruik de parameters van de fluorescerende eiwitmarker om het signaal van het eiwit van belang op de delingslocatie te visualiseren.
5. Voer time-lapse-experimenten uit volgens het biologische model en het eiwit van belang. In dit geval werden bijvoorbeeld time-lapse-experimenten van 10 s in 50 s uitgevoerd om de dynamiek van FtsZ langs de Z-ring in Anabaena sp. vast te leggen (figuur 2).

Representative Results

Visualisatie van de Z-ring in Anabaena sp. met behulp van de verticale immobilisatiemethode
Om de dynamiek van Z-ringcomponenten in bacteriën te bestuderen, is het noodzakelijk om afbeeldingen in verticaal georiënteerde cellen te verkrijgen. In deze positie is het mogelijk om de Z-ring en de belangrijkste eiwitten van het divisoom te visualiseren om de eiwitdynamiek te volgen door middel van time-lapse microscopie. De klassieke monstervoorbereiding voor bacteriën werkt niet voor filamenteuze cyanobacteriën. In het geval van Anabaena sp. zijn de filamenten georiënteerd in een positie die het niet mogelijk maakt om de Z-ring te visualiseren. Bovendien is het niet mogelijk om de filamenten geïmmobiliseerd te houden voor een correcte visualisatie van celdelingseiwitten in een enkele cel gedurende langere tijd. Om de Z-ringen van de FtsZ-sfGFP-mutant in Anabaena sp te visualiseren, hebben we daarom een protocol ontwikkeld en gestandaardiseerd met behulp van LMP-agarose en horizontale incubatie van het monster. Dit protocol maakt het mogelijk om een hoger aandeel verticaal georiënteerde filamenten te verkrijgen in vergelijking met eerder gebruikte procedures (figuur 1). Daarom was het mogelijk om de Z-ring in het XY-vlak vast te leggen in cellen van de gemuteerde stam bij direct contact met de coverslip (figuur 2A).

Z-ringdynamica in de FtsZ-sfGFP Anabaena sp. mutant met behulp van de verticale immobilisatiemethode
Na het testen van de verticale immobilisatiemethode in conventionele confocale microscopie, werden monsters van de FtsZ-sfGFP Anabaena sp-mutant bereid met hetzelfde protocol gevisualiseerd door Airyscan microscopie. Met deze techniek hebben we minder fotobleking in de ringen waargenomen en daarom kunnen de experimenten gedurende langere perioden worden uitgevoerd zonder het fluorescentiesignaal te verliezen. In feite waren we in staat om beelden te verkrijgen voor perioden van ongeveer 16,5 minuten, met acquisitie van beelden om de 10 s met lage fotobleaching, waardoor we variaties in fluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd in verschillende regio's van de Z-ring konden detecteren (figuur 2B).

Figuur 1. Visualisatie van Anabaena sp. filamenten met behulp van de verticale immobilisatiemethode. Een monster van Anabaena sp. werd horizontaal geïncubeerd in LMP agarose 3% in BG11 in een spuit. Het monster werd vervolgens in schijven gesneden en uiteindelijk in de celkamer geplaatst. De visualisatie van de cellen werd uitgevoerd met behulp van een omgekeerde microscoop. (A) Representatieve brightfieldmicroscopie van een monster geïncubeerd in de agarosematrix zonder de verticale immobilisatiemethode uit te voeren. Deze afbeelding laat zien dat de meeste filamenten horizontaal georiënteerd zijn. Schaalbalk = 20 μm. (B) Representatieve brightfieldmicroscopie die een hoog aandeel verticaal georiënteerde filamenten van Anabaena sp. toont na gebruik van de verticale immobilisatiemethode. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Visualisatie van de Z-ring in verticaal georiënteerde filamenten van Anabaena sp. met behulp van de verticale immobilisatiemethode. Om de Z-ringen in het XY-vlak weer te geven, werden de cellen van de sfGFP-FtsZ-stam geïncubeerd in LMP-agarose 3% bij 25 °C volgens de verticale immobilisatiemethode (A.I). Brightfield microscopie toont een filament van de mutant in een verticale positie. Schaalbalk =10 μm. (A.II) Het FtsZ-sfGFP-signaal in een Z-ring van de gloeidraad weergegeven in (A.I ). Dit beeld is de gemiddelde intensiteit van 6 foto's die elke 10 s gedurende 1 minuut worden genomen. Schaalbalk = 2 μm (B) FtsZ-sfGFP-signaal van de Z-ring opgenomen om de 10 s gedurende 50 s in de cellen van de FtsZ-sfGFP-mutant verticaal georiënteerd in de BG11-agarosematrix. Tijd (seconden) wordt aangegeven in de linkerbovenhoek van elke afbeelding. Het is mogelijk om de Z-ring en een cluster van FtsZ-sfGFP waar te nemen die in de loop van de tijd van positie verandert (witte pijlen). Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De studie van de dynamiek van divisoomeiwitten is zonder twijfel een uitdaging. Met name bij filamenteuze cyanobacteriën is een van de uitdagingen de visualisatie van de Z-ring in het horizontale vlak, waarvoor de cellen verticaal georiënteerd moeten zijn. De methode die we hier hebben beschreven, maakt het mogelijk om de positie van de Z-ring in het XY-vlak uit te voeren van de verschillende analyses. Dit is de eerste eenvoudige methode voor filamenteuze cyanobacteriën die de volledige visualisatie van de Z-ring mogelijk maakt.

Hoewel dit protocol eenvoudig en snel is, moet speciale zorg worden besteed aan de monstervoorbereidingsstap in de agarosematrix, omdat de agarose met een laag smeltpunt op een geschikte temperatuur moet zijn om vloeibaar genoeg te zijn om met de celoplossing te mengen. Tegelijkertijd kan de agarose-oplossing niet te warm zijn, omdat deze celbeschadiging kan veroorzaken. Een andere cruciale stap om te overwegen is het snijden van de schijven, want als het niet zorgvuldig wordt gedaan, kan de matrix instorten en het monster beschadigen.

Bij deze methode is het aandeel filamenten in de verticale positie hoger dan bij het klassieke protocol. Het is echter noodzakelijk om zoveel mogelijk schijven te snijden om de statistische analyse te garanderen, d.w.z. meerdere filamenten in een verticale positie.

In vergelijking met andere methoden, waarbij eencellige studies in microfluïdische systemen kunnen worden uitgevoerd, is onze methode eenvoudiger, sneller en goedkoper en vereist alleen materialen en reagentia die gemakkelijk beschikbaar zijn in elk laboratorium. Aan de andere kant, hoewel microfluïdische systemen op grote schaal worden gebruikt in meercellige cyanobacteriënstudies, hebben ze voor zover wij weten het probleem van celpositionering in een verticale positie^{niet opgelost 12}.

Een beperking van de techniek is dat de oriëntatie niet altijd perfect is. Dit komt omdat we gekantelde filamenten in de agarosematrix hebben gezien, maar met de vorige screening met behulp van autofluorescentiesignaal is het mogelijk om dit artefact te identificeren. Ook konden we geen volledige divisiegebeurtenis visualiseren, omdat dit protocol de visualisatie van de divisiesite tot 1 uur mogelijk maakt, terwijl de divisietijd van Anabaena sp. ongeveer 12 uur is. Dit protocol kan echter nuttig zijn om een volledige delingsgebeurtenis in snelgroeiende bacteriën vast te leggen.

Hoewel onze methode gestandaardiseerd was voor Anabaena sp. kan het worden toegepast op alle filamenteuze cyanobacteriën of filamenteuze organismen, om niet alleen FtsZ te bestuderen, maar ook andere eiwitten die verband houden met het divisoom, omdat ze in hetzelfde XY-vlak zullen worden georiënteerd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringe	Qingdao Agna Medical Technology Co., Ltd.	-	The disposable medical plastic syringe with 1 ml needle generally used to pump liquid or injection liquid, in this experiment it is used to suck the sample and make it polymerize.
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	The Attofluor Cell Camera is a durable and practical coverslip holder designed for viewing live cell samples in upright or inverted microscopes.
Axygen MaxyGene II Thermal Cycler with 96 well block	CORNING	THERM-1001	The new MaxyGene II Thermal Cycler increased speed and advanced features, providing the premium performance you have come to expect from Axygen brand products. Unique flexible programming. Rapid run times. Improved workflow over traditional gradient cyclers. Ramping rates up to 5°C/sec. Adjustable heated lid accommodates strips, tubes and microplates.
Fisherbrand Cover Glasses: Circles	ThermoFischer Scientific	12-546-2P	Made of finest optical borosilicate glass, with uniform thickness and size. Circular shape. Corrosion-resistant.
Low Melting Point agarose	Promega	V3841	Agarose, Low Melting Point, Analytical Grade, is ideal for applications that require recovery of intact DNA fragments after gel electrophoresis.
LSM 880 microscope from Zeiss Airyscan	Zeiss	-	The Zeiss Airyscan LSM 880 microscope is a laser scanning focal microscope that can acquire images under the resolution limit (lateral resolution ~ 120nm and axial resolution ~ 350nm). The detectors are highly sensitive making it possible to acquire super-resolution images at high speed.
Microcentrífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	Speed up routine sample preparation processes up to 17,000 × g with our standard microcentrifuge, available with refrigeration. These microcentrifuges offer productivity, versatility, safety and convenience in an easy-to-use, compact design laboratory instrument.
Nikon Timelapse Microscope	Nikon	-	The Nikon C2 laser scanning confocal microscope is an ideal microscope for long-term timelapse, because thanks to its incubation chamber it is possible to keep samples in optimal conditions for more than 8 hours.
Thin razor blades Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	The thin razor blades is used to cut the agarose matrix, allowing us to obtain the disks with the sample while maintaining the integrity of the matrix.