Optisk clearing og mærkning til lysarkfluorescensmikroskopi i storskala menneskelig hjernebilleddannelse
Summary
Denne protokol giver en trinvis procedure til hurtig og samtidig optisk clearing, muti-round mærkning og 3D volumetrisk rekonstruktion af snesevis af postmortem menneskelige hjernesektioner ved at kombinere (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]) kort vævstransformationsteknik med lysarkfluorescensmikroskopi billeddannelse i en rutinemæssig high-throughput protokol.
Abstract
På trods af de mange rydningsteknikker, der opstod i det sidste årti, er behandling af menneskelige hjerner efter slagtning fortsat en udfordrende opgave på grund af dens dimensioner og kompleksitet, hvilket gør billeddannelse med mikrometeropløsning særlig vanskelig. Dette papir præsenterer en protokol til at udføre rekonstruktionen af volumetriske dele af den menneskelige hjerne ved samtidig at behandle snesevis af sektioner med vævstransformationsprotokollen SHORT (SWITCH – H2O2 – Antigen Retrieval – 2,2′-thiodiethanol [TDE]), som muliggør clearing, mærkning og sekventiel billeddannelse af prøverne med lysarkfluorescensmikroskopi (LSFM). SHORT giver hurtig vævsrensning og homogen multimærkning af tykke skiver med flere neuronale markører, hvilket muliggør identifikation af forskellige neuronale subpopulationer i både hvid og grå substans. Efter rydning afbildes skiverne via LSFM med mikrometeropløsning og i flere kanaler samtidigt for en hurtig 3D-rekonstruktion. Ved at kombinere SHORT med LSFM-analyse inden for en rutinemæssigt høj gennemstrømningsprotokol er det muligt at opnå 3D-cytoarkitekturrekonstruktion af store volumetriske områder ved høj opløsning på kort tid, hvilket muliggør omfattende strukturel karakterisering af den menneskelige hjerne.
Introduction
Analyse af 3D-molekylær organisation og cytoarkitektur af store mængder af den menneskelige hjerne kræver optisk gennemsigtighed af prøver, opnået gennem protokoller med omfattende behandlingstid. Optiske clearingteknikker blev udviklet for at minimere heterogenitet i brydningsindeks (RI) i vævene og derved reducere lysspredning og øge lysindtrængningsdybden for billeddannelse med høj opløsning 1,2,3,4,5. Nuværende fremskridt inden for rydning og dybvævsmærkningsmetoder muliggør volumetrisk billeddannelse af intakte gnaverorganer og embryoner ved at udnytte banebrydende mikroskopiteknikker 6,7,8,9,10,11,12.
Imidlertid udgør volumetrisk 3D-rekonstruktion af store områder af den menneskelige hjerne efter slagtning stadig en udfordrende opgave sammenlignet med modelorganismer. Den komplekse biologiske sammensætning og de variable postmortemfikserings- og opbevaringsbetingelser kan kompromittere vævsrensningseffektiviteten, antistofpenetrationsdybden og epitopgenkendelsen 13,14,15,16,17,18,19. Desuden kræves mekanisk vævssektionering og efterfølgende rydning og mærkning af hver skive stadig for at opnå en effektiv rydning og ensartet mærkning af store menneskelige hjerneområder, hvilket resulterer i lange behandlingstider og behovet for sofistikeret brugerdefineret udstyr sammenlignet med modelorganismer 15,20,21,22.
SWITCH – H2O2 – antigen Retrieval –TDE (SHORT) vævstransformationsteknik er udviklet specielt til at analysere store mængder af den menneskelige hjerne18,23. Denne metode anvender vævets strukturelle bevarelse af SWITCH-protokollen11 og høje koncentrationer af peroxidhydrogen til at reducere vævets autofluorescens i kombination med epitoprestaurering. SHORT tillader ensartet farvning af menneskelige hjerneskiver med markører for forskellige neuronale undertyper, gliaceller, vaskulatur og myelinerede fibre18,24. Dens resultater er kompatible med analysen af både lav- og højdensitetsproteiner. De resulterende høje gennemsigtighedsniveauer og ensartet mærkning muliggør volumetrisk rekonstruktion af tykke skiver med fluorescensmikroskopi, især til hurtig erhvervelse lysarkapparater kan anvendes 18,24,25,26,27.
I dette arbejde beskriver vi, hvordan SHORT-vævstransformationsteknikken kan bruges til samtidig rydning og multi-round mærkning af snesevis af formalinfikserede menneskelige hjernesektioner. Fire forskellige fluorescerende markører kan bruges sammen, hvilket fører til identifikation af forskellige cellulære underpopulationer. Efter rydning kan volumetrisk billeddannelse med høj opløsning udføres med fluorescensmikroskopi. Her brugte vi en specialfremstillet omvendt LSFM 18,24,25,26,27, som muliggør hurtig optisk sektionering af prøven og hurtig erhvervelse af flere kanaler parallelt. Med denne rutinemæssigt høje gennemstrømningsprotokol er det muligt at opnå en omfattende cellulær og strukturel karakterisering med en subcellulær opløsning af store områder af den menneskelige hjerne, som allerede demonstreret i kortlægningen af et helt Brocas område23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Højopløsningsbilleddannelse og 3D-rekonstruktion af store menneskelige hjerneområder kræver mekanisk vævssektionering efterfulgt af optisk clearing og immunmærkning af enkeltskiver. Protokollen, der præsenteres her, beskriver, hvordan SHORT-vævstransformationsmetoden kan bruges til hurtig og samtidig behandling af flere menneskelige hjernetykke sektioner til 3D-hjernerekonstruktion med en subcellulær opløsning med LSFM.
I modsætning til andre tilgange, med SHORT-metoden kræver rydn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Bruce Fischl, Massachusetts General Hospital, AA Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, for at levere de menneskelige hjerneprøver, der analyseres i denne undersøgelse. Dette projekt modtog finansiering fra EU’s Horizon 2020 rammeprogram for forskning og innovation under tilskudsaftale nr. 654148 (Laserlab-Europe), fra EU’s Horizon 2020-rammeprogram for forskning og innovation under den specifikke tilskudsaftale nr. 785907 (Human Brain Project SGA2) og nr. 945539 (Human Brain Project SGA3) fra General Hospital Corporation Center of the National Institutes of Health under tildelingsnummer U01 MH117023, og fra det italienske undervisningsministerium inden for rammerne af Euro-Bioimaging Italian Node (ESFRI-forskningsinfrastruktur). Endelig blev denne forskning udført med bidrag fra “Fondazione CR Firenze.” Indholdet af dette arbejde er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.
Materials
| 2,2'-thiodiethanol | Merck Life Science S.R.L. | 166782 | |
| Acetamide >= 99.0% (GC) | Merck Life Science S.R.L. | 160 | |
| Agarose High EEO | Merck Life Science S.R.L. | A9793 | |
| Boric Acid | Merck Life Science S.R.L. | B7901 | |
| Compressome VF-900-0Z Microtome | Precisionary | / | |
| Coverslips | LaserOptex | / | customized |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Merck Life Science S.R.L. | E5134 | |
| Glutaraldehyde | Merck Life Science S.R.L. | G7651 | |
| Glycine | Santa Cruz Biotechnology | SC_29096 | |
| Hydrogen Peroxide 30% | Merck Life Science S.R.L. | ||
| Incubator ISS-4075 | Lab companion | / | |
| Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) | / | / | custom-made |
| Loctite Attak | Henkel Italia srl | / | |
| Microscope slides | Laborchimica | / | customized |
| Phospate buffer saline tablet | Merck Life Science S.R.L. | P4417 | |
| Picodent Twinsil | Picodent | 13005002 | out of production |
| Potassium Hydrogen Phtalate | Merck Life Science S.R.L. | P1088 | |
| Sodium Azide | Merck Life Science S.R.L. | S2002 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Merck Life Science S.R.L. | L3771 | |
| Sodium Sulfite | Merck Life Science S.R.L. | S0505 | |
| Spacers | Microlaser srl | customized | |
| Sputum Containers (dishes with screw lids) | Paul Boettger GmbH & Co. KG | 07.061.2000 | |
| Tris Base | PanReac AppliChem (ITW reagents) | A4577,0500 | |
| Triton X-100 | Merck Life Science S.R.L. | T8787 | |
| Tubes | Sarstedt | 62 547254 | |
| Tween 20 | Merck Life Science S.R.L. | P9416 | |
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystem | / | |
| Water bath | Memmert | WNB 7-45 | |
| Antibodies and Dyes | |||
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-545-215 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 805-545-180 | Dilution used, 1:200 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson Immuno Reasearch | 611-605-215 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-NeuN Antibody | Merck Life Science S.R.L. | ABN91 | Dilution used, 1:100 |
| Anti-Parvalbumin antibody (PV) | Abcam | ab32895 | Dilution used, 1:200 |
| Anti-Vimentin antibody [V9] – Cytoskeleton Marker (VIM) | Abcam | ab8069 | Dilution used, 1:200 |
| Calretinin Polyclonal antibody | ProteinTech | 12278_1_AP | Dilution used, 1:200 |
| DAPI | ThermoFisher | D3571 | Dilution used, 1:100 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175700 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150107 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175470 | Dilution used, 1:200 |
| Donkey Anti-Rat IgG H&L (Alexa Fluor 568) preadsorbed | Abcam | ab175475 | Dilution used, 1:200 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 568) | Abcam | ab175711 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | ab150171 | Dilution used, 1:500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | Dilution used, 1:200 |
| Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody | Abcam | ab194324 | Dilution used, 1:200 |
| Somatostatin Antibody YC7 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47706 | Dilution used, 1:200 |
| Vasoactive intestinal peptide (VIP) | ProteinTech | 16233-1-AP | Dilution used, 1:200 |
References
- Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review. Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).
- Richardson, D. S., et al. Tissue clearing. Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging. Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).
- Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).
- Renier, N., et al. iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
- Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).
- Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).
- Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).
- Murray, E., et al. Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ueda, H. R., et al. Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy. Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).
- Costantini, I., et al. Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture. Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).
- Lai, H. M., et al. Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues. Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).
- Zhao, S., et al. Cellular and molecular probing of intact human organs. Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).
- Costantini, I., et al. Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains. Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).
- Pesce, L., et al. 3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy. Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).
- Schueth, A., et al. Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples. Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).
- Morawski, M., et al. Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology. NeuroImage. 182, 417-428 (2018).
- Park, J., et al. Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain. bioRxiv. , (2022).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Costantini, I., et al. A cellular resolution atlas of Broca’s area. Science Advances. (9), eadg3844 (2023).
- Scardigli, M., et al. Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).
- Pesce, L., et al. Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).
- Keller, P. J., Dodt, H. -. U. Light sheet microscopy of living or cleared specimens. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).
- Sorelli, M., et al. Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy. Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Vieites-Prado, A., Renier, N. Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology. Development. 148 (18), dev199369 (2021).
- Costantini, I., et al. Editorial: The human brain multiscale imaging challenge. Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).
- Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).
