Article de méthode

Un système de perfusion normanthropique open-source conçu pour les chercheurs

DOI :

10.3791/68722

⸱

18 juillet 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, 3Radiology and Imaging Sciences, Department of Interventional Radiology, National Institutes of Health, 4Histopathology and Autopsy Pathology, Laboratory of Pathology, National Institutes of Health, 5Division of Cancer Treatment and Diagnosis, National Cancer Institute, National Institutes of Health, 6Department of Perioperative Medicine, National Institutes of Health, 7Blood Services Section, Department of Transfusion Medicine, National Institutes of Health, 8Translational Hepatology Section, Liver Disease Branch, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 9Center for Immuno-Oncology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole pour un système de perfusion ex vivo normothermique modifiable open-source, conçu pour surmonter le coût élevé et la flexibilité limitée des plateformes existantes, permettant une utilisation plus accessible, rentable et itérative dans la recherche biomédicale préclinique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’intégration de machines de perfusion ex vivo pour les organes humains avant la transplantation a amélioré les résultats pour les receveurs et augmenté la disponibilité des organes tout en révélant de nouvelles voies de recherche pour la médecine translationnelle. Cependant, ces machines ont une disponibilité limitée pour les modifications expérimentales tout en présentant un investissement initial important et un coût par utilisation prohibitif pour le chercheur. De plus, il existe un besoin important de modèles précliniques améliorés dans la recherche biomédicale qui permettent une interrogation authentique des processus cellulaires dans le cadre d’organes multicellulaires.

Pour permettre à l’ensemble de la communauté de recherche d’avoir accès à une technologie similaire, nous avons construit une machine de perfusion normothermique modulaire rentable entièrement à partir de pièces facilement approvisionnées et exécutées avec du code Python modifiable par l’utilisateur. Étant donné que le système est dépourvu de matériel personnalisé, les chercheurs peuvent construire et augmenter le système selon les besoins pour des applications de recherche individualisées.

Dans cet article, nous décrivons en détail la configuration de la machine et le processus de perfusion, transmettons notre expérience avec les organes porcins et humains et fournissons des résultats expérimentaux de preuve de concept précoces. Ces études démontrent le potentiel d’interroger la physiopathologie et les processus cellulaires complexes en utilisant des tissus humains intacts.

Introduction

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Bien que la perfusion mécanique normothermique de courte durée (<12 h) ait déjà été utilisée pour les reins et les foies avant la transplantation 1,2,3,4,5, la perfusion hépatique normothermique ex vivo prolongée est devenue une réalité en 2020 avec la machine Liver4Life6. L’intention de cette technologie était orientée vers l’expansion des organes de donneurs viables, mais les applications translationnelles possibles étaient évidentes pour la communauté des chercheurs 7,8,9,10,11,12. Pour les scientifiques de laboratoire et les laboratoires de recherche conventionnels, ces outils cliniques sont presque certainement hors de portée en raison de coûts initiaux et récurrents importants12,13. Les machines de perfusion normothermique clinique coûtent plus de 250 000 USD, avec des produits jetables à usage unique allant de 9 500 $ à 60 000 USD par cycle 13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23. De plus, les droits de propriété et l’incapacité d’adapter la technologie existante rendent les applications scientifiques difficiles.

Le besoin urgent de modèles précliniques améliorés 24,25,26 dans la recherche biomédicale, associé aux limites susmentionnées, a inspiré la création d’un système de perfusion modifiable à code source ouvert (Figure 1). La conception et le développement des circuits ont été guidés par les principes de l’utilisation des coûts, des exigences en matière d’espace de laboratoire et de la mobilité pour les applications translationnelles. Le système peut être construit pour 48 000 à 66 000 dollars, et chaque coût de perfusion varie de 1 000 à 2 300 dollars, ce qui a été réalisé grâce à l’intégration de composants individuels facilement sourcés et exécutés par du code téléchargeable gratuitement. Le système a été optimisé grâce à un processus itératif utilisant du sang porcin de donneur et du sang humain expiré, du foie porcin et des segments partiels de foie humain de la salle d’opération (tableau supplémentaire 1, tableau supplémentaire 2 et tableau supplémentaire 3). Les organes sont logés dans un bassin fermé qui positionne de manière optimale l’échantillon afin de minimiser la nécrose sous pression, de permettre une trajectoire idéale de canulation, de drainer les eaux de ruissellement et d’assurer la normothermie. Le réservoir abrite environ 2 à 3 L de perfusat avant d’être dirigé vers les circuits d’entrée. L’hémodialyse, qui est essentielle à l’homéostasie des électrolytes et à l’hémoconcentration dans les perfusions hépatiques 6,27,28,29, a été intégrée par un circuit latéral avec une pompe à rouleau indépendante. Les perfusions pharmacologiques soutiennent les fonctions physiologiques (p. ex., nutrition parentérale totale (NPT), sels biliaires, etc.30), augmentent le tonus vasculaire (époprosténol, phényléphrine), préviennent la coagulation (énoxaparine) et les infections (pipéracilline-tazobactam, amphotéricine). Les paramètres physiologiques de perfusion sont assurés à l’aide de capteurs en ligne en temps réel pour obtenir des valeurs de gaz sanguin, de pression et de débit. Le système permet une adaptabilité maximale de l’utilisateur, de sorte que l’intégration des composants matériels peut se produire à n’importe quel point du circuit. De plus, chacun des composants individuels du circuit peut être échangé ou modifié pour permettre de s’adapter à des questions de recherche spécifiques et à des besoins expérimentaux. Par exemple, le circuit d’entrée double peut être modifié pour la perfusion d’organes avec un seul flux (c’est-à-dire les reins ou le pancréas) en retirant simplement le connecteur en Y avant les têtes de pompe, et des claves pour la perfusion/l’échantillonnage peuvent être installées à n’importe quel point du circuit. De plus, le système est exécuté avec du code Python qui permet une perfusion semi-automatisée basée sur un ensemble spécifié de paramètres de perfusion dictés par l’utilisateur final (Figure supplémentaire 1). Par exemple, les capteurs acquièrent des lectures continues des gaz du sang artériel (ABG), de la pression et du débit qui servent d’entrée pour mettre en œuvre des commandes de sortie afin d’ajuster automatiquement le débit de gaz de l’oxygénateur, la vitesse de la pompe, etc. L’interface utilisateur graphique (GUI) permet de remplacer manuellement cette automatisation si vous le souhaitez. La personnalisation du circuit est sa marque de fabrique et élargit l’applicabilité globale de ce système pour un large éventail d’investigations expérimentales.

L’accès au système dans son intégralité est libre (https://github.com/CCR-SOP/OpenSourcePerfusionSystem.git) afin d’encourager la collaboration et l’innovation dans le but de forger de nouvelles profondeurs de connaissances dans plusieurs domaines de la science translationnelle.

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Figure 1 : Système de perfusion open source. (A) Schéma du système de perfusion open source pour la configuration à double flux entrant pour la perfusion hépatique. (B) Rendu tridimensionnel (3D) du système pendant la perfusion d’un organe avec intégration logicielle comme démontré sur des écrans. (C) Photo de la machine de perfusion pendant l’expérience de perfusion porcine. La configuration exposée dans la figure n’est fournie qu’à des fins de démonstration. Pendant la perfusion, le champ chauffant stérile recouvre l’organe pour maintenir une enceinte stérile. Capteur P/F : Capteurs de pression et de débit. HA : Artère hépatique. PV : Veine porte. HV : Veine hépatique. BD : Canal biliaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

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Ce protocole a été mené conformément aux normes éthiques du Comité d’éthique de la recherche humaine de notre établissement et respecte toutes les lignes directrices et tous les règlements applicables à la recherche impliquant des sujets et des tissus humains.

1. Configuration de la machine

  1. Préparation de la table
    1. Stérilisez la table et le chariot mobile avec un spray d’alcool à 70 % et essuyez soigneusement. Placez le chariot mobile perpendiculairement au côté gauche de la table. Avant de raccorder tous les tubes et le matériel tout au long du protocole, vaporisez de l’alcool à 70 % ou de l’autoclave, le cas échéant, pour stériliser.
      REMARQUE : Avant toute manipulation ou intervention d’organe, utilisez des gants stériles et un spray d’alcool pour faciliter la stérilité avant et pendant la perfusion.
    2. Couvrez le poste de travail avec des rideaux bleus stériles, puis des sous-vêtements absorbants.
    3. Fixez le support de réservoir au pied du chariot le plus proche du banc avec l’anneau en saillie vers l’extérieur, à environ 12 po sous le bas du haut du poste de travail.
    4. Placez l’entonnoir du tambour sur l’aspect droit du poste de travail avec un bec en surplomb du bord avant de la table. Découpez de la mousse à mémoire de forme circulaire pour remplir la base du tambour, permettant un espace de 4" pour l’écoulement près du bec. Placez le diaphragme sous la mousse reliée à un respirateur.
    5. Procurez-vous 2 couvertures chauffantes à eau et placez-les sur l’insert en mousse avec le tube de connexion orienté en haut à gauche de la couverture. Coupez les pinces blanches du tube et insérez une barbe Luer mâle de 3/16 po dans chaque tube. Fixez 1 conduite d’entrée et 1 sortie des conduites du réservoir de chauffage de l’eau Y’ed à chaque couverture.
    6. Procurez-vous un drap chauffant stérile et identifiez le carré bleu central. Pliez deux fois en deux et coupez 2 mm du coin du pli pour créer un trou d’évacuation. Placez le champ stérile sur le dessus du tambour de sorte que le trou coupé soit aligné avec le bec d’évacuation.
    7. Procurez-vous le connecteur de sortie imprimé en 3D et placez l’aimant dans la rainure. Placez sous le rideau à travers le bec d’évacuation et alignez le trou coupé sur le trou du connecteur et de l’aimant. Placez un deuxième aimant aligné avec l’écoulement pour fixer le drapé.
    8. Soulevez l’excédent de drapé pour couvrir tout l’entonnoir du tambour et fixez-le avec un élastique ou des attaches élastiques. Repliez l’excédent de drap sur le dessus pour créer une barrière stérile. Replacez la deuxième chemise d’eau sur le drapé plié.
    9. Coupez un morceau de ~30 » de tube de 1/4 » et fixez l’aspect proximal à la pièce de sortie du bas du bec de l’entonnoir du tambour et l’aspect distal à une ardillon d’entrée de réservoir.
  2. Préparation de la pompe et de l’oxygénateur
    1. Placez les pompes sur le chariot mobile le plus proche du bord du poste de travail avec le support et deux pinces immédiatement derrière les pompes de sorte que les pinces soient à 6 po au-dessus des pompes.
    2. Obtenez 2 têtes de pompe et fixez-les dans les pompes.
    3. Procurez-vous 2 oxygénateurs et placez-les dans des pinces fixées à des supports dans une configuration horizontale. Orientez les oxygénateurs avec l’ardillon tourné vers l’extérieur et l’ardillon latéral pointant vers la droite.
      REMARQUE : Les oxygénateurs avec connecteurs Luer nécessitent une configuration alternative avec l’étiquette tournée vers l’extérieur et les broches intérieures vers le haut.
  3. Préparation du mélangeur de gaz
    1. Coupez deux (2) morceaux de tube de 1/8 » de 4' et insérez un Luer mâle de 1/8 » dans les extrémités de chaque tube. Connectez un tube à chaque entrée de gaz artériel et veineux.
    2. Coupez deux (2) morceaux de tube de 1/4 » et fixez un Luer femelle de 1/4 » à une extrémité. Placez chacun de ces morceaux de tube sur les ardillons en haut à droite de chaque oxygénateur.
    3. Connectez le tube d’entrée de gaz artériel et veineux 1/8" au connecteur Luer en haut à droite de leurs oxygénateurs respectifs.
  4. Préparation du circuit d’hémodialyse
    1. Retirez tous les tubes du kit d’hémodialyse, à l’exception de ceux qui mènent directement au filtre (lignes bleues, rouges, vertes et jaunes). Fixez le filtre sur le panneau perforé à l’arrière du poste de travail, à ~12" à droite des pompes, ou dans l’alignement du réservoir.
    2. Placez 1 grande pompe à rouleaux immédiatement à droite du filtre pour l’entrée de sang. Placez 2 pompes péristaltiques plus petites à droite de la pompe à rouleau de sang.
      1. Procurez-vous deux (2) tubes péristaltiques 1/8e et placez-les dans la pince de pompe blanche. Fixez deux (2) barbes Luer femelles 1/8e à chaque extrémité de chaque tube.
    3. Accrochez un sac de 5 L de dialysat sur l’aspect latéral droit du poste de travail.
      1. Connectez le sac de dialysat à l’entrée du filtre d’hémodialyse en fixant le tube 1/8e au connecteur Luer du sac. Fixez le Luer mâle 1/8e à l’extrémité de ce tube et fixez-le au tube de la pompe péristaltique d’entrée.
    4. Entrée/sortie du dialysat : Obtenir un tube de 3 1/8e avec chaque extrémité équipée d’un Luer mâle 1/8e .
      1. Entrée : Connecter l’extrémité proximale à l’aspect distal de la tubulure de la pompe et l’extrémité distale à la tubulure d’entrée jaune (avec 1/8e de Luer femelle) au filtre d’hémodialyse.
      2. Écoulement : Connecter l’extrémité proximale à la tubulure de sortie verte (avec Luer femelle 1/8e) et l’extrémité distale à la tubulure de la pompe péristaltique à l’écoulement. Connectez le tube 1/8e à la face distale de la pompe péristaltique et vidangez-le dans le sac à déchets via des connecteurs Luer.
  5. Création d’un circuit proximal
    1. Placez le réservoir dans le support de réservoir avec les numéros extérieurs et le connecteur à capuchon jaune orienté vers l’extérieur.
    2. Coupez ~36 » de tube de 5/16 » et connectez l’extrémité proximale au piquet de sortie au fond du réservoir. Connectez le connecteur en Y 5/16" à l’extrémité distale de ce tube.
    3. Coupez deux (2) longueurs de 4 » du tube de 5/16 » et connectez-les à l’extrémité du connecteur en Y. Fixez chacune des extrémités de ces tubes de 4 pouces sur la broche horizontale de chacune des têtes de pompe.
    4. Coupez deux (2) longueurs de tube de 4 po et connectez-en 1 à chacune des ardillons verticaux des têtes de pompe. Connectez l’aspect distal à la broche inférieure gauche de chaque oxygénateur.
    5. Coupez deux (2) longueurs de tube de 1/4 » de 2 » et connectez un Luer femelle à une extrémité. Ajoutez un capuchon Luer mâle et fixez-le à la broche inférieure droite de chaque oxygénateur.
  6. Création de circuits veineux
    1. Coupez un (1) tube de 30 po de 5/16 po et fixez l’extrémité proximale à l’ardillon de sortie (à droite) de l’oxygénateur veineux. Coupez-le en deux et placez un connecteur en Y de 5/16 po sur l’extrémité distale coupée. Rattachez l’autre moitié à l’ardillon supérieur du connecteur en Y.
    2. Circuit d’échantillonnage latéral : Coupez un (1) morceau de tube de 2 po et étirez l’extrémité proximale à l’aide d’un tournevis à aiguille. Connectez-le à l’autre ardillon du connecteur en Y 5/16".
      1. Procurez-vous un capteur à cuvette. Connectez le côté barbelé au tube de 2" connecté au connecteur en Y. Coupez 1 à 2 po du tube de la cuvette distale et connectez-le au Luer mâle 1/4 po. Fixez-le à l’extrémité proximale du capteur de dérivation une fois calibré et, sur l’aspect distal, connectez le Luer mâle 1/8 » au tube 1/8 ».
      2. Connectez l’aspect horizontal du connecteur en T femelle au tube 1/8" et au Luer mâle. À l’aspect perpendiculaire, connectez une clave d’échantillonnage. Connectez un Luer mâle 1/8" à l’aspect horizontal restant du connecteur en T.
      3. Coupez 12 » de tube 1/8 », fixez l’extrémité proximale à l’enclave d’échantillonnage et fixez un Luer mâle 1/8 » à l’extrémité distale. Connectez-le à un autre connecteur en T femelle. D’un côté du connecteur en T femelle, fixez un Luer mâle de 1/4 » et connectez-le à un canal d’entrée à l’aide d’un tube de 2 » de 1/4 ».
    3. Revenez à l’extrémité distale du tube 5/16 » et fixez un autre connecteur en Y 5/16 ». Obtenez ~55 » de tube 1/4 » et fixez-le à l’extrémité supérieure du connecteur en Y 5/16 ».
    4. Création d’un circuit sanguin d’hémodialyse : Fixez un Luer mâle de 1/4 » à l’extrémité distale de la tubulure de 1/4 ». Placez le tube dans la grande pompe à rouleau. Connectez-vous à l’entrée de sang en haut du filtre d’hémodialyse (tubulure bordée de bleu).
      1. Coupez un (1) morceau de tube de 24 » et connectez un Luer mâle de 1/4 » à la face proximale. Connectez cette tubulure au filtre d’hémodialyse à sortie de sang (tubulure bordée de rouge). Reliez l’aspect distal à une barbe d’entrée du réservoir.
    5. Revenir pour terminer le circuit d’entrée veineuse menant à l’échantillon. Coupez un (1) morceau de tube de 36 po et étirez-le pour l’adapter à l’ardillon du connecteur en Y de 5/16 po.
    6. Site de perfusion du médicament : Procurez-vous 3 robinets d’arrêt à quatre voies et connectez-les linéairement. Connectez cette pièce au bras perpendiculaire d’un connecteur en T femelle. Aux bras en ligne du connecteur en T femelle, fixez deux Luers mâles 1/4". Insérez la pièce à 12" de l’aspect gauche du tube.
    7. Fixez les capteurs de débit externes sur le tube 1/4" après le site de perfusion du médicament. Procurez-vous un support de 1 9" et fixez-le au niveau de l’entonnoir du tambour. Faites une coupe distale de 2 pouces à l’extrémité des capteurs de débit et insérez les capteurs de pression avec des barbes dans un tube de 1/4 po. Placez l’aspect distal du tube au centre de l’entonnoir du tambour. Réservez un (1) Luer mâle de 1/4 po pour la canulation veineuse dans l’échantillon.
  7. Création d’un circuit artériel
    1. Coupez un autre morceau de ~30 » de tube 5/16 » et fixez l’extrémité proximale de l’ardillon de sortie droit de l’oxygénateur artériel. Coupez ce tube à peu près à mi-chemin et fixez-y un connecteur en Y de 1 5/16 po.
    2. Circuit d’échantillonnage latéral : Créez un circuit d’échantillonnage latéral dupliqué comme décrit à l’étape 1.6.2 et fixez-le à l’aspect inférieur du connecteur Y, en omettant la cuvette. Une fois terminé, fixez le Luer de sortie 1/8" au connecteur en T.
    3. Coupez un (1) morceau de tube de 36 po et insérez-le sur l’ardillon du connecteur en Y de 5/16 po.
    4. Répétez l’étape 1.6.7. Réservez un (1) Luer mâle de 1/4 po pour la canulation artérielle dans l’échantillon.
  8. Création d’un écoulement veineux
    1. Coupez ~30 » de tube 1/4 » et fixez 1 Luer mâle 1/4 » à l’extrémité proximale pour le fixer à la sortie de la veine cave inférieure (IVC) de l’échantillon. Fixez l’extrémité distale à l’une des barbes d’entrée du réservoir.
    2. Coupez ce tube à ~6 » du réservoir et fixez des Luers mâles de 2 1/4 » à chaque extrémité. Insérez un T femelle avec une clave fixée à l’aspect perpendiculaire pour l’échantillonnage.
  9. Introduisez du perfusat dans le circuit comme décrit à l’étape 4. Réchauffez et connectez l’échantillon comme décrit à l’étape 6.1.4. ou à l’étape 6.2.4. et commencer la perfusion.

2. Étalonnage du capteur CDI

  1. Assurez-vous que les bouteilles de gaz du calibrateur sont pleines et installées conformément au manuel d’utilisation et que le moniteur est réglé sur le mode d’étalonnage. Calibrez selon les instructions du fabricant.
  2. Une fois l’étalonnage terminé, débranchez l’appareil de tête de câble du capteur et intégrez-le immédiatement dans les circuits veineux et artériels respectifs. Les connexions Luer sont créées aux étapes 1.6.2 et 1.7.2.

3. Lancement du code

  1. Téléchargez, installez et ouvrez le code Python trouvé dans le référentiel GitHub. Assurez-vous de l’installation correcte des logiciels Python et PyCharm.
  2. Créez une branche unique pour chaque exécution de perfusion afin d’obtenir un enregistrement précis des données. Une fois lancée, une interface graphique s’affiche avec deux fenêtres. Orientez une fenêtre par écran pour faciliter le contrôle du matériel et l’affichage des paramètres de perfusion.
  3. Ajustez manuellement les paramètres de perfusion ou automatisez la perfusion à l’aide des boutons respectifs affichés sur l’interface graphique (Figure supplémentaire 1).

4. Création de perfusat et amorçage du système

  1. Amorcez le circuit environ 2 h avant la perfusion de l’organe pour permettre la correction des dérangements métaboliques/électrolytiques, le réchauffement jusqu’à la normothermie et l’administration d’anticoagulants, d’antibiotiques et d’autres produits pharmaceutiques.
  2. Perfusate porcin
    1. Prélever 2 L de sang porcin entier de type OO et l’introduire dans le réservoir en l’égouttant à l’aide d’une seringue ouverte de 50 à 100 ml. Prélever environ 1 mL de sang total et mesurer le pH de base, les électrolytes et l’hématocrite sur un appareil au point de service.
    2. Administrer des aliquotes de bicarbonate de sodium à 8,4 % si nécessaire pour contrer l’acidité due aux conservateurs de sang froid. Amorcer l’hémodialyse pour normaliser l’hyperkaliémie et l’acidémie lactique au besoin et titrer jusqu’à la concentration d’hématocrite souhaitée. Ajustez le débit de gaz pour qu’il soit titré aux niveaux physiologiques de pO2 et de pCO2.
    3. Administrer les produits pharmaceutiques comme décrit ci-dessous (section 5).
    4. Conservez 1 à 2 L de sang total de type OO pour des bolus intermittents au besoin afin de maintenir l’hématocrite à ~30-40 % tout au long de l’expérience de perfusion.
  3. Perfusat humain
    1. Obtenir des produits sanguins de type apparié auprès d’une banque de sang (presque périmés ou donnés à des fins de recherche).
      REMARQUE : Environ 4 unités de globules rouges (GR) et de plasma sont nécessaires pour chaque expérience de perfusion.
    2. Lavez les pGR pour éliminer les agents de conservation et normaliser les dérangements électrolytiques de la pastille de globules rouges avant l’amorçage. Lavez les globules rouges deux fois.
      1. Lavage des globules rouges : Placez les globules rouges et le NaCl à 0,9 % dans un rapport de 1:1 dans un tube à centrifuger. Centrifuger à 1300 × g pendant 15 min. Prélever le surnageant à l’aide d’une pipette et administrer de nouveau du NaCl frais à 0,9 % dans un rapport de 1:1 avec la pastille de globules rouges. Centrifugez à nouveau comme ci-dessus et retirez le 2ème surnageant pour la pastille de globule rouge lavée finale.
    3. Introduisez les granules de globules rouges lavés dans le réservoir à l’aide d’une seringue ouverte de 50 à 100 ml. Placez 4 unités de plasma dans le réservoir et commencez la circulation.
    4. Amorcer la dialyse, les couvertures chauffantes et l’afflux de gaz une fois que le perfusat circule.
    5. Prélever des échantillons de perfusat et appliquer des interventions pharmacologiques au besoin pour assurer des niveaux de perfusat proches de la physiologie avant la perfusion d’organes.
    6. Lavez et introduisez des granules de globules rouges rouges lavées supplémentaires et titrez l’état du volume par hémodialyse si nécessaire pour maintenir les taux d’hématocrite de 30 à 40 %.

5. Intervention pharmacologique et préparation de la perfusion

  1. Administration d’antibiotiques et d’antifongiques
    1. Combinez deux flacons de 2,5 g de pipéracilline/tazobactam dans un gobelet stérile contenant 40 ml de sérum physiologique. Ajouter 10 ml dans le réservoir en tant qu'« antibiotique primaire ».
      1. Diluer le reste du mélange avec 60 mL de solution saline stérile et répartir entre deux seringues de 50 mL. Connecter une seringue à un pousse-seringue et programmer une distribution continue de 41 μL/min au site de perfusion du médicament dans la veine porte (étape 1.6.6).
      2. Conservez le reste de l’antibiotique dans un réfrigérateur à 4 °C.
    2. Reconstituez un flacon de 50 mg d’amphotéricine avec 10 ml d’eau stérile.
      1. Prélevez 1 ml d’amphotéricine concentrée et combinez-le avec 9 ml de solution saline stérile. Administrer le mélange de 10 mL dans le réservoir pour servir de « prime antifongique » au début de la perfusion.
      2. Administrer 1 mL d’amphotéricine concentrée toutes les 12 h dans le réservoir.
  2. Anticoagulation
    1. Combinez 1 mL (100 mg) d’énoxaparine avec 49 mL de solution saline stérile. Administrer un mélange de 5 mL par litre de perfusat au début de la perfusion pour un « amorce d’anticoagulation ».
      1. Conservez la solution d’énoxaparine restante dans un réfrigérateur à 4 °C.
      2. Administrer la solution d’énoxaparine (5 mL/1 L de perfusat) toutes les 12 h dans le réservoir.
  3. Stéroïdes
    1. Reconstituez 1 g de méthylprednisolone avec 20 ml d’eau stérile.
    2. Amorcer le système selon les spécifications posologiques avant le début de la perfusion : Le foie porcin reçoit 10 ml (500 mg) de méthylprednisolone. Les foies humains reçoivent partiellement 2 ml (100 mg) de solumedrol.
    3. Diluer le reste du mélange avec 40 mL de solution saline dans une seringue de 50 mL et le placer dans un pousse-seringue pour administrer continuellement 33 μL/min au site de perfusion du médicament dans la veine porte (étape 1.6.6).
  4. Nutrition parentérale et sels biliaires
    1. Reconstituer 1,7 g d’acide taurocholique avec 50 ml d’acide aminé à 10 % + composant concentré de nutrition parentérale concentré d’électrolytes de la NPT (non mélangé avec du dextrose) dans un gobelet d’échantillon stérile. Prélever dans une seringue de 50 mL et placer dans un pousse-seringue pour administrer en continu 83 μL/min au site de perfusion du médicament dans la veine porte (étape 1.6.6.)
  5. Contrôle du tonus vasculaire
    1. Vasodilatation : Reconstituer 0,5 mg d’époprosténol avec 50 mL de solution saline stérile dans une tasse stérile et placer dans une seringue de 50 mL. Placez-le dans un pousse-seringue et connectez-le à la clave proximale du capteur de débit de l’artère hépatique.
      1. Bolus ou perfusion continue (10 μL/min) au besoin pour atteindre la pression artérielle moyenne souhaitée et/ou pour contrer le vasospasme.
    2. Vasoconstriction : Diluer 5 ml (50 mg) de phényléphrine avec 45 ml de solution saline stérile dans une tasse stérile et placer dans une seringue de 50 ml. Conserver le mélange au réfrigérateur à 4 °C et en bolus au besoin pour maintenir la pression artérielle moyenne souhaitée.
      REMARQUE : Ceci est rarement nécessaire, et la reconstitution peut être omise et mise en œuvre uniquement au besoin.
  6. Étalonnage des capteurs de pression et de débit
    1. Étalonnage de la pression : Étalonnez les capteurs de pression sans écoulement de perfusat. Remettre à zéro les capteurs si la lecture de la pression non nulle s’affiche conformément aux instructions du fabricant lorsque l’extrémité du tube est ouverte à l’air pour une pression de 0 mmHg. Assurez-vous que les mesures de pression sont correctes en obstruant doucement les extrémités proximales et distales de la tubulure pour produire des pressions élevées.
    2. Étalonnage du débit : Étalonnez une fois que le circuit fait circuler le perfusat avant la perfusion d’organe pour assurer une mesure précise. Clamp du tube distal aux capteurs de débit pour couper le débit. Remettez à zéro les capteurs de débit si le débit n’est pas nul affiché conformément aux instructions du fabricant. Décesser le tube pour permettre une mesure précise du débit.

6. Approvisionnement hépatique

  1. Approvisionnement en porcs
    REMARQUE : Les foies porcins sont achetés dans une boucherie locale conformément aux protocoles de manipulation humaine du bétail de l’USDA. La dissection est guidée par l’équipe de recherche pour inclure la veine cave infra- et suprahépatique et les voies biliaires.
    1. Stérilisez le foie avec de l’iode dilué dans une solution saline stérile et placez-le dans une bassine stérile sur de la glace. Identifiez la veine porte, l’artère hépatique, la veine cave supérieure et le canal cholédoque, canulez et fixez avec des attaches en soie 4-0.
      REMARQUE : Le canal biliaire est souvent canulé avec un angio-cathéter fenêtré en raison de son petit diamètre et pour prévenir l’obstruction biliaire des différents systèmes biliaires porcins.
    2. Rincer la veine porte canulée et l’artère hépatique avec 3 L de solution saline stérile froide (2 L PV : 1 L HA) suivie de 1 L de solution de préservation d’organe froid (750 mL PV : 250 mL HA). Immergez le foie dans la solution froide de conservation des organes avec de la glace pour le transport.
    3. Amorcez le système comme décrit ci-dessus (étape 4.1) jusqu’à ce que les paramètres physiologiques soient respectés.
    4. Immergez le foie canulé dans une solution saline stérile réchauffée pour un réchauffage rapide et l’élimination de toute embolie d’air. Connectez la tubulure d’entrée appropriée à la veine porte et aux canules de l’artère hépatique. Titrez la vitesse de la pompe pour les valeurs de débit physiologique et de pression.
    5. Connectez la canule de la veine cave au tube de sortie pour faciliter l’écoulement vers le réservoir pour compléter le circuit.
    6. Videz la vésicule biliaire de la bile résiduelle avant de connecter le tube de la seringue à la canule des canaux biliaires et à un flacon conique pour le prélèvement.
  2. Approvisionnement humain
    1. amorcez le système comme décrit ci-dessus (étape 4.1).
    2. Prélever des échantillons humains après les résections oncologiques standard indiquées. Mesurer les débits in vivo par ultrasons peropératoires pour l’étalonnage sur le système ex vivo . Identifier la veine porte segmentaire, l’artère hépatique et le canal biliaire lors de la dissection chirurgicale. Transectez la triade selon la technique chirurgicale standard et remettez l’échantillon du champ opératoire sur la table arrière stérile.
    3. Identifiez et canulez la veine porte segmentaire, l’artère hépatique, la veine hépatique et le canal biliaire, en les fixant avec des attaches en soie 4-0 ou une suture prolène.
      REMARQUE : Omettre la canulation de sortie si le segment n’a pas de veine dominante pour éviter l’hépatopathie congestive. L’écoulement du bassin fonctionne alors comme le tube d’écoulement de la veine hépatique/IVC.
    4. Retournez au laboratoire ex vivo et pesez l’échantillon. Immergez l’échantillon dans une solution saline stérile chauffée et connectez les tubes d’entrée et de sortie respectifs. Connectez la canule du canal biliaire au tube de la seringue pour le drainage vers le flacon conique.
    5. Commencer la perfusion et titrer le débit de la pompe pour les paramètres de débit et de pression souhaités.

7. Titrage des paramètres de perfusion

  1. Échantillonnez le perfusat des claves pré-hépatiques (circuits latéraux HA et PV) et post-hépatiques (IVC ou écoulement du bassin) à de nombreux points temporels pour le titrage des paramètres de perfusion en fonction des valeurs de gaz du sang, d’électrolyte, d’hématocrite et d’hémoglobine au point de service.
  2. Étalonnez les capteurs CDI tout au long de la perfusion à l’aide des analyses manuelles des échantillons.
  3. Ajustez l’afflux et le débit sortant de l’hémodialyse en conséquence pour maintenir l’état du volume et la concentration d’hématocrite de 30 à 40 % et corriger tout dérangement métabolique et électrolytique.
  4. Dosez manuellement des aliquotes de 5 % de dextrose, d’eau libre, de bicarbonate de sodium à 8,4 % et de NaCl à 0,9 % au besoin pour corriger les anomalies électrolytiques.

8. Variantes du circuit de perfusion

  1. Adaptation des transports
    1. Branchez les pompes sur une source d’alimentation mobile pendant toute la durée de l’exécution pour faciliter la perfusion continue en route vers l’appareil d’imagerie. Branchez la source d’alimentation mobile dans la prise secteur pour charger la batterie externe pendant la perfusion.
    2. Débranchez la source d’alimentation mobile de la prise secteur murale une fois l’expérience de perfusion terminée.
    3. Déconnecter l’entrée de gaz vers les oxygénateurs. Clampez le circuit latéral d’hémodialyse et déconnectez l’afflux sanguin vers le filtre. Arrêtez les pompes de dialysat.
    4. Retirez les capteurs de débit de la tubulure d’entrée. Débranchez les perfusions de médicaments et fermez les robinets. Débranchez les capteurs de pression de la prise d’entrée/sortie.
    5. Déplacez avec précaution l’entonnoir et le tube du tambour vers le chariot mobile, qui est maintenant une unité indépendante et peut être transporté vers la suite d’imagerie.

Résultats

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Parcours porcins représentatifs
Des foies de porc entiers ont été obtenus d’un boucher local pour des raisons de rentabilité et perfusés pour diverses phases d’optimisation et de test du développement de la machine (tableau supplémentaire 1). Les premières 24 heures de trois cycles hépatiques représentatifs sont évalués ici (figure 2). La pression artérielle hépatique moyenne était de 80 mmHg ± 11 mmHg, et la pression veineuse porte moyenne était de 7,1 mmHg ± 3,3 mmHg avec des débits de 107 mL/min ± 102 mL/min et 501 mL/min ± 329 mL/min, respectivement. Les écarts-types élevés pour la pression et les débits sont corrélés à la grande différence de taille du foie, avec des porcs allant de 50 lb à 350 lb. Les circuits d’entrée doubles permettent des différentiels physiologiques d’oxygène avec une saturation artérielle moyenne (SO2) de 95 ± 7,4 % par rapport à une SO2 veineuse porte moyenne de 85 ± 13 % (p < 0,001). Le débit de SO2 sortant des veines hépatiques était de 74 ± 18 %, ce qui indique une consommation d’oxygène (p < 0,01), et les mesures du pH périphérique se situaient dans les plages physiologiques de 7,2 ± 0,09. D’autres paramètres physiologiques tels que l’hémoglobine totale (9 ± 2,5 g/dL), les taux d’hématocrite (28,3 ± 6,4 %), le taux de glucose (477 ± 15 mg/dL) et les modifications du lactate (3,0 ± 2,5 mmol) et du potassium (-0,77 ± 2,3 mmol) ont été surveillés tout au long de la perfusion par échantillonnage à intervalles réguliers. Pour les perfusions porcines, la production de bile était indicative de la viabilité des organes. La vésicule biliaire a été drainée manuellement une fois que l’organe est devenu normothermique, et le canal cholédoque a été attaché à un petit tube pour la collecte. La production totale de bile tout au long de la perfusion était de 41 ± 6,9 mL au total, avec un taux de 6,9 ± 4,0 mL/h.

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Figure 2 : Indicateurs de perfusation pendant la perfusion du foie porcin (n = 3). (A) Taux moyens d’afflux sanguin (mL/min) de l’artère hépatique et de la veine porte au fil du temps. (B) Pressions sanguines moyennes (mmHg) de l’artère hépatique et de la veine porte au fil du temps. (C) Comparaison du pourcentage de saturation en O2 des globules rouges entre l’artère hépatique, la veine porte et la veine cave inférieure, démontrant une différence d’oxygène entre les deux entrées et la consommation d’oxygène dans l’écoulement sortant. Des différences statistiquement significatives ont été déterminées entre les saturations de la veine porte et de l’artère (p < 0,0001), les saturations de la veine porte et de la VCI (p < 0,01) et les saturations artérielles et IVC (p < 0,0001). (D) Évaluation du pH sanguin entre l’artère hépatique, la veine porte et la veine cave inférieure. (E) Taux d’hématocrite ( %) et d’hémoglobine (g/dL) (en haut) tout au long de la perfusion, en plus de la modification du potassium PV (mmol) (en bas) comme marqueur de l’hémolyse. (F) Les taux de glucose du réservoir reflètent la glycémie moyenne du circuit (mg/dL) tout au long de la perfusion. (G) Changement du taux de lactate (mg/dL) tout au long de la perfusion par rapport au temps 0 valeurs de lactate dans l’entrée de l’artère hépatique, la sortie de la VCI et le perfusat du système. (H) Production de bile (mL) au fil du temps tout au long de la perfusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Parcours humains représentatifs
Trois segments hépatiques humains porteurs d’une tumeur ont été perfusés, avec une durée de perfusion allant de 48 à 72 h, selon les exigences de l’expérience (Figure 3). Pour comparer les données entre les applications représentatives, nous avons évalué les premières 48 heures de valeurs biochimiques. Les paramètres de perfusion ont été approximés in vivo avec un flux veineux porte continu à basse pression et à haut volume et un flux artériel pulsatile à haute pression et à faible volume, qui sont affichés en temps réel pour permettre un titrage facile. Si le foie n’atteignait pas les valeurs biochimiques physiologiques dans les deux heures suivant la perfusion, l’expérience était terminée. Pour les perfusions hépatiques réussies, la pression artérielle hépatique moyenne était de 84 mmHg ± 11 mmHg, et la pression veineuse porte moyenne était de 9 mmHg ± 4 mmHg avec des débits de 113 mL/min ± 66 mL/min et 317 mL/min ± 302 mL/min, respectivement. Les circuits d’entrée doubles permettent des différentiels physiologiques d’oxygène avec une saturation artérielle moyenne (SO2) de 98 % ± 3 % par rapport à une SO2 veineuse porte moyenne de 92 % ± 7 % (p < 0,0001). Le SO2 de l’écoulement des veines hépatiques était de 86 % ± 9 %, ce qui indique une consommation d’oxygène (p < 0,0001), et les mesures du pH dans l’ensemble du système se situaient dans les plages physiologiques de 7,3 ± 0,09. D’autres paramètres physiologiques tels que l’hémoglobine totale (10,2 g/dL ± 1,6 g/dL), les taux d’hématocrite (30,2 % ± 5,5 %), le taux de glucose (170 mg/dL ± 68 mg/dL) et les changements de lactate (3,6 mmol/L ± 2,2 mmol/L) ont été surveillés tout au long de la perfusion par échantillonnage à intervalles réguliers. Lors d’un cycle représentatif, une moyenne de 1,4 mL/h de bile a été produite. Avant et à la fin des expériences de perfusion, des biopsies ont été obtenues pour l’analyse des tissus. Des coupes tissulaires représentatives mettent en évidence un parenchyme hépatique, une tumeur neuroendocrine métastatique et un adénocarcinome colorectal métastatique après perfusion.

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Figure 3 : Métriques du perfusat et des tissus pendant la perfusion d’un ou plusieurs segments hépatiques humains (n = 3). (A) Débit moyen d’entrée de perfusat (mL/min) pour l’artère hépatique et la veine porte. (B) Pression moyenne d’entrée du perfusat (mmHg) pour l’artère hépatique et la veine porte au fil du temps. (C) Saturation en oxygène des globules rouges ( %) pour l’artère hépatique entrante, la veine porte entrante et la veine hépatique sortante. Des différences statistiquement significatives ont été déterminées entre les saturations de la veine porte et de l’artère (p < 0,0001), les saturations de la veine porte et de la VCI (p < 0,0001) et les saturations artérielles et IVC (p < 0,0001). (D) Perfuser le pH de l’artère hépatique entrante, de la veine porte entrante et de la veine hépatique sortante. (E) Métriques des globules rouges tout au long de la perfusion, y compris les taux moyens d’hématocrite ( %) et de perfusat d’hémoglobine (g/dL) (en haut) avec variation du perfusate de potassium (mmol) par rapport à la ligne de base au fil du temps (en bas). (F) Concentration moyenne de glucose (mg/dL) pour l’artère hépatique entrante, la veine porte entrante et la veine hépatique sortante au fil du temps. (G) Variation de la concentration de lactate de perfusat (mg/dL) par rapport à la ligne de base au fil du temps pour l’artère hépatique entrante, la veine hépatique sortante et le perfusate systémique. (H) Production de bile (mL) au fil du temps. (I) Segments de foie humain (Couinaud II-IV) pendant (à gauche) et après la perfusion (à droite) montrant l’absence de nécrose de pression après optimisation du système. Zone superficielle de cautérisation présente en haut de l’image de gauche due à une hémostase peropératoire. (J) Coupe de tissu post-perfusion montrant un parenchyme hépatique (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, 10x, encadré 40x ; barre d’échelle 50 μM). (K) Coupe tissulaire post-perfusion montrant une tumeur neuroendocrine métastatique (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, 10x, encart 40x ; barre d’échelle 250 μM). (L) Coupe de tissu post-perfusion montrant un adénocarcinome colorectal métastatique (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, 10x, encart 40x ; barre d’échelle 50 μM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Application représentative : Imagerie CT d’un échantillon perfusé
La possibilité d’intégrer des sources de données cliniques telles que la tomodensitométrie (TDM) ou l’imagerie par résonance magnétique (IRM) à la pathologie permet de faire progresser le diagnostic et la médecine personnalisés. Cependant, les rapports de pathologie sont des résultats sommaires, et l’hétérogénéité inhérente aux tumeurs solides dépasse de loin les capacités humaines de délimitation. Une solution potentielle consiste à effectuer une imagerie ex vivo suivie d’une préparation immédiate de coupes de tissus à l’échelle macroscopique pour permettre l’intégration radiomique de données cellulaires préservant l’espace (par exemple, transcriptomique spatiale, immunofluorescence hautement multiplexe). Pour s’adapter à l’imagerie conventionnelle sur le système, une configuration mobile a été construite, comprenant la transition des pompes vers une source de batterie externe pour fournir une alimentation sans interruption pendant le transport et l’imagerie (Figure 4A). Avec le foie sur la table de TDM, un contraste iodé a été administré et des images ont été obtenues, qui montrent des caractéristiques radiographiques cohérentes avec celles acquises in vivo (Figure 4B).

Application représentative : Perfusion rénale et pancréatique
Inné à sa conception, le système est adaptable à la perfusion d’organes supplémentaires (Figure 4C-F), ce qui évite la nécessité d’un double afflux et réduit ainsi les coûts par utilisation. Pour démontrer, nous avons retiré le circuit veineux porte pour un seul afflux artériel (Figure supplémentaire 2) et perfusé un rein humain (Figure 4C) et un pancréas partiel humain (Figure 4E). Des coupes tissulaires représentatives après perfusion mettent en évidence des glomérules (Figure 4D) et des îlots de Langerhans (Figure 4F).

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Figure 4 : Application représentative des machines de perfusion : imagerie par tomodensitométrie et modularité des organes. (A) Adaptation mobile du système pour le transport. (B) Images CT représentatives du foie avec tumeur après administration d’un produit de contraste iodé in vivo (en haut) et ex vivo après perfusion (en bas). (C) Perfusion rénale humaine sur la machine reconfigurée pour un seul afflux. (D) La coupe tissulaire post-perfusion montre des glomérules rénaux et des canaux collecteurs (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, 8x ; barre d’échelle 250 μm). (E) Perfusion du pancréas distal humain sur l’appareil reconfiguré pour un seul flux. (F) La coupe tissulaire post-perfusion met en évidence les îlots pancréatiques (coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, 8x ; barre d’échelle 250 μm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Paramètres de code Python pour faciliter la perfusion semi-automatisée. Schéma illustrant les paramètres d’entrée et de sortie utilisés par le code permettant la semi-automatisation avec l’ajout d’ajustements manuels couramment utilisés (tableau). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Schéma d’entrée unique utilisé pour la perfusion rénale et pancréatique. Capteur P/F : Capteurs de pression et de débit. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Optimisation des globules rouges. (A) L’expérience de perfusion sanguine seulement a démontré une hémolyse significativement moins importante dans des conditions de faible régime par rapport à des conditions de régime élevé (p < 0,01) en utilisant de l’hémoglobine libre comme substitut de la lyse cellulaire. (B) La comparaison qualitative de l’hémolyse plasmatique au fil du temps démontre visuellement moins d’hémolyse dans les états à faible régime par rapport aux états à haut régime. (C-F) Évaluation de l’hémolyse dans des systèmes présentant différents niveaux de résistance et d’intégration en bassin avec des substituts plasmatiques : (C) Une différence significative dans les niveaux de lactate a été déterminée entre la configuration du circuit parallèle et la configuration fermée et la configuration du bassin (p < 0,0001 et p < 0,0001, respectivement). (D) Une différence significative dans les teneurs en potassium a été déterminée entre la configuration du circuit parallèle et la configuration en série fermée et en série avec bassin (p < 0,0001 et p < 0,0001, respectivement). (E) Une différence significative dans les niveaux d’hématocrite a été déterminée entre la configuration du circuit parallèle et la configuration en série fermée et la série avec cuvette (p < 0,0001 et p < 0,0001, respectivement). (F) Une différence significative dans les taux d’hémoglobine a été déterminée entre la configuration du circuit parallèle et la configuration en série fermée et la configuration en série avec bassin (p < 0,0001 et p < 0,0001, respectivement). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Perfusions d’optimisation des organes porcins. Trente-cinq expériences de perfusion porcine réalisées pendant les phases d’optimisation, incluant 25 foies partiels, 2 reins et 8 foies entiers. La durée de la perfusion et la raison de l’interruption de la perfusion sont incluses. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Validation du foie humain et perfusions d’application. Quatorze perfusions hépatiques partielles humaines, y compris des hépatectomies formelles gauche et droite allant des expériences de perfusion à segment unique. Il s’agit de la pathologie, de l’objectif expérimental, de la durée de la perfusion et de la justification de l’interruption. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Optimisation du perfusat uniquement. Vingt-deux exécutions d’optimisation avec perfusat uniquement, y compris le type d’espèce, l’objectif de l’expérience, la durée de l’expérience et la raison de l’arrêt. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

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Les machines de perfusion normatémique couramment utilisées avant la transplantation d’organes solides ont permis des progrès significatifs dans la perfusion ex vivo. Bien que leur utilisation avec des organes partiels soit techniquement réalisable dans certains cas 7,8,9, ils restent inaccessibles pour le chercheur en raison de coûts élevés et de leur disponibilité limitée. Dans ce travail, nous avons cherché à fournir une alternative comparable et open-source à l’ensemble de la communauté de recherche en utilisant des composants facilement sourcés et du code librement accessible pour faire fonctionner le système pour un large éventail de critères de recherche.

Plusieurs étapes du protocole sont essentielles pour obtenir une perfusion stable d’organes. L’une des étapes les plus critiques est la décharge de pression efficace pour prévenir le collapsus parenchymateux et la dilatation sinusoïdale. Cela a été réalisé en mettant en œuvre une mousse à mémoire de forme soutenue par un diaphragme oscillant pour répartir uniformément le poids de l’organe et maintenir une pression de portail proche de celle de l’atmosphère pour un drainage adéquat. L’utilisation initiale d’une grille métallique pour soutenir le foie a entraîné un collapsus parenchymateux et une congestion sinusoïdale, comme observé dans l’analyse histologique et l’imagerie par ultrasons pendant la perfusion. Ce problème a été partiellement résolu en passant à un hamac en silicone perforé. Bien que la nécrose par pression macroscopique ait été résolue, il y avait encore des signes notables de collapsus parenchymateux, comme en témoignent les pressions élevées dans les veines portes et les échantillons considérablement congestionnés après 48 h de perfusion. L’immersion du foie dans une solution saline ou du sang a également été tentée et a réussi à soulager la congestion et l’hypertension portale ; Cependant, cela n’a pas été possible en raison de la grande quantité de perfusat requise, de la difficulté à maintenir la stérilité et de l’absence d’une vidange efficace dans le réservoir. Par rapport à la technique flottante, nous avons observé la même pression portale proche de celle de l’atmosphère lorsque le foie était placé sur un coussin en mousse à mémoire de forme avec un diaphragme oscillant pour répartir le poids de manière plus égale (Figure 1B et Figure 3I). Cette conception permet d’obtenir des segments plus doux et mieux perfusés tout en permettant un drainage facile et efficace de l’écoulement du sang de l’échantillon.

Une deuxième étape critique consiste à minimiser la résistance du circuit qui exerce un stress de cisaillement sur les globules rouges pour prévenir l’hémolyse. Cela a été accompli en introduisant des circuits latéraux avec des composants restrictifs pour faciliter le flux physiologique sans soumettre le perfusat à une pression inutile. L’hémolyse est un processus inévitable et continu pendant la perfusion de la machine. Dans les premières itérations du système, l’hémolyse extensive était un facteur important de l’arrêt précoce. La contrainte de cisaillement que le système transmet aux globules rouges provient principalement des pompes en raison de la stase perfusée et de la recirculation, en plus des diamètres étroits des tubes et des membranes. Les pompes actuellement utilisées provoquent un certain degré d’hémolyse, qui augmente avec le temps. L’efficacité de la pompe est un facteur important dans l’hémolyse, car des débits plus élevés pourraient être bénéfiques en raison de taux plus faibles de recyclage du sang et de débit secondaire, atténués par un volume plus élevé de perfusat et/ou des vitesses de pompe plus faibles. Étant donné que de grands volumes de pGRCs sont souvent difficiles à acquérir, nous avons concentré nos efforts sur la refonte du système pour fournir des débits physiologiques à des vitesses de pompe plus basses, conférant une résistance plus faible dans le circuit global31. Pour réduire davantage la résistance intrinsèque du circuit, nous avons intégré des circuits latéraux en parallèle, ce qui a entraîné des niveaux de lactate et de potassium plus faibles et des taux d’hématocrite et d’hémoglobine plus élevés au fil du temps (Figure supplémentaire 3). Enfin, l’hémofiltre de courant est intégré dans le circuit latéral de la veine porte avec le sang propulsé par une pompe péristaltique qui confère une quantité importante d’hémolyse en raison de la résistance notable et de la contrainte de cisaillement conférées à la fois par le filtre et sa pompe. L’un de nos efforts d’optimisation actuels consiste à supprimer ce circuit latéral en étudiant la mise en œuvre potentielle d’une tubulure d’hémodialyse dans le réservoir. Le retrait des hémofiltres de qualité clinique permettrait de retirer ultérieurement la pompe péristaltique, de minimiser davantage l’hémolyse et de réduire le coût global du système.

Malgré l’utilité et l’adaptabilité du système décrit ici, il convient de reconnaître ses limites. Notamment, la durée de perfusion viable reproductible est de 3 à 4 jours. L’hémolyse reste un facteur central limitant la longévité de la perfusion, comme nous l’avons vu ci-dessus. Cependant, nous avons constaté qu’une augmentation significative du volume total de perfusat peut prolonger considérablement la durée de la perfusion si des temps de perfusion plus longs sont nécessaires, mais cela augmente l’utilisation des ressources au-delà de ce que nous décrivons ici. La durée optimale de la perfusion dépendra en fin de compte de la question expérimentale spécifique posée au système. Par exemple, les études portant sur la cinétique d’administration des médicaments ou l’inhibition de la voie peuvent être menées efficacement sur une période de 2 à 12 h, tandis que les questions impliquant le recrutement cellulaire dans le microenvironnement tumoral peuvent nécessiter 48 h32. L’extension de la viabilité au-delà de la fenêtre actuelle peut être importante pour des applications telles que le remodelage de la matrice extracellulaire (c’est-à-dire la fibrose), mais nous pensons que la plupart des applications liées au cancer ne nécessiteront pas de dépenses de ressources supplémentaires. L’accent était mis sur les applications translationnelles orientées vers l’oncologie, visant à maintenir les tumeurs humaines dans un environnement ex vivo contrôlé dans lequel le traitement peut être administré par le biais d’un parenchyme intact et d’un système vasculaire tumoral, des conditions qui reproduisent plus fidèlement les complexités des scénarios in vivo25. Dans ce scénario, le système résout des problèmes de longue date dans les modèles précliniques actuels d’oncologie liés à l’administration de médicaments, à l’hétérogénéité tumorale et au métabolisme des médicaments, ce qui peut expliquer l’échec fréquent à traduire le succès préclinique en efficacité clinique33,34.

Par rapport aux machines commerciales existantes, le système offre des avantages significatifs en termes de coûts, une évolutivité modulaire et une flexibilité expérimentale. Les dispositifs commerciaux sont souvent exclusifs, coûteux et optimisés pour la perfusion d’organes entiers dans les contextes de transplantation. Le système est évolutif d’une manière que les machines commerciales ne le sont pas, de sorte que nous pouvons envisager son applicabilité à grande échelle. Le système présenté ici n’est pas un produit final, mais plutôt un modèle, qui peut être modifié, adapté et réutilisé pour s’adapter à une grande variété d’intérêts de recherche et de questions expérimentales, comblant ainsi un vide pour les scientifiques de nombreuses disciplines.

Les orientations futures de cette plateforme comprennent la réduction des segments hépatiques sous-segmentaires et du volume de perfusat afin de permettre l’utilisation de produits sanguins autologues pour soutenir les applications d’immuno-oncologie. Nous travaillons également à l’intégration de plateformes multi-omiques et d’imagerie en temps réel pour fournir un suivi dynamique de la réponse au traitement, ouvrant ainsi la voie à des études pharmacologiques détaillées. Nous espérons que le système encouragera la collaboration et l’innovation dans le but de forger de nouvelles profondeurs de connaissances dans plusieurs domaines de la science translationnelle.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans cette étude et ses conclusions. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le programme de recherche intra-muros des National Institutes of Health. Source de financement pour l’imagerie de l’échantillon et la radiomique préliminaire soutenue par le Prix de recherche pour les cliniciens du personnel Proposal ID 231145 à Elliot Levy.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier les groupes suivants à l’égard de ce projet et à exprimer leur reconnaissance à l’égard de ce projet : Département de médecine transfusionnelle des NIH, Département de médecine périopératoire des NIH, Département de pathologie des NIH, Wagner’s Meats.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1/4 » ID x 3/8 » OD x 1/16 » Mur Versilon  ; C-219-A Tube flexible en PVCUS Plastic Corp57682
Seringues de 10 cc avec embout BD Luer-LockBD302995
Seringues de 1 cc avec embout BD Luer-LockBD309628
Canule porte 25 frXVIVO11.01.520
Support de capteur de débit imprimé en 3Dn/an/avoir GitHub pour les fichiers SDL
Support d’aimant imprimé en 3Dn/an/avoir GitHub pour les fichiers SDL
48 po. H x 24 po. W Panneau perforé blancHome Depot109099
Robinet d’arrêt à 4 voies, jaune, 2 Luer femelles Luer, Luer mâle avec spin lockInstruments de précision mondiaux14057-10
Seringues de 50 cc avec embout BD Luer-LockBD309653
ACF00023 Tygon S3  ; par Saint Gobain | 5/16 » D.I. x 1/2 » D.E. x 3/32 » Mur | E-3603 Sans DEHP | Tubes de laboratoire sans phtalates | Longueur du colis de 50 piEntrepôt de tuyauxACF00023
AmphotéricinePharmacie vétérinairen/ahttps://mms.mckesson.com/product/505635/Xgen-Pharmaceuticals-39822105505
Raccord cannelé, connecteur en Y, diamètre intérieur du tube 3/8", PP, 5/PKVWRMFLX06368-24Type de matériau non critique
Calibrateur CDI 540Terumo540CL
Support de tête de câble CDITerumoCDI519CL
Moniteur CDITerumo500AVHCTCL
Pince de poteau CDITerumoCDI517CL
Connecteur de tube Clave IV sans aiguille 100/CAHenry Schein Dental1097422
Clinimix avec électrolytesBaxterRéf. 2B7721N’utilisez que le côté acide aminé, ne mélangez pas avec le côté dextrose
CO2 USP Grade 50 LBL’oxygène de RobertLe R25
Moniteurs d’ordinateur pour interface graphique  ;n/an/atout type d’écran pour l’affichage de l’interface graphique
Dispositif d’acquisition de donnéesCalcul de mesureUSB-202besoin de 2 ou 3, selon la façon dont la machine est connectée
Alimentation de bureau pour pompeLevitronix100-40015besoin de 2, un pour HA un pour PV
Eagle 1662 Entonnoir à tambour avec écran en laiton, 18 » de diamètre x 7 » de hauteur, jauneIndustriel mondialWB440139
ÉpoprosténolPharmacie vétérinairen/ahttps://mms.mckesson.com/product/1239813/Sun-Pharmaceuticals-62756005940
Femelle Luer ¼ ; " barbe en nylon naturel fabriqué en salle blanche ; Paquet de 10VWRMFLX40314-26Type de matériau non critique
Raccord, polypropylène, droit, adaptateur Luer femelle vers arrosage, 1/8" ID ; 25/PKVWRMFLX30800-08Type de matériau non critique
Raccord, polypropylène, droit, adaptateur Luer Lock mâle vers tuyau cannelé, 1/8" ID ; 25/PKVWRMFLX30800-18Type de matériau non critique
Raccord, PVDF, droit, réducteur de cannelure de tuyau, 5/16" ID x ¼ ; " ID ; 10/PKVWRMFLX40614-62Type de matériau non critique
Supports d’écoulement  ;n/an/avoir GitHub pour les fichiers SDL
Pince de capteur de débitCléenceFD-XC20R1
Contrôleur de capteur de débitCléenceFD-XA1
Tête de capteur de débitCléenceFD-XS20
Alimentation du capteur de débitCléenceMS2-H50
Mélangeur de gaz  ;QCMGB100+2besoin de 2, un pour HA un pour PV
Bouteille de gaz A, CDI 500TerumoCDI506
Bouteille de gaz B, CDI 500TerumoCDI507
Kit de glucagon, Glucagon 1 mg, Eau stérile 1 mL, FioleFresenius0593-03
H/S CUVETTE 1/4x1/4 W/6" EXT 1CA=10EA 70-2006-4298-4Terumo6934
Réservoir Hardshell avec 150 µ ; Filtre MSociété d’hémorragie00205-00
Coussin chaud et froid, Mul-T-Pad, tampon TP12E Taille 13 » x 18 » pour pompe Gaymar TP700Mul-T-Pad8002-062-012https://www.amazon.com/Heat-Cold-Mul-T-Pad-Gaymar-TP700/dp/B00HFF7876. De  ; notez que Stryker fournit également des chemises d’eau chauffées similaires au « Mul-T-Pad C2Dx 8002-062-012 »
InsulinePharmacie vétérinairehttps://mms.mckesson.com/product/294668/Novo-Nordisk-Pharmaceutical-00169183311
Ismatec Modèle Ecoline Pump VC-280 IIIsmatecISM1078B-115
Ventilateur pédiatrique LTV 1200Carefusionhttps://coastbiomed.com/product/carefusion-ltv-1200-ventilator/?srsltid=AfmBOopSCKwTLmKhZXcI
CgGQHfiKwj__78jNWxVaznJCS
aq3RjXw2E-H.
Ce modèle de ventilateur pédiatrique a été réutilisé à partir des surplus de l’hôpital et n’a pas été acheté. Toute pompe intermittente commerciale ou machine d’aération est un remplacement approprié.
Câble de pompe principalLevitronix190-10331besoin de 2, un pour HA un pour PV
Solution de préservation d’organes MaPerSol, sac de 1 LSolutions de préservationRéf. PS005
Masterflex  ; Raccords adaptateurs, Luer à Luer, Tee, Avantor  ;VWRMFLX45508-56Type de matériau non critique
Masterflex  ; Femelle Luer 3/16" ID Barb en PVDF naturel Fabriqué en salle blancheVWRMFLX40314-22Type de matériau non critique
Pompe numérique Masterflex Ismatec Reglo avec MasterflexLive, 4 canaux, 8 rouleaux ; 115/230 V c.a.MasterflexMFLX78018-22https://www.avantorsciences.com/us/en/product/NA5139147/masterflex-ismatec-reglo-digital-multichannel-pumps-avantor
Cannelé Masterflex Male Luer 1/4" ID en PVDF naturel Fabriqué en salle blanche, 10/PKVWRMFLX40318-27Type de matériau non critique
Masterflex Male Luer 3/16" ID Barb en PVDF naturel Fabriqué en salle blancheVWRMFLX40318-22Type de matériau non critique
Medline Placenta Basin Standard PlateauxMedLineDYNJSPLACENTA
CANULE VASCULAIRE MEDTRONIC DLP 2", POINTE BISEAUTÉE DE 3 MMsuturesMDT30007
Mousse à mémoire de forme  ;Matelas au meilleur prixhttps://www.amazon.com/Best-Price-Mattress-Twin-Topper/dp/B07999TQWB/ref=sr_1_2_sspa?crid=17LQXX80WX5FK&dib=eyJ2Ijo
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Aimant en néodyme avec trou droit non filetéMcMaster CarrRéférence 336K834
Azote, 125 CU FTGrade 4.5 Haute puretéL’oxygène de RobertR32
Oxygène, 255 CU FTGrade 4.5 Haute puretéL’oxygène de RobertR5
PDMSXA-2500 : PermSelect  ; Module à membrane de 2500 centimètres carrés -- raccord cannelé sans MCCPermselectPDMSXA-2500peut obtenir un ajustement Luer ou barbelé, mais le branchement changera
Phényléphrine HCI injectable, USP 10mg/mL 1mL flaconLa santé d’abord1000520
Champ chauffant en polyuréthane pour systèmes de réchauffement des fluides ORS, stérile, 44 » x 66 »MedLineORS-300H
Sang de porc porcinLampire7204911
Moniteur de capteur de pressionPendoTECHPMAT2HR
ENSEMBLE PRISMAFLEX M60Baxter Healthcare Corp.106696
PrismaSol BGK0/2.5 Solution de remplacement pour le traitement de remplacement rénal continu, NON PVCBaxterANNÉES 110240
Plaque de base de montage de la pompeLevitronix190-10313besoin de 2, un pour HA un pour PV
Adaptateur USB de pompeLevitronix100-30391besoin de 2, un pour HA un pour PV
Système de haut-parleur PuraLevLevitronix100-91025besoin de 2, un pour HA un pour PV
Câble adaptateur IP PuraLev  ;Levitronix190-10475besoin de 2, un pour HA un pour PV
CAPTEUR SHUNT SYS500 - CA = 20EA 98-0702-1541-7TerumoCDI510HPeut acheter périmé des esutures - fonctionnent de la même manière, ont parfois un peu de dérive du pH
Capteur de pression à usage unique, non stérile, polysulfone 1/4 pouce canneléPendoTECHRép. : N-025
Capteurs de pression à usage uniquePendoTECHRép. : N-025Peut être réutilisé avec stérilisation, mais testez le capteur avant chaque utilisation
Bicarbonate de sodium 8,4 % en solution de qualité laboratoireAllée du laboratoire144-55-8
Taurocholate de sodium hydratéMillipore SigmaRéférence 86339-25G
SolumedrolPharmacie vétérinairen/ahttps://mms.mckesson.com/product/1212228/Dr-Reddys-Laboratories-43598013074
Coussin chauffant Stryker  ;AmazoneB01M74Y8DI
Tête de pompe SU, PP, cannelé 3/8", Gamma >25kGy, DCP-30.2-G25, PuraLev  ;Levitronix100-91071peut être réutilisé après la stérilisation  ;
Pousse-seringue (Pump 11 Elite)Appareil de Harvard70-4504besoin d’un pour chaque médicament perfusé
Tube de seringueL’ESGME2020
Chauffe-eau et circulateurSubvention scientifiqueTC120
ZosynPharmacie vétérinairen/ahttps://mms.mckesson.com/product/1009456/Auromedics-Pharmaceuticals-55150011930

Références

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