Article de méthode

Cartographie des interactions protéine-protéine dysfonctionnelles dans la maladie

DOI :

10.3791/69197

⸱

24 octobre 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Chemical Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Department of Neuroscience and Physiology, NYU Grossman School of Medicine, 3Proteomics Core, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4NYU Neuroscience Institute, NYU Grossman School of Medicine, 5Department of Medicine, Division of Solid Tumors, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole permettant la capture et l’identification d’interactions protéine-protéine spécifiques à une maladie à partir de cellules et de tissus natifs à l’aide de sondes chimiques et de spectrométrie de masse. Les ensembles de données d’interaction qui en résultent sont analysés par le biais d’une plate-forme Web dédiée pour révéler les dysfonctionnements dynamiques du réseau et les altérations des voies liées à la maladie.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP) sont remodelés dynamiquement dans la maladie, mais la plupart des approches de biologie des systèmes se concentrent sur les changements dans l’abondance des protéines, négligeant le dysfonctionnement critique au niveau de l’interaction. Ici, nous présentons une méthode chimioprotéomique robuste - l’interactome protéine-protéine dysfonctionnel (dfPPI) - qui permet une cartographie à haut débit, systématique et contextuelle de la maladie des dysfonctionnements du réseau d’IPP dans les cellules et les tissus humains primaires. Cette méthode intègre des sondes de biologie chimique qui capturent sélectivement des assemblages d’interactomes basés sur l’épichapérome avec chromatographie en phase liquide sans marquage-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) et une analyse computationnelle basée sur le réseau, afin de découvrir le recâblage des réseaux de protéines non apparent à partir des seules données transcriptomiques ou protéomiques. La plateforme dfPPI peut être appliquée à l’ensemble des maladies, des espèces et des tissus pour identifier les nœuds de dysfonctionnement exploitables et permettre d’obtenir des informations à haute résolution au niveau des systèmes sur la progression de la maladie. Dans ce protocole, nous démontrons les procédures étape par étape pour la préparation des échantillons, le traitement des sondes chimiques, l’enrichissement par affinité, l’analyse LC-MS/MS sans marquage et les flux de travail bioinformatiques utilisés pour générer et interpréter des ensembles de données dfPPI. Cet article vise à promouvoir la reproductibilité et l’accessibilité de cette approche, en soutenant son adoption par les communautés plus larges de la biologie des systèmes et de la recherche translationnelle.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fonction des cellules, et par extension des organismes, dépend de la coordination précise des réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP) 1,2. Ces réseaux sont responsables de l’organisation et de l’exécution de presque tous les processus biologiques. Alors que les réseaux d’IPP sont intrinsèquement dynamiques et réactifs au stress, en cas de maladie, ils peuvent devenir anormalement recâblés, entraînant des fonctions inadaptées. Il est important de noter que ce recâblage n’implique pas nécessairement des changements dans l’expression des gènes ou des protéines ; elle résulte plutôt d’interactions physiques modifiées entre des protéines qui sont normalement exprimées 3,4,5. Les approches traditionnelles de la biologie des systèmes, telles que la transcriptomique ou la protéomique, ne parviennent pas à saisir ces changements critiques au niveau de l’interaction.

Les technologies de cartographie PPI ont considérablement progressé, offrant des informations sur l’organisation et la régulation des réseaux cellulaires 6,7,8,9,10,11. Les approches couramment utilisées, notamment la spectrométrie de masse par purification d’affinité (AP-MS), la cross-link (XL)-MS, le marquage de proximité et le cofractionnement, offrent chacune des avantages spécifiques, tels qu’une spécificité élevée, une résolution spatiale ou la capacité de détecter des complexes transitoires 6,8,9,10,11 . Cependant, ces méthodes nécessitent souvent des protéines d’appât, des manipulations génétiques ou une bio-informatique complexe, et peuvent avoir du mal à capturer le recâblage à grande échelle des réseaux de protéines dans les systèmes biologiques natifs 6,7,8,9,10,11 . La plupart manquent également d’évolutivité, ce qui les rend peu pratiques pour analyser de grandes cohortes d’échantillons ou cartographier systématiquement les changements d’interactome entre les conditions, les types de cellules ou les points temporels 6,7,8,9,10,11 (tableau 1).

Pour combler cette lacune, nous avons développé la plateforme dfPPI (dysfunctional Protein-Protein Interactome), une méthode chimioprotémique qui identifie directement les dysfonctionnements du réseau d’IPP responsables des phénotypes12 de la maladie. Il s’appuie sur une connaissance biologique clé : dans les états pathologiques, un sous-ensemble de chaperons moléculaires forme des échafaudages supramoléculaires appelés épichapéromes 13,14,15. Ces structures n’agissent pas dans le repliement des protéines, mais fonctionnent plutôt comme des centres d’interaction d’échafaudage qui réorganisent la connectivité des protéines3. De manière cruciale, les protéines séquestrées dans les épichapéromes ne sont pas aléatoires ; Ce sont ceux qui participent activement au maintien du phénotype 16,17,18,19,20 de la maladie. En capturant ces protéines liées à l’épichapérome et leurs interacteurs, dfPPI identifie les altérations exactes du réseau à l’origine d’états pathologiques spécifiques. Le recâblage du réseau piloté par l’épichapérome est répandu dans toutes les maladies - la majorité dans les cohortes de la maladie d’Alzheimer et ~70 % dans les échantillons de cancer16,20 - soutenant l’applicabilité de dfPPI à de grandes études axées sur la maladie.

La plateforme dfPPI englobe l’ensemble du flux de travail, de la préparation des échantillons, de la capture d’affinité de l’épichapérome et de l’identification de l’interactome par MS, aux analyses bioinformatiques en aval telles que l’enrichissement des voies et la modélisation des réseaux de protéines fonctionnelles (Figure 1). La méthode utilise des sondes chimiques spécifiques à l’épichapérome immobilisées sur des matrices d’affinité (billes PU ou autres sondes)13,16,17 pour isoler l’interactome fonctionnel des cellules ou des tissus. Ces sondes ont déjà été rigoureusement validées dans de multiples publications pour leur spécificité aux épichapéromes et leur aptitude pour les dfPPI 16,17,18,20,21,22. Les complexes capturés sont soumis à la spectrométrie MS, à l’aide de flux de travail de digestion sur bille et dans le gel, suivis d’une LC-MS/MS sans marquage. Les données résultantes peuvent ensuite être analysées par le biais d’un pipeline bioinformatique dédié qui définit le dysfonctionnement au niveau de l’interaction et le relie aux processus biologiques et aux phénotypes. Parce que les épichapéromes échafaudent des interactions spécifiques au contexte 17,18,20, le dfPPI révèle comment les réseaux de protéines sont remodelés dans une maladie, un type de cellule ou un stade particulier, ce qui en fait un puissant outil de biologie des systèmes pour le phénotypage de précision.

La méthode est hautement évolutive et a été appliquée à des centaines d’échantillons cliniques et expérimentaux, y compris des tissus humains post-mortem et des cellules cultivées, pour diverses maladies telles que le cancer et la neurodégénérescence 16,17,18,19,20,22,23 . En découvrant les modifications de l’IPP qui définissent un état pathologique, l’IPDf permet à la fois une compréhension mécaniste et la découverte de cibles thérapeutiques exploitables 16,17,18,19,20,22,23.

Dans ce protocole, nous décrivons en détail les composants expérimentaux de la plateforme dfPPI, de la capture d’affinité des interactomes liés à l’épichapérome à la préparation d’échantillons pour LC-MS/MS jusqu’à l’identification d’interactomes via MS. Le pipeline d’analyse computationnelle, c’est-à-dire ce qui est fait avec la liste des protéines identifiées par MS pour définir les interactions différentielles et les conséquences fonctionnelles, n’est pas couvert ici en raison de contraintes d’espace. Cependant, il est librement accessible et largement documenté via l’application dfPPI Shiny à l’https://epichaperomics.mskcc.org (mise à jour en https://dfppi.mskcc.org) et sur le site Web de Chiosis Lab à l’https://www.chiosislab.com/resources. En plus de ces portails, le pipeline bioinformatique complet et les scripts qui l’accompagnent sont inclus dans plusieurs publications appliquant le dfPPI au cancer 16,17,19 et à la maladie d’Alzheimer18,20.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole suit les lignes directrices du comité d’éthique de la recherche sur les êtres humains et du comité du soin et de l’utilisation des animaux de notre établissement. L’équipement et les réactifs utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’échantillon pour la capture d’affinité

  1. Extraction de protéines à partir de tissus
    REMARQUE : Ce protocole a été optimisé pour les échantillons de tissu cérébral post-mortem.
    1. Préparez un tampon d’extraction de protéines contenant 20 mM de Tris (pH 7,5), 20 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 et 0,01 % de NP-40 (tampon de lyse natif). Ajouter des inhibiteurs de protéase et de phosphatase immédiatement avant l’utilisation. Gardez le tampon sur de la glace.
    2. Placez le tissu congelé (volume cible d’environ 50 mm³) dans un tube d’homogénéisation de microtissus, qui se compose d’un tube de microcentrifugation spécialisé de 1,5 mL équipé d’un pilon. Ajouter 500 à 700 μL de tampon de lyse natif, en ajustant le volume en fonction de la compacité des tissus et de la facilité d’homogénéisation. Homogénéiser l’échantillon sur de la glace en déplaçant doucement le pilon de haut en bas et contre les parois abrasives du tube d’homogénéisation jusqu’à ce qu’une suspension homogène se forme.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes sur la glace pour maintenir les assemblages de protéines dans leur configuration native et pour éviter la dégradation des protéines.
    3. Incuber les lysats à 4 °C pendant 30 min en plaçant le flacon sur une unité de rotation. Mélangez délicatement les échantillons pendant l’incubation en les faisant tourner.
    4. Centrifuger les échantillons à 13 000 × g pendant 10 min à 4 °C à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse pour éliminer les débris.
    5. Recueillir les surnageants et les transférer dans des tubes de microcentrifugation transparents de 1,5 ml. Évitez de déranger le granulé pendant le transfert.
    6. Déterminer la concentration totale en protéines dans le surnageant à l’aide de la trousse de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) conformément aux instructions du fabricant.
      REMARQUE : Les lysats de protéines peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à leur utilisation. Évitez les cycles de gel-dégel répétés. Se référer à une publication précédente24 pour l’impact des cycles répétés de gel-dégel et de la température de stockage sur l’intégrité des assemblages de protéines.
  2. Normalisation de l’échantillon
    REMARQUE : HSP90α et HSP90β sont des composants essentiels de l’épichapérome et sont les partenaires de liaison directe de la sonde chimique utilisée pour la capture de l’interactome 13,21,23. La normalisation des échantillons basée sur HSP90α (ou HSP90β) garantit que la quantité d’épichapérome pouvant être ciblée par la sonde est adaptée à travers les échantillons, ce qui est essentiel pour une comparaison précise des interactomes capturés. Les échantillons peuvent être normalisés en fonction des niveaux de HSP90 déterminés par Western blot, mais d’autres méthodes peuvent également être utilisées. Si les niveaux de HSP90 sont comparables d’un échantillon à l’autre, ignorez cette section et passez à l’étape 1.3. L’utilisation du transfert HSP90α/β ici est uniquement destinée à la normalisation des entrées et ne doit pas être interprétée comme une mesure de l’abondance de l’épichaperome.
    1. Préparez 2× tampons d’échantillon Laemmli composés de 4 % de dodécylsulfate de sodium (SDS), 20 % de glycérol, 10 % de 2-mercaptoéthanol, 0,02 % de bleu de bromophénol et 0,125 M Tris-HCl, pH ~6,8.
      ATTENTION : Le 2-mercaptoéthanol est toxique et volatil et doit être manipulé dans une hotte.
    2. Combiner 5 μg de l’extrait total de protéines cérébrales (de l’étape 1.1) 1:1 (v/v) avec 2× tampon d’échantillon Laemmli dans un tube de microcentrifugation transparent de 1,5 mL.
    3. Chauffer les échantillons à 95 °C pendant 3 à 5 minutes dans une unité de chauffage pour dénaturer les protéines avant de les charger sur électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE).
    4. Chargez les échantillons sur des gels de protéines Tris-Glycine préfabriqués à 8 %. Vous pouvez également utiliser des gels moulés à la main.
    5. Chargez 5 μL d’étalon protéique pré-coloré sur chaque gel, par exemple dans le premier puits, pour déterminer le poids moléculaire de la protéine.
    6. Faites fonctionner les gels dans un tampon de fonctionnement TGS (Tris-Glycine-SDS) de 1× à RT. La durée de fonctionnement typique est de 1,5 à 2 h à 100 V.
    7. Préparez un tampon de transfert contenant 25 mM de Tris, 192 mM de glycine et 20 % de méthanol.
      ATTENTION : Le méthanol est inflammable et doit être manipulé conformément aux consignes de sécurité.
    8. Transférez les protéines sur une membrane de nitrocellulose dans un tampon de transfert à 4 °C pendant 60 min à tension constante (100 V).
    9. Préparez une solution de lavage à membrane (1× TBS-0,1 % Tween-20) et une solution de blocage (5 % de lait dans 1× TBS-0,1 % Tween-20). Ce protocole utilise du lait écrémé en poudre provenant d’une source commerciale.
    10. Placez la membrane dans une solution de blocage pendant 1 h à température ambiante (RT) en l’agitant doucement sur une bascule de plate-forme. Utilisez 10 ml de solution bloquante par mini gel.
    11. Retirer la solution bloquante et incuber la membrane avec l’anticorps anti-HSP90α (dilution 1:6 000 dans une solution bloquante de 10 mL) pendant une nuit à 4 °C sur une plate-forme à bascule.
    12. Retirez la solution d’anticorps et lavez la membrane trois fois pendant 5 minutes chacune avec 10 ml de solution de lavage.
    13. Ajouter l’anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à la HRP (dilution 1:5 000 dans 10 mL 1× TBS-0,1 % Tween-20) et incuber pendant 1 h à RT sur une plate-forme à bascule.
    14. Retirez l’anticorps secondaire et lavez la membrane quatre fois avec une solution de lavage (même volume et même moment que ci-dessus).
    15. Détectez le signal chimiluminescent spécifique à HSP90α à l’aide d’un kit de chimiluminescence améliorée (ECL) conformément aux instructions du fabricant. Utilisez un système d’imagerie par chimiluminescence ou un film autoradiographique.
    16. Quantifiez les niveaux de HSP90α dans les échantillons en fonction de l’intensité du signal et calculez un facteur de normalisation pour le pull-down en aval.
      REMARQUE : L’intensité du signal HSP90 reflète la quantité d’épichapérome pouvant être ciblée par sonde dans chaque échantillon. En comparant l’intensité du signal entre les échantillons et en le normalisant à un échantillon de référence sur chaque gel, les volumes d’entrée pour la capture de l’interactome peuvent être ajustés en conséquence. La quantification peut être effectuée à l’aide d’un logiciel de densitométrie. Incluez toujours une aliquote d’un échantillon de référence sur chaque gel pour permettre la normalisation entre les transferts.
  3. Préparation des billes de PU
    REMARQUE : Les billes de PU et les billes de contrôle peuvent être synthétisées en interne comme indiqué précédemment21,25 ou demandées au laboratoire Chiosis lors de l’exécution d’un accord de transfert de matériel (ATM). Ils doivent être conservés à -20 °C dans de l’isopropanol.
    1. Prélever une aliquote de billes de polyuréthane (PU) ou des billes de contrôle directement à partir de la pâte d’isopropanol. Incluez environ 30 % d’excédent pour tenir compte de la perte de billes pendant le lavage et la manipulation.
    2. Retirez le solvant de stockage : laissez les billes se déposer, puis aspirez l’isopropanol. Ajouter un tampon de lyse natif (1 mL pour un tube de 1,5 mL ; 5 mL pour un conique de 15 mL) et remettre complètement en suspension par pipetage doux ou inversion.
    3. Laver et équilibrer trois fois : pour chaque lavage, vortex pour remettre en suspension, centrifuger (tube 1,5 mL : 10 000 × g, 1 min ; 15 mL conique : 3 000 × g, 5 min), puis aspirer le surnageant à l’aide d’une conduite de vide munie d’une pointe de pipette en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    4. Ajoutez un tampon de lyse natif aux billes lavées à un rapport de volume de 1:1 (billes :tampon) pour générer une boue de travail uniforme.
    5. Aliquote 40 μL de boue de billes de PU (ou billes de contrôle) (p. ex., billes v/v 1:1:1 :tampon) par échantillon dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Utilisez une pointe de pipette dont l’extrémité est coupée pour faciliter la distribution des billes.
      REMARQUE : Les billes de PU sont sensibles à la lumière. Utilisez des tubes de 1,5 ml foncés ou enveloppés d’aluminium pendant les étapes de rétraction. En raison de leur revêtement de surface hydrophobe avec la petite molécule épichapérome, les billes de PU ont tendance à s’agglutiner et à adhérer aux surfaces en plastique. Pipeter doucement et bien mélanger pour assurer une remise en suspension uniforme. Il est essentiel de distribuer des volumes égaux de boue de billes dans chaque échantillon pour éviter la variabilité de la capture des protéines, ce qui peut conduire à des résultats incohérents ou non reproductibles.
    6. Lavez les billes trois fois avec un tampon de lyse natif en ajoutant 1 mL de tampon dans chaque tube, en faisant un vortex, en centrifugant à 10 000 × g pendant 1 min et en jetant le surnageant par aspiration. Assurez-vous que les billes sont complètement remises en suspension entre chaque lavage.
      REMARQUE : Lors de l’aspiration, évitez de toucher les billes. Appuyez doucement la pointe de la pipette contre la paroi du tube tout en retirant le liquide.
    7. Après le lavage final, retirez la majeure partie du liquide des tubes, en prenant soin de ne pas déranger la bille de bille.
      REMARQUE : Les billes lavées peuvent être stockées à 4 °C pendant quelques jours. En règle générale, les perles sont utilisées dans les 1 à 2 jours suivant la préparation.
  4. Tirage de l’interactome
    REMARQUE : La première étape du tirage est une étape de pré-nettoyage à l’aide de billes de contrôle, qui sont conjuguées à une petite molécule inerte qui ne lie pas les épichapéromes16. Cette étape élimine les protéines, les agrégats et les débris insolubles qui interagissent de manière non spécifique du lysat, améliorant ainsi la spécificité de l’extraction ultérieure des billes de PU. Le pré-nettoyage réduit la liaison de fond et améliore la détection de protéines spécifiques associées à l’épichapérome.
    L’interactome récupéré par ce protocole est analysé par la MS, qui est très sensible aux contaminants expérimentaux. Pour garantir une identification précise des protéines et préserver la qualité des données, utilisez toujours des tampons et des réactifs fraîchement préparés, minimisez l’exposition à la poussière et à la kératine et portez des gants propres et non poudrés lors de la manipulation d’échantillons, de consommables ou d’équipements. Utilisez de la verrerie/des consommables dédiés à MS pour toutes les étapes de digestion dans le gel et dans le gel, et gardez tous les articles utilisés pour le transfert Western physiquement séparés. Si vous réutilisez de la verrerie, décontaminez en rinçant séquentiellement avec du méthanol à 100 %, de l’eau ultrapure, de l’acide acétique à 80 %, de l’eau ultrapure, puis séchez à l’air. N’utilisez pas de détergents ; même les résidus à l’état de traces peuvent encrasser les colonnes LC et les sources d’ions.
    1. Ajouter les extraits protéiques normalisés (conformément à l’étape 1.2, calculés en fonction de l’intensité du transfert HSP90) dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 mL contenant 40 μL de boue de billes de contrôle (c.-à-d. billes de 20 μL + tampon de 20 μL), et ajuster le volume final à 250 μL en ajoutant le volume approprié de tampon de lyse natif.
      REMARQUE : Pour déterminer les volumes d’entrée spécifiques à l’échantillon, utilisez la formule A1 = (60 / C1) × X1, où A1 est le volume de protéines totales normalisées à ajouter (μL), C1 est la concentration protéique mesurée (μg/μL) et X1 est le facteur de normalisation dérivé du transfert HSP90 (comme décrit à l’étape 1.2). Le volume de tampon supplémentaire à ajouter est calculé comme suit : 250 μL moins A1. Si la normalisation n’est pas nécessaire, utilisez 250 μg de protéines totales dans 250 μL.
    2. Incuber les échantillons à 4 °C pendant 30 min avec rotation sur un rotateur bout à bout (10-15 tr/min).
    3. Centrifugez les tubes à 10 000 × g pendant 1 min à 4 °C pour granuler les billes de contrôle avec des protéines agrégées ou insolubles.
    4. Prélever soigneusement le surnageant des billes de contrôle à l’aide d’une pipette de 1 mL et le transférer dans des tubes de 1,5 mL contenant 40 μL de boue de billes de PU lavées.
    5. Incuber les échantillons à 4 °C pendant 3 h avec rotation sur un rotateur bout à bout (10-15 tr/min).
    6. Centrifugez chaque tube à 10 000 × g pendant 1 min, aspirez le surnageant et lavez les billes quatre fois avec 1 mL de tampon de lyse natif. Pour chaque lavage : vortex, centrifugeuse et aspiration, en utilisant les paramètres décrits à l’étape 1.3.
      REMARQUE : À ce stade, les échantillons peuvent être traités pour la LC-MS/MS à l’aide de l’un des deux flux de travail suivants : (1) SDS-PAGE suivi d’une digestion dans le gel, ou (2) digestion sur bille des protéines capturées.
      Pour le flux de travail de digestion dans le gel, continuez avec le protocole tel qu’il est écrit. Pour la digestion sur les billes, lavez les billes deux fois de plus avec du PBS froid et passez immédiatement à la section 3. Ne congelez pas les billes si vous procédez à la digestion sur les billes ; Les échantillons doivent être traités frais le jour même. La congélation de complexes protéiques liés à des billes peut nuire à l’efficacité de la digestion en favorisant l’agrégation ou la perte de solubilité des protéines, ce qui entraîne une récupération plus faible des peptides et une variabilité accrue. Selon les recommandations de MS, les échantillons doivent être traités frais le jour même pour assurer une digestion uniforme sur les billes.
  5. Préparation des échantillons pour la digestion en gel
    1. Ajouter 25 μL de tampon d’échantillon Laemmli 2× aux échantillons de billes préparés à l’étape 1.4.6, qui sont contenus dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL.
      REMARQUE : Les échantillons à ce stade peuvent être stockés à -80 °C jusqu’à 24 h. Chargez toujours tout le volume d’échantillon dans le gel SDS-PAGE pour la digestion dans le gel afin de maximiser la couverture du protéome et d’assurer une représentation complète de l’interactome. Le chargement partiel n’est pas recommandé. Si le volume de l’échantillon est limité et qu’une charge partielle est inévitable, le matériau restant doit être stocké dans des aliquotes afin de minimiser les cycles de gel-dégel et de préserver l’intégrité de l’interaction.
    2. Chauffer chaque échantillon à 95 °C pendant 3 min (avec le tampon d’échantillon Laemmli de 2 × ajouté, comme ci-dessus) pour dénaturer les complexes protéiques et les éluer des billes avant de les charger sur SDS-PAGE. Le SDS et les agents réducteurs dans le tampon perturbent les IPP et libèrent des protéines de la matrice.
    3. Centrifuger chaque tube à 10 000 × g pendant 1 min à RT.
    4. Chargez chaque surnageant sur des gels SDS-PAGE à gradient prémoulé de 4 à 20 %.
    5. Faites fonctionner les gels dans un tampon de fonctionnement TGS de 1× à RT et arrêtez le passage à mi-chemin (~3,5-4 cm dans le gel à 100 V, généralement 30-60 min d’autonomie).
    6. Retirez le gel de l’unité d’électrophorèse et procédez à la coloration avec du bleu brillant Coomassie selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Le gel coloré, immergé dans 5 à 7 mL d’eau ultrapure dans un récipient en plastique, peut être transporté à l’installation MS pour l’identification des protéines. S’il n’est pas immédiatement transformé, conserver à 4 °C dans de l’eau ultra-pure jusqu’à 1 à 2 semaines. Deux flux de travail protéomiques alternatifs ont été utilisés en fonction de la plate-forme qui a effectué les travaux et des objectifs expérimentaux : la section 2 décrit la digestion dans le gel suivie d’une analyse par spectromètre de masse à orbite quadripolaire à l’aide d’un spectromètre de masse orbitrap quadripolaire ; La section 3 détaille un protocole de digestion sur bille optimisé pour la spectrométrie de mobilité des ions piégés avec fragmentation en série par accumulation parallèle (diaPASEF)26. Les étapes peuvent faire l’objet de renvois le cas échéant.

2. Identification des protéines par LC-MS/MS avec digestion des protéines en gel

  1. Réduction et alkylation en gel de protéines cystéinylées
    1. Excisez la région tachée de chaque couloir de gel coloré à Coomessie et coupez-la en environ cinq tranches de gel de taille égale. Décolorer chaque tranche en l’incubant trois fois dans 500 μL de méthanol à 50 % (v/v) pendant 1 min à 37 °C avec agitation à 700 tr/min sur un agitateur à microtubes à température contrôlée.
      REMARQUE : Chaque tranche de gel ne doit pas dépasser ~1 cm × 0,5 cm × 1 cm pour assurer une diffusion efficace des réactifs dans les étapes ultérieures ainsi qu’une digestion efficace de la trypsine dans le gel pendant la nuit. Exciser la région du gel correspondant aux protéines fortement colorées, telles que HSP90 et HSC70, qui représentent les liants directs de la sonde chimique et les composants centraux de l’épichapérome15, 16, 23, séparément du reste du gel. Leur abondance élevée pourrait autrement interférer avec la détection et la quantification d’interacteurs de faible abondance lors de l’analyse LC-MS/MS.
    2. Incuber chaque tranche de gel dans 500 μL de bicarbonate d’ammonium (ABC) de 5 mM préparé dans de l’acétonitrile à 30 % (ACN) à 37 °C avec agitation à 700 tr/min sur un agitateur de microtubes à température contrôlée pendant 15 min pour éliminer la tache résiduelle. Répétez l’incubation jusqu’à ce que la tranche de gel soit complètement décolorée.
      REMARQUE : Toute coloration protéique visible restante peut interférer avec la liaison du peptide à la matrice C18 pendant l’étape de nettoyage du peptide, réduisant ainsi la récupération et la sensibilité à la MS en aval.
    3. Retirer et jeter la solution ABC/ACN à l’aide d’une pipette à pointe fine, en prenant soin de ne pas perdre les morceaux de gel (c’est-à-dire ne pas aspirer les morceaux de gel avec le liquide). Ajoutez ensuite 500 μL d’ACN à 100 % dans chaque tube, en vous assurant que les morceaux de gel sont complètement immergés. Incuber à RT sur un agitateur orbital à 700 tr/min pendant 10 min, ou jusqu’à ce que les morceaux de gel deviennent translucides, rétrécissent en taille et prennent l’apparence d’un papier blanc.
      ATTENTION : L’ACN est inflammable et doit être manipulé dans une hotte.
    4. Retirez et jetez l’ACN de chaque tube à l’aide d’une pipette à pointe fine, en prenant soin de ne pas aspirer les morceaux de gel. Centrifuger brièvement à 1 000 × g pendant 10 s pour recueillir le liquide résiduel, puis aspirer soigneusement les gouttelettes restantes à l’aide d’une pipette à pointe fine. Placez les tubes ouverts dans une centrifugeuse sous vide à RT pendant 10 à 15 minutes, ou jusqu’à ce que les tranches de gel soient sèches et rigides.
      REMARQUE : Ne pas trop sécher. Vérifiez périodiquement pour éviter la fissuration ou le rétrécissement excessif des morceaux de gel. Une fois séchés, conservez les morceaux de gel à 4 °C dans un tube scellé à faible liaison ou un tube de microcentrifugation jusqu’à la digestion ; Les protéines gélatineuses et purifiées sont stables jusqu’à plusieurs jours lorsqu’elles sont conservées à 4 °C.
    5. Réduction : Ajouter ~100 μL de 10 mM de dithiothréitol (DTT) (préparé frais à partir de 500 mM de stock dans 50 mM de bicarbonate d’ammonium) dans chaque tube d’échantillon, en veillant à ce que les morceaux de gel soient complètement immergés. Incuber à 56 °C pendant 45 min avec agitation à 700 tr/min sur un agitateur à microtubes à température contrôlée.
      ATTENTION : Le DTT est un irritant cutané et respiratoire. Manipulez l’intérieur d’une hotte chimique et portez des gants.
      REMARQUE : Assurez-vous que les tubes sont bien fermés pendant l’incubation pour éviter l’évaporation et maintenir la concentration de DTT.
    6. Alkylation : Prélever la solution de DTT de chaque tube à l’aide d’une pipette à pointe fine, en prenant soin de ne pas déranger les morceaux de gel. Ajouter immédiatement ~100 μL d’iodoacétamide (IAA) de 55 mM dans 50 mM ABC pour couvrir complètement les tranches de gel. Incuber à RT avec agitation à 700 tr/min pendant 30 min dans l’obscurité.
      ATTENTION : L’IAA est toxique et sensible à la lumière. Effectuer toutes les manipulations dans une hotte tout en portant des gants.
      REMARQUE : Assurez-vous de l’élimination complète du DTT avant d’ajouter de l’IAA pour éviter d’éteindre la réaction d’alkylation. Enveloppez les tubes dans du papier d’aluminium ou utilisez des récipients bloquant la lumière pendant l’incubation pour minimiser la dégradation de l’AIA.
    7. Centrifuger brièvement les tubes à 1 000 × g pendant 5 s à RT pour recueillir le liquide résiduel au fond. Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette à alésage fin (par exemple, une pointe P10) pour éviter de déranger les morceaux de gel. Inclinez légèrement le tube et aspirez par le bord pour minimiser le risque d’aspiration de fragments de gel.
    8. Équilibrer : Couvrir les morceaux de gel avec 500 μL de 50 mM ABC dans 30 % ACN. Incuber à RT pendant 10 min, en agitant à 700 tr/min sur un agitateur orbital chauffé. Cette étape permet d’éliminer l’excès de réactif d’alkylation et d’équilibrer le gel avant la déshydratation.
    9. Retirer la solution : Tourner brièvement à 1 000 × g pendant 5 s et jeter le surnageant à l’aide d’une pipette à pointe fine, comme décrit ci-dessus.
    10. Déshydrater à nouveau : Répéter les étapes 2.1.3 et 2.1.4 pour déshydrater à nouveau les morceaux de gel à l’aide d’un ACN à 100 %, suivi d’une centrifugation sous vide jusqu’à ce qu’ils soient secs. Cette étape assure une récupération optimale des peptides lors de la digestion enzymatique.
  2. Protéolyse en gel et nettoyage des peptides
    1. Digérer les échantillons de gel séché en ajoutant de la trypsine de qualité MS à une concentration finale de 5 ng/μL dans 50 mM d’ABC pour réhydrater complètement les morceaux de gel (généralement un volume total de 50 à 100 μL, ou suffisamment pour couvrir les tranches de gel). Incuber toute la nuit à 37 °C dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 ml, en veillant à ce que les tubes soient hermétiquement fermés pour éviter l’évaporation. Agitez doucement si possible (par exemple, 300 tr/min sur un agitateur à microtubes à température contrôlée).
    2. Acidifiez l’échantillon après la digestion pendant la nuit en ajoutant 10 % d’acide formique (AF) goutte à goutte pour obtenir une concentration finale de 1 % (v/v) (p. ex. ajouter 1 μL de 10 % d’AF à 100 μL de digestion). Mélangez doucement, puis sonisez les tubes pendant 10 min dans un sonicateur RT au bain-marie pour améliorer l’extraction des peptides.
    3. Retirer avec précaution le surnageant contenant le peptide à l’aide d’une pipette à pointe fine (par exemple, une pointe P10 à alésage étroit), en prenant soin de ne pas perturber la matrice de gel ou d’aspirer des fragments de gel. Transférez le surnageant recueilli dans un tube de 500 μL à faible liaison et placez-le sur de la glace.
    4. Ajouter une solution à 5 % d’AGA et à 50 % d’ACN (v/v) dans chaque tube (généralement ~50 à 100 μL, ou suffisamment pour couvrir complètement les morceaux de gel) et agiter doucement à l’heure de l’air (p. ex., sur un agitateur à 70 tr/min pendant 10 à 15 min) pour extraire les peptides résiduels. Prélevez soigneusement le surnageant et combinez-le avec la solution peptidique d’origine de l’étape 2.2.3.
    5. Concentrez l’extrait peptidique combiné en utilisant la centrifugation sous vide à RT (par exemple, 1 000 × g pendant ~30 min) jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une petite gouttelette. Ne laissez pas l’échantillon sécher complètement, car cela pourrait entraîner une perte de peptides due à l’adhérence aux parois du tube. Utilisez l’extrait partiellement séché soit immédiatement pour le dessalage, soit à conserver à -20 °C dans un tube scellé à faible liaison.
    6. Dessaler les peptides à l’aide d’embouts de pipette en C18 à petite échelle emballés à la main (c.-à-d. StageTips) préparés avec deux disques d’extraction en C18 empilés insérés dans une pointe de pipette de 200 μL, comme décrit précédemment27, avec les modifications suivantes :
    7. Activez les disques C18 en ajoutant 40 μL de méthanol. Centrifuger la pointe de la pipette contenant les disques (insérée dans une pointe de pipette vide de 200 μL et placée à l’intérieur d’un tube de 500 μL) à l’aide d’une centrifugeuse de paillasse à 1 500 × g pendant 3 min.
      REMARQUE : À toutes les étapes, ne laissez pas les disques C18 sécher. Le séchage interférera avec la liaison et l’élution des peptides. Il peut être nécessaire de raccourcir l’embout de pipette extérieur de 200 μL (manchon) contenant l’embout de pipette C18 à petite échelle emballé à la main, en le coupant à ~ 1 cm de l’extrémité pour s’assurer que l’ensemble à deux pointes dans le tube s’adapte correctement à la centrifugeuse.
    8. Équilibrez les disques en ajoutant 0,1 % de FA et en centrifugant comme ci-dessus.
    9. Appliquez la solution peptidique, reconstituée dans 20 μL de FA à 0,1 %, directement sur le dessus des disques empilés.
    10. Centrifuger à 1 500 × g pendant 5 min pour faciliter la liaison des peptides aux disques C18.
    11. Lavez les peptides liés en faisant passer 40 μL de 0,1 % d’AF à travers la colonne.
    12. Elancer les peptides avec 40 μL d’ACN à 70 % contenant 0,1 % d’AF. Stocker les peptides élués dans des tubes à faible liaison à -80 °C jusqu’à l’analyse LC-MS/MS. Évitez les cycles de gel-dégel répétés.
  3. Nano-LC couplé à l’analyse MS par DIA
    1. Concentrez l’éluat peptidique dessalé à l’aide de la centrifugation sous vide (par exemple, 20-30 min à RT, 1 000 × g), en laissant une petite gouttelette. Reconstituez les peptides dans 10 μL de 0,1 % d’AF dans de l’eau de qualité LC-MS en pipetant doucement de haut en bas et en vortex brièvement. Tournez brièvement pour recueillir le liquide au fond du tube avant de continuer.
    2. Analyser 4 aliquotes de 4 μL de l’échantillon de peptide reconstitué par nano-LC-MS/MS. Séparer les peptides sur une colonne de phase inverse auto-emballée (75 μm ID × 2 cm, résine C18, taille de particule 3 μm) maintenue à 50 °C. Préparez la colonne à l’aide d’une bombe à pression28 en tapotant une boue de résine C18 (dans du méthanol, 1:3 v/v) dans un capillaire en silice fondue avec une pointe de pulvérisation intégrée de 10 μm (360 μm OD × 75 μm ID × pointe 10 μm). Interfiez la colonne par ionisation nanospray à un spectromètre de masse hybride haute résolution (type quadripole-Orbitrap) prenant en charge les flux de travail DIA.
      REMARQUE : Une longueur de colonne de 20 cm est recommandée car elle permet une séparation optimale des mélanges de peptides générés à partir de tranches de gel SDS-PAGE.
    3. Maintenez la colonne analytique à 50 °C à l’aide d’un four à colonne ou d’un bloc chauffant pour assurer une rétention et une séparation constantes des peptides. Assurez un contrôle stable de la température tout au long du cycle, car les fluctuations peuvent affecter la reproductibilité.
    4. Éluer les peptides à l’aide d’un gradient linéaire de 3 à 40 % d’ACN dans 0,1 % d’AF pendant 110 min, à un débit de 250 nL/min. Ce gradient permet une séparation efficace des peptides avant la détection de la MS. Le temps total d’analyse, y compris l’équilibrage de la colonne, est de 120 min.
    5. Acquérez des données en mode DIA à l’aide d’un MS haute résolution, comme décrit précédemment29.
      1. Définissez des numérisations de levé MS1 complètes à acquérir en mode profil à une résolution de 120 000 (à m/z 200), sur une plage de balayage de 300 à 1650 m/z. Faites suivre chaque balayage MS1 d’une fragmentation MS2 de 30 fenêtres précurseurs séquentielles (364-1370 Th) à l’aide d’un schéma de fenêtre d’isolation coulissante.
      2. Effectuez la fragmentation à l’aide d’énergies de collision normalisées échelonnées de 25,5, 27,0 et 30,0. L’état de charge maximal par défaut du précurseur est 4. Réglez la première masse fixe dans les balayages MS/MS sur 200 Da et acquérez les spectres MS2 à une résolution de 30 000.
      3. Utilisez un réglage de temps d’injection automatique pour MS2 et un temps d’injection maximum de 60 ms pour MS1. Pour les balayages MS1 et MS2, réglez la cible ionique (AGC) sur 3e6.
  4. Quantification relative des interactomes capturés par affinité
    REMARQUE : Pour quantifier les protéines identifiées dans les analyses DIA-MS d’interactomes d’épichapéromes capturés par affinité, utilisez une plate-forme logicielle qui prend en charge les flux de travail DIA et fournit une quantification fiable basée sur l’intensité peptidique ou le nombre spectral. Ce protocole a utilisé MaxQuant (par exemple, la version 2.5.1.0) et son flux de travail MaxDIA20,29 pour l’identification des peptides/protéines et la quantification basée sur l’intensité sans marquage. Les recherches ont utilisé une stratégie de leurre à séquence inversée avec 1 % de FDR aux niveaux de PSM/peptides et de protéines ; Les entrées « Inverse » et « Contaminant potentiel » ont été filtrées avant la bio-informatique. Aucun spike-in n’a été utilisé ; L’état de préparation de l’instrument a été vérifié avec 250 ng de HeLa digest (et un mélange intermittent de 10 fmol à 6 protéines) répondant aux critères internes d’identification et de stabilité RT.
    1. Analysez les données brutes DIA-MS avec des paramètres cohérents sur tous les échantillons. Inclure jusqu’à deux clivages manqués et définir les modifications suivantes : fixe, carbamidométhylation de la cystéine ; variable, oxydation de la méthionine et acétylation de la protéine N-terminale.
    2. Utiliser une banque spectrale prédite in silico basée sur la base de données de protéines humaines UniProt (par exemple, ~20 000 entrées), en veillant à ce que les séquences de leurres et de contaminants soient incluses pour une estimation précise du taux de fausses découvertes (FDR). Spécifier la digestion tryptique à moins qu’une autre enzyme n’ait été utilisée. Une bibliothèque spectrale humaine validée (basée sur la version UniProt du 18/06/2020, 20 956 entrées) est disponible dans le dépôt30 de l’Institut Max Planck de biochimie.
      REMARQUE : Comme alternative à ce flux de travail avec des bibliothèques prédites, l’étape 3.4 illustre le traitement sans bibliothèque, qui a produit une identification et une quantification comparables sur ces ensembles de données.
    3. Quantifier les abondances de protéines à l’aide de valeurs d’intensité (et non d’intensités de quantification sans marquage [LFQ]), car celles-ci sont plus appropriées pour les analyses de réseau d’IPP en aval. Assurez-vous que LFQ est désélectionné pour éviter les artefacts de normalisation, qui peuvent déformer les données d’enrichissement d’affinité. Au lieu de cela, utilisez des valeurs d’intensité brutes dérivées des correspondances spectrales peptidiques, qui reflètent la force d’interaction plutôt que l’expression globale des protéines. Appliquer des critères de filtrage appropriés (p. ex., au moins un peptide unique par groupe de protéines) pour améliorer la fiabilité de l’identification et de la quantification des protéines. Exporter le tableau d’intensité protéique résultant pour des analyses statistiques et en réseau ultérieures.
      REMARQUE : Contrairement aux flux de travail protéomiques standard, où les valeurs LFQ aident à normaliser la charge protéique sur des lysats entiers, ici les protéines sont enrichies par capture d’affinité des épichapéromes. Cette étape d’enrichissement introduit une variance biologique que la normalisation LFQ peut masquer. Par conséquent, les valeurs d’intensité brute sont préférées, car elles reflètent mieux les interactions différentielles protéine-épichapérome entre les conditions et préservent le signal nécessaire à l’analyse au niveau du réseau en aval (par exemple, dfPPI). Dans des études antérieures utilisant des recherches basées sur Mascot16,18, les valeurs de comptage spectral MS/MS ont également été utilisées à la place des intensités. Dans les flux de travail de capture d’affinité comme celui-ci, les comptages spectraux reflètent la fréquence d’interaction et sont bien adaptés pour identifier les protéines interagissant différemment dans toutes les conditions. Contrairement aux valeurs LFQ, les numérations MS/MS ne supposent pas de normalisation globale dans le protéome, préservant ainsi une variance biologiquement significative de l’étape d’enrichissement de l’épichaperome.

3. Identification des protéines par LC-MS/MS avec digestion des protéines sur bille

  1. Digestion sur bille
    REMARQUE : Pour assurer une récupération optimale des protéines et minimiser la perte d’échantillons lors de la digestion des protéines sur billes pour l’analyse MS, il est essentiel d’utiliser des tubes de microcentrifugation à faible liaison protéique. Ces tubes sont conçus pour réduire l’absorption des protéines par les parois du tube, améliorant ainsi la récupération des échantillons. Tous les réactifs utilisés dans cette section doivent être fraîchement préparés avec de l’eau et des produits chimiques de qualité LC-MS. Si vous soumettez des échantillons à un centre de protéomique, vérifiez les politiques locales, car certaines installations peuvent exiger que tous les tampons soient stérilisés par filtre avant utilisation.
    1. Retirez tout PBS résiduel qui pourrait rester dans le tube à partir de l’étape 1.4.6. Remettre les billes en suspension dans 80 μL d’urée 2 M, fraîchement préparées dans 50 mM ABC, pH 8,5. Assurer un mélange complet par pipetage ou vortex bref.
      REMARQUE : Ajustez le volume proportionnellement en fonction de la quantité et du type de bille. Ce protocole est optimisé pour 40 μL de boue de billes de PU.
    2. Ajouter du DTT pour obtenir une concentration finale de 1 mM.
      REMARQUE : Préparez une solution fraîche de DTT de 10 mM à partir d’une solution mère de DTT de 1 M dans de l’eau de qualité LC-MS immédiatement avant utilisation, car le DTT est sujet à l’oxydation en solution. Ajoutez le volume requis directement à l’échantillon et mélangez doucement par pipetage.
    3. Boucher le tube et incuber à 37 °C pendant 30 min en secouant à 1 100 tr/min sur un agitateur orbital chauffé. Fermez hermétiquement les couvercles pour minimiser l’évaporation.
    4. Ajouter l’AIA pour atteindre une concentration finale de 3,67 mM. Incuber dans l’obscurité à RT pendant 45 min avec agitation à 1 100 tr/min.
      REMARQUE : Préparez un stock IAA frais de 10 mM dans de l’eau de qualité LC-MS immédiatement avant utilisation. Ajoutez le volume requis à l’échantillon et mélangez doucement par pipetage.
    5. Ajouter du DTT supplémentaire pour éteindre l’AIA n’ayant pas réagi, atteignant une concentration finale de 3,67 mM. Mélanger délicatement par pipetage.
      REMARQUE : L’extinction de l’AIA n’ayant pas réagi empêche la sur-alkylation, ce qui peut compromettre l’activité de la protéase et l’efficacité de la digestion. Préparez le DTT frais et calculez le volume en fonction du volume d’échantillon actuel pour atteindre la concentration cible.
    6. Ajouter 750 ng de 0,5 mg/mL de protéase Lys-C de qualité MS à l’échantillon. Incuber à 37 °C pendant 1 h en secouant à 1 150 tr/min.
      REMARQUE : Préparez Lys-C en le dissolvant dans de l’eau de qualité LC-MS. Conservez les aliquotes enzymatiques à -80 °C et évitez les gels-dégels multiples.
    7. Ajouter 750 ng de 0,5 mg/mL de trypsine de séquençage fraîchement préparée. Incuber toute la nuit à 37 °C en secouant à 1 150 tr/min. Incuber pas plus de 16 à 18 h pour éviter la surdigestion et la dégradation des peptides.
    8. Le lendemain, centrifuger l’échantillon à 1 000-5 000 × g pendant 1 à 5 min à RT et transférer le surnageant par pipetage dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Jetez les perles.
    9. Ajustez le pH de la digestion à moins de 3 en ajoutant 50 % d’acide trifluoroacétique (TFA) goutte à goutte. Vérifiez le pH à l’aide de bandelettes indicatrices de pH.
      REMARQUE : La plage de pH typique doit être de ~2,5-3,0 et les échantillons doivent être acidifiés avant d’être dessalés.
      ATTENTION : Le TFA est corrosif et volatil. Ajoutez une hotte et portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
  2. Dessalage des peptides
    REMARQUE : Pour le dessalage et le nettoyage des peptides, utilisez des pointes de pipette à petite échelle remplies de C18 (c’est-à-dire StageTips)31. Préparez les StageTips C18 en emballant trois couches de matériau C18 (par exemple, des disques d’extraction en phase solide C18) dans une pointe de pipette de 200 μL. Des colonnes de centrifugation C18 préfabriquées et disponibles dans le commerce peuvent également être utilisées. Suivez le protocole du fabricant pour le conditionnement, le chargement des échantillons et l’élution peptidique. Les performances (par exemple, l’efficacité de rétention, le rendement de récupération) peuvent varier entre les appareils faits maison et commerciaux. Les pointes de pipette à petite échelle remplies de C18 doivent être bien tassées pour éviter l’écoulement de dérivation.
    1. Conditionnez séquentiellement les pointes de pipette à petite échelle remplies de C18 avec : (1) 100 μL de méthanol. Centrifuger à 400 × g et jeter le flux ; (2) 100 μL à 70 % d’ACN/0,1 % d’AFT. Centrifuger à 400 × g et jeter l’écoulement ; (3) 100 μL d’AFT à 0,1 %. Centrifuger à 400 × g et jeter le flux. Répétez cette étape deux fois.
      REMARQUE : Le conditionnement assure un mouillage complet de la résine hydrophobe C18. Pour les colonnes de centrifugation C18 préfabriquées et disponibles dans le commerce, des collecteurs à vide peuvent également être utilisés. Les utilisateurs doivent se référer aux instructions du fabricant pour des recommandations de manipulation spécifiques.
    2. Chargez la digestion peptidique acidifiée sur les pointes de pipette conditionnées à petite échelle remplies de C18 en pipetant lentement l’échantillon directement dans la pointe. Centrifugez à 300 × g pour permettre à la digestion de passer à travers la résine et jetez le flux. Si le volume de l’échantillon dépasse la capacité, chargez en plusieurs tours.
      REMARQUE : Pipetez la digestion directement sur le lit de résine emballée, en évitant les bulles d’air. Si vous utilisez des pointes à faible rétention, touchez la paroi interne des pointes de pipette à petite échelle remplies de C18 pour libérer le liquide lentement et uniformément.
    3. Pipetez 100 μL de 0,1 % de FA directement dans la pointe de pipette à petite échelle emballée en C18, en veillant à ce que la solution sature complètement le matériau C18. Centrifuger à 400 × g et jeter le flux. Répétez cette étape deux fois pour éliminer les sels et les substances interférentes.
      REMARQUE : Assurez-vous que le liquide s’écoule complètement à travers le matériau C18 avant chaque essorage. Évitez de piéger les bulles d’air en distribuant lentement la solution de lavage le long de la paroi de la pointe de la pipette.
    4. Éluez les peptides liés en pipetant 50 μL de 70 % d’ACN/0,1 % d’AF dans la pointe de pipette à petite échelle remplie de C18. Centrifuger à 300 × g et recueillir l’éluat dans un tube de microcentrifugation propre à faible liaison. Répétez cette étape deux fois pour assurer une élution complète.
      REMARQUE : Plusieurs cycles de centrifugation peuvent être nécessaires pour récupérer complètement l’éluat. Si du liquide résiduel reste piégé à la base de la pointe, tapotez doucement la pointe de la pipette à petite échelle remplie de C18 ou effectuez de brèves rotations supplémentaires pour récupérer le volume restant. Combinez les éluats et vérifiez le volume final avant de continuer.
    5. Congelez et séchez les peptides élués à l’aide d’un concentrateur sous vide jusqu’à ce qu’ils soient secs. Assurez-vous que le couvercle est mal placé pour permettre la ventilation, mais évitez les éclaboussures.
    6. Reconstituez les peptides séchés en ajoutant 12 μL de 0,1 % d’AF dans de l’eau de qualité LC-MS directement au fond du tube. Tourbillonnez doucement et sonicez les tubes pour dissoudre complètement les peptides.
      REMARQUE : Assurez-vous que la totalité de la pastille ou du film séché est complètement reconstituée. La dissolution à l’aide d’une pipette risque de perdre des peptides en raison de l’adhérence aux surfaces des pointes.
    7. Sonicez les peptides reconstitués pendant 5 min dans un sonicateur de bain rempli d’eau froide pour assurer une dissolution complète et éviter la surchauffe.
    8. Centrifuger les peptides à 20 000 × g à 4 °C pendant 10 min. Transvasez le surnageant peptidique dans un flacon d’échantillonneur automatique approprié pour le charger sur le système LC-MS. Utilisez des flacons en polypropylène de faible volume, de haute qualité, testés par chromatographie en phase gazeuse (GC) avec des capuchons de septum en silicone/polytétrafluoroéthylène (PTFE) collés pour minimiser les pertes d’échantillons. Étiquetez clairement les flacons avec l’ID de l’échantillon et l’ordre d’injection.
    9. Estimez la concentration peptidique à l’aide d’un spectrophotomètre à 280 nm. Notez qu’il s’agit d’une approximation et que la teneur en résidus aromatiques ou les contaminants peuvent être affectés. Vous pouvez également utiliser des dosages colorimétriques pour une quantification plus précise.
  3. Paramètres LC et MS
    REMARQUE : Les paramètres LC et MS suivants sont optimisés pour le système nano-LC couplé au spectromètre de masse utilisé dans le protocole actuel. Pour les autres systèmes nano-LC et spectromètres de masse, les paramètres doivent être ajustés en conséquence.
    1. Préparez les phases mobiles chaque semaine pour assurer la compatibilité LC-MS et minimiser la contamination : (1) Phase mobile A : Ajouter 1 mL d’eau de grade LC-MS FA à 1 L d’eau de grade LC-MS, et (2) Phase mobile B : Ajouter 1 mL de grade LC-MS FA à 1 L d’ACN de grade LC-MS.
      REMARQUE : Utilisez uniquement des solvants et de l’acide de qualité LC-MS. Préparez les deux phases dans des bouteilles en verre propres et dégazez si le système LC l’exige. Jetez les phases inutilisées sur une base hebdomadaire pour éviter la croissance ou la dégradation microbienne.
    2. Installez une colonne capillaire en silice fondue de 25 cm de long et de 75 m de diamètre intérieur, remplie de particules de phase inverse de C18 de 1,7 m.
      REMARQUE : Manipulez les colonnes avec soin pour éviter d’introduire des bulles d’air ou d’endommager le matériau d’emballage. Suivez les instructions du fabricant pour l’installation et l’équilibrage de la colonne.
    3. Conditionnez la colonne en augmentant progressivement le débit de 50 nL/min à 300 nL/min en utilisant 3 % de phase B mobile.
      REMARQUE : Cette étape permet de s’assurer que la phase stationnaire est correctement mouillée et équilibrée avant l’injection de l’échantillon. Surveillez la pression de la colonne pendant la montée en puissance du débit. Des pics de pression soudains peuvent indiquer des bulles d’air ou un blocage de la colonne. L’équilibre peut être considéré comme complet lorsque la pression de base se stabilise.
    4. Maintenir la température de la colonne à 50 °C pour assurer des performances chromatographiques optimales.
    5. Injecter 100 ng d’une digestion tryptique de cellule HeLa comme norme de contrôle de la qualité (CQ) pour évaluer les performances du système.
      REMARQUE : Cette injection de contrôle qualité sert de référence pour évaluer la cohérence du temps de rétention de la LC, la sensibilité à la MS et la couverture du protéome sur l’ensemble des cycles. Comparez le nombre de protéines d’identification, la reproductibilité du temps de rétention et l’intensité du signal à un ensemble de données de CQ de référence pour confirmer l’état de préparation du système avant d’analyser les échantillons expérimentaux. Utiliser des étalons de digestion HeLa commerciaux préparés à des concentrations connues pour la reproductibilité d’une expérience à l’autre.
    6. Utiliser une élution en gradient de 2 % à 35 % de phase B mobile sur 90 min à un débit de 300 nL/min. Le gradient de 90 minutes permet une séparation peptidique haute résolution adaptée aux protéomes complexes. En suivant la pente, maintenez à 95 % la phase B mobile pendant 7 min pour laver la colonne.
      REMARQUE : Inclure une étape de rééquilibrage (p. ex., revenir à 2 % de B pendant 10 à 15 min) avant l’injection suivante pour assurer la reproductibilité de la colonne d’un cycle à l’autre. Évitez les changements brusques de pente, qui peuvent avoir un impact sur la stabilité du temps de rétention et la forme du pic.
    7. Effectuer l’analyse MS à l’aide d’un spectromètre de masse équipé d’une source d’ionisation par électronébulisation compatible avec les nanoflux (p. ex., style CaptiveSpray).
      REMARQUE : La source d’ions CaptiveSpray fournit une électropulvérisation stable à de faibles débits de nanogrammes, améliorant l’efficacité et la sensibilité de l’ionisation. Pour les laboratoires, l’utilisation de spectromètres de masse alternatifs ajuste les paramètres d’acquisition et d’ionisation en conséquence. Assurez-vous d’un réglage et d’un étalonnage appropriés avant l’analyse pour maintenir l’exactitude et la résolution. Positionnez correctement l’émetteur de pulvérisation et surveillez la stabilité de la pulvérisation pendant le passage pour éviter les pertes de signal.
    8. Utiliser une acquisition indépendante des données : méthode diaPASEF32. Pour les utilisateurs qui ne sont pas familiers avec diaPASEF, consultez la documentation technique du fabricant ou les protocoles récents décrivant les flux de travail de spectrométrie de mobilité des ions piégés (TIMS)-DIA33 pour optimiser les différents types d’échantillons ou longueurs de gradient.
      REMARQUE : diaPASEF combine TIMS et DIA pour augmenter la vitesse et la sensibilité du séquençage en alignant les ions précurseurs et fragmentaires dans la dimension de mobilité34. Assurez-vous que l’appareil TIMS est correctement calibré et synchronisé avec le quadripôle pour éviter un désalignement des fenêtres de mobilité ionique et de masse.
    9. Utilisez les réglages d’instrument suivants : (1) Plage de masse : 100 à 1700 m/z ; (2) Plage de mobilité ionique : 0,60-1,60 V·s/cm² ; (3) Énergie de collision : 20-59 eV, rampe ; (4) Temps de rampe : 100 ms ; (5) Temps d’accumulation : 100 ms ; (6) Gamme de masse pour diaPASEF : 400-1201 Da ; (7) Largeur de la fenêtre de masse : 26 Da avec 1 Da de chevauchement ; (8) Nombre de pas de masse par cycle : 32 ; (9) Temps de cycle : ~1,8 s
      REMARQUE : Ces paramètres sont optimisés pour équilibrer la profondeur de couverture et la vitesse de balayage. Des ajustements mineurs (par exemple, la largeur de la fenêtre ou le nombre de pas) peuvent être nécessaires en fonction de la complexité de l’échantillon, de la longueur du dégradé et des performances du système LC-MS. L’identification de plus de 7 500 protéines pour le HeLa digest indique des performances optimales du système. Le nombre d’identifications peut varier d’un instrument à l’autre et doit être évalué en conséquence.
    10. Chargez 300 à 400 ng d’échantillon peptidique par injection pour éviter de surcharger la colonne analytique. Une surcharge peut entraîner un élargissement des pics, une suppression des ions et une reproductibilité réduite. Confirmer la concentration peptidique avant l’injection à l’aide d’un spectrophotomètre ou d’un dosage colorimétrique des peptides afin d’éviter toute variabilité d’un cycle à l’autre.
    11. Effectuez des injections à blanc entre les groupes d’échantillons pour éviter le transfert. Utilisez la phase A 100 % mobile (eau avec 0,1 % de FA) comme blanc d’injection. Cela permet d’évacuer les peptides résiduels de la colonne et de réduire la contamination entre les passages. Surveillez les ions de base et de fond pour confirmer un nettoyage adéquat.
  4. Analyse des données DIA
    1. Utilisez un logiciel approprié prenant en charge l’analyse des données à l’aide du flux de travail directDIA35 et le traitement sans bibliothèque des données protéomiques DIA. Effectuez l’identification et la quantification des protéines sur la base d’une base de données UniProt FASTA36, avec des paramètres de recherche standard et des paramètres de quantification par défaut.
      REMARQUE : Tous les paramètres, y compris la spécificité de l’enzyme, les paramètres de modification, les seuils de FDR et les résultats post-analyse, sont détaillés dans le fichier supplémentaire 1. D’autres plates-formes d’analyse DIA telles que DIA-NN37 peuvent également être utilisées si elles prennent en charge des flux de travail et des sorties similaires.
    2. Exécutez directDIA sans bibliothèque avec des seuils de valeur q correspondant à 1 % de FDR aux niveaux des précurseurs, des peptides et des groupes protéiques ; Exclure l’identification des leurres avant l’analyse en aval.
      REMARQUE : Aucune norme iRT n’a été ajoutée ; les performances ont été évaluées avec les exécutions HeLa digest par rapport à des critères d’identification et de stabilité du temps de rétention prédéfinis.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Après l’exécution réussie du protocole, les utilisateurs devraient obtenir des ensembles de données d’interaction de haute qualité adaptés à l’analyse dfPPI en aval. L’identification des protéines est effectuée à partir des données DIA à 1 % de FDR (niveaux de PSM et de protéines), et la quantification utilise les intensités brutes ou les comptages spectraux MS/MS (et non LFQ). Les signatures de CQ attendues comprennent : un regroupement serré de réplicats techniques par ACP, des CV médians de précurseurs/protéines d’environ 10 à 12 %, un regroupement hiérarchique piloté par l’origine biologique plutôt que par la réplication, et un enrichissement robuste au niveau de la voie sur g :Profiler/Reactome.

Génération de sondes à billes de PU et validation de l’activité avant utilisation

Les billes de PU sont préparées en couplant une petite molécule analogue de liaison à l’épichapérome à l’agarose activée par le NHS, comme décrit précédemment25. Un paquet de résine standard de 25 ml donne ~25 ml de billes de PU stockées sous forme de suspension 1:1 dans de l’isopropanol. Aliquote dans des tubes à faible liaison et conserver à −20 °C, à l’abri de la lumière (p. ex., envelopper dans du papier d’aluminium). Dans ces conditions, un lot reste stable pendant ≥12 mois. Avant utilisation, retirez l’isopropanol et équilibrez les billes dans le tampon de liaison natif (étape 1.3). Chaque lot est qualifié lors de la synthèse et périodiquement par la suite à l’aide de deux dosages (Figure 2) : (i) Pull-downs appariés à partir d’un lysat à haute teneur en épichapérome (par exemple, MDA-MB-468) et d’un lysat à faible teneur en épichapérome (par exemple, ASPC1) dans des conditions identiques (suspension de billes de 40 μL avec 250 μg de protéines totales ; 3 h à 4 °C ; lavages natifs), éluation/dénaturation et immunotransfert pour HSP90, HSC70 et HOP. Acceptation : fort enrichissement dans l’échantillon à haut épichapérome avec signal minimal dans l’échantillon faible ; rapports d’intensité de bande comparables à ceux d’un lot de référence (±20-30 %). (ii) Captures parallèles du profil de fret mondial à partir d’un lysat à haute teneur en épichapérome avec des billes de PU par rapport à des billes de contrôle inertes appariées, charge des volumes d’éluat égaux sur SDS-PAGE et coloration de Coomassie. Acceptation : Les billes en PU montrent une cargaison riche et de poids moléculaire élevé avec un arrière-plan minimal dans la voie du cordon de contrôle. Un lot de 25 mL prend en charge ~600 captures à 40 μL par échantillon ; Retirer beaucoup si la spécificité ou le profil de chargement n’est pas accepté après le rélavage/rééquilibrage.

Résultats représentatifs des protocoles en gel et sur billes

Dans le cadre d’une comparaison pilote comparative sur des cellules MDA-MB-468 à épichapérome élevé, les flux de travail en gel et sur bille ont produit des interactions très concordantes : 4 616 des 6 333 protéines (73 %) ont été partagées au niveau du groupe de protéines, 1 275 (20 %) ont été détectées uniquement par le groupe de protéines et 442 (7 %) uniquement par le sur le talon. L’accord au niveau du parcours était encore plus élevé : parmi les 860 termes de Reactome, 727 (85 %) étaient courants, 81 (9 %) étant propres à l’in-gel et 52 (6 %) uniques à l’on-bead. Les intensités médianes des protéines étaient ~3× plus élevées pour l’in-gel que pour l’in-bead, ce qui correspond à la concentration de gel-élution, mais cela n’a pas eu d’impact significatif sur la concordance des voies.

Exemple à l’échelle de la cohorte et signatures de contrôle qualité

À titre d’exemple, nous avons analysé douze échantillons biologiques (Figure 3). Quatre échantillons ont été élués et traités par digestion en gel ; huit échantillons ont subi une purification par affinité de complexes d’épichapérome suivie d’une digestion sur bille et d’une nano-LC-MS/MS en duplicata technique. Les signatures de CQ attendues ont été observées : regroupement serré des réplicats techniques par ACP, CV médians précurseurs/protéines de ~10-12 %, regroupement hiérarchique piloté par l’origine biologique plutôt que par la réplication, et enrichissement robuste au niveau de la voie sur g :Profiler/Reactome. Ces résultats illustrent la reproductibilité à travers les composants du flux de travail, la détection à grande échelle des protéines engagées dans l’épichapérome et l’intelligibilité fonctionnelle claire des interacteurs différentiels au niveau de la voie. Les enrichissements de la voie dérivée des deux flux de travail correspondaient à nos résultats dfPPI publiés pour cette ligne, validés par plusieurs tests orthogonaux biochimiques et fonctionnels17.

Qualité des intrants et digestion

Un gel SDS-PAGE représentatif coloré à Coomassie est montré pour quatre des échantillons traités par digestion dans le gel (Figure 3A). Le gel illustre la capture reproductible des protéines et la distribution cohérente des bandes sur les voies, confirmant l’enrichissement réussi des complexes protéiques à partir de lysats natifs avant la spectrométrie de masse. Ces profils d’interactomes dénaturés démontrent que l’étape de capture d’affinité produit un apport protéique suffisant et cohérent pour l’analyse MS en aval.

Les interactomes capturés montrent une large couverture protéique à travers les poids moléculaires, reflétant un enrichissement réussi des assemblages de protéines à partir de lysats natifs. De manière critique, cette récupération ne se limite pas à des protéines abondantes, mais comprend des interacteurs de plus faible abondance, fournissant la complexité et la profondeur requises pour l’analyse au niveau des systèmes.

Contrôles et spécificité à l’échelle

Dans ce flux de travail, nous utilisons des billes de contrôle uniquement pour le pré-nettoyage (voir les étapes 1.3 et 1.4) ; Nous n’effectuons pas de captures comparatives de routine « sonde inerte » sur chaque échantillon biologique. Pour les grandes cohortes cliniques, les captures inertes consomment de la matière précieuse mais ajoutent peu de valeur d’interprétation pour les dfPPI, car les statistiques en aval fonctionnent au niveau du réseau/voie, et non au niveau d’une seule protéine. Les contaminants aléatoires ou collants à la résine n’apparaissent pas de manière coordonnée entre les membres de la même voie et ne survivent donc pas aux tests d’enrichissement au niveau de la voie ou aux filtres de cohérence au niveau de la cohorte. En pratique, la spécificité est assurée par (i) la pré-autorisation, (ii) la reproductibilité des répliques serrées (PCA/CV), et (iii) la stabilité de la trajectoire à travers les seuils et le rééchantillonnage. Historiquement, nous avons évalué les expériences de blocage de capture inerte et de compétiteur soluble (PU-H71) et avons constaté qu’elles ne modifiaient pas les résultats de la voie dfPPI 16,17,21, tout en consommant du matériel clinique irremplaçable ; Par conséquent, nous les réservons uniquement pour la vérification du pilote. Pour les groupes qui préfèrent des vérifications explicites au niveau de l’exécution, nous notons que les deux options sont compatibles avec le protocole mais ne sont pas requises pour les analyses dfPPI à l’échelle de la cohorte.

Numéro de réplication

L’inférence de chemin dans dfPPI est basée sur un ensemble et ne nécessite pas de numéro de réplication fixe. Avec des acquisitions robustes, un seul échantillon par condition peut produire des appels de voies exploratoires. Pour les analyses de confirmation, nous recommandons ≥3 réplicats biologiques par condition pour les cellules en culture (avec des injections LC-MS/MS en double lorsque cela est possible), et des N appropriés à la cohorte pour les tissus humains (généralement ≥5 à 10 par groupe pour la découverte, plus grands si stratifiés par covariables). Nous évaluons la stabilité par clustering de réplication (PCA), CV médian des précurseurs (cible ~10-15 %) et bootstrap/rééchantillonnage des résultats d’enrichissement.

Reproductibilité technique d’un cycle à l’autre

La reproductibilité technique a été évaluée à l’aide de l’analyse en composantes principales (ACP) (figure 3B) des données d’intensité peptidique provenant d’échantillons digérés sur des billes (huit cerveaux murins, analysés en double). Les réplicats se sont regroupés étroitement pour chaque échantillon biologique, tandis que les différents échantillons se sont séparés proprement le long des deux premiers composants principaux. Les deux premières composantes principales expliquaient respectivement 28,6 % et 22,0 % de la variance totale et répartissaient les échantillons en fonction des différences biologiques plutôt que du bruit technique. Cette structure reflète une grande cohérence analytique et confirme que la méthode préserve les différences biologiquement pertinentes, ce qui est essentiel pour permettre à dfPPI de détecter le recâblage de réseau spécifique à une condition.

Cohérence de la détection sur tous les échantillons

Les distributions des coefficients de variation (CV) pour les intensités d’ions précurseurs montrent que la grande majorité des caractéristiques sont inférieures à 20 % CV, avec des valeurs médianes allant de 9,7 % à 11,9 % dans toutes les conditions (figure 3C). Ces résultats confirment la détection cohérente de la MS et la récupération peptidique entre les réplications.

Plage dynamique et couverture du protéome

Le regroupement hiérarchique des valeurs d’abondance des protéines transformées en logarithme (figure 3D) a montré une forte séparation des échantillons et la préservation de la variation entre les échantillons, tout en reflétant la large plage dynamique capturée dans les cycles MS. Les intensités protéiques allaient d’interacteurs de faible abondance à des groupes de protéines hautement enrichis, comme le montre le gradient bleu-jaune. Les données confirment que le protocole permet de détecter divers assemblages et interactions protéiques, en capturant à la fois les composants centraux et périphériques.

Interprétation fonctionnelle via dfPPI

Pour soutenir l’interprétation et la reproductibilité, nous fournissons deux ressources complémentaires pour l’analyse des ensembles de données dfPPI : (i) une application Web interactive Shiny (https://epichaperomics.mskcc.org/ mise à jour en https://dfppi.mskcc.org) et (ii) des flux de travail ouverts et scriptables et des fichiers de session Cytoscape publiés avec des études dfPPI antérieures (GitHub/Zenodo)38,39,40,41. L’application ingère des tables d’intensité brute ou de comptage spectral MS/MS, effectue un contrôle qualité (clustering de réplications, vérifications des valeurs manquantes), une gestion facultative du bruit/des lots (régression des covariables), identifie les protéines engagées de manière différentielle et fournit des lectures de voies/réseaux via des graphiques interactifs et des rapports téléchargeables, sans nécessiter de codage.

dfPPI traite les intensités mesurées ou les nombres spectraux comme des approximations de « l’engagement de l’épichapérome ». Les utilisateurs sélectionnent un modèle de connectivité différentielle (DC) allant d’un simple test t bilatéral (par défaut) à des modèles linéaires prenant en charge les covariables ; l’étape DC peut également être sautée. Après l’intégration de données, les utilisateurs définissent des seuils de changement de pliage et de valeur p (les valeurs par défaut reflètent le travail dfPPI antérieur ; par exemple, FC > 1,0, p nominal ≤ 0,25) pour passer les candidats à l’enrichissement. Deux moteurs d’enrichissement sont disponibles : GSEA basé sur les rangs (sur les statistiques signées) et surreprésentation (hypergéométrique) via g :Profiler avec correction de tests multiples. Dans un contexte centré sur les chaperons, le pipeline fournit également une analyse d’enrichissement en interactome (iEA) pour tester si les interacteurs directs des protéines d’échafaudage des chaperons sont surreprésentés parmi les protéines engagées de manière différentielle. Le réseau visualise les nœuds/arêtes de poids par taille d’effet et/ou support statistique, ce qui permet de visualiser un recâblage coordonné plutôt que des effets monoprotéiques. Pour les utilisateurs qui préfèrent les flux de travail scriptés, le code R sous-jacent et les fichiers de session Cytoscape utilisés pour construire des cartes et des figures de réseau sont accessibles au public (par exemple, GitHub/Zenodo)38,39,40,41 avec les publications associées 17,18,19,20 et peuvent être exécutés localement ou adaptés pour de nouveaux ensembles de données.

Une coupure permissive (changement de pli > 1,0 ; p nominal ≤ 0,25) est recommandée pour conserver les signaux d’état d’interaction introduits par l’enrichissement d’affinité. Nous déplaçons ensuite le contrôle statistique au niveau de la voie : les protéines candidates sont testées pour l’enrichissement à travers des ontologies organisées (par exemple, GO, Reactome) à l’aide de g :Profiler, et les valeurs p de la voie ajustée à plusieurs tests déterminent la signification et le classement. Cette conception reflète l’objectif de dfPPI, à savoir détecter le recâblage coordonné du réseau, et non l’expression différentielle d’une seule protéine, et évite la normalisation à l’échelle du protéome qui peut obscurcir les signaux d’enrichissement dans les ensembles de données déroulants. Comme l’ont montré des études dfPPI antérieures17,20, des seuils de niveau de protéine plus indulgents produisent des appels de voie stables et pertinents pour la maladie, tandis que d’autres modèles (par exemple, des modèles linéaires avec rétrécissement empirique de Bayes) peuvent être utilisés lorsque la variance ou les covariables de lot le justifient, sans modifier l’inférence centrée sur la voie principale.

La capture d’affinité co-enrichit inévitablement les protéines « collantes » (par exemple, les kératines, les protéines cytosquelettiques, les protéines ribosomiques), et les billes de PU peuvent également capturer les interacteurs chaperons généraux. Dans le dfPPI, ceux-ci ne dirigent pas la biologie pour plusieurs raisons. Tout d’abord, le pré-nettoyage et les lavages rigoureux éliminent la plupart des liants non spécifiques. Deuxièmement, les liants génériques, y compris de nombreux interacteurs chaperons, montrent des changements de pliage proches de 1,0 dans toutes les conditions et/ou une détection incohérente et échouent donc aux criblages de valeurs FC/p. Troisièmement, l’enrichissement de la voie est basé sur un ensemble et tient compte du contexte : la signification est calculée par rapport au protéome détecté spécifique à l’expérience et nécessite que plusieurs membres de la même voie covarient. Les contaminants aléatoires ou en grande abondance sont dispersés sur de nombreux termes et ne forment donc pas d’enrichissements cohérents et significatifs du RAD. Aucune protéine, contaminante ou autre, ne peut « faire » un appel de voie. Quatrièmement, le dfPPI interprète la cohérence au niveau du réseau, et non des protéines uniques ; Les appels de voie doivent survivre à la correction de plusieurs tests (par exemple, les valeurs p ajustées de g :Profiler), à la taille minimale de l’ensemble de gènes et à la cohérence de la réplication. Associé à des préclairs à billes inertes appariés et à un filtrage des contaminants courants, ce cadre rend dfPPI robuste au contexte : même si des centaines de protéines non informatives sont présentes, elles ne modifient pas le classement des voies, car l’enrichissement dépend du nombre de protéines concordantes à l’intérieur d’une voie, et non de la longueur totale de la liste de protéines. De plus, toutes les études dfPPI publiées à ce jour ont corroboré les prédictions au niveau de la voie et du réseau avec une validation expérimentale approfondie (par exemple, biochimie ciblée, lectures de signalisation, perturbations génétiques ou pharmacologiques)16,17,18,19,20, démontrant que les sorties dfPPI ne sont pas simplement des listes de protéines bruyantes, mais des cartes reproductibles du dysfonctionnement du réseau d’IPP pertinents pour la maladie.

Pour évaluer le paysage fonctionnel capturé par l’ensemble de données dfPPI de la figure 3D, nous avons effectué une analyse d’enrichissement à l’aide de g :Profiler42 (Figure 3E). Les résultats démontrent une couverture d’annotation robuste dans toutes les principales ontologies fonctionnelles, y compris le processus biologique de l’ontologie génétique (GO-BP), la fonction moléculaire (GO-MF) et le composant cellulaire (GO-CC), ainsi que dans les ressources de voies organisées telles que Reactome, KEGG et WikiPathways. Cette analyse représentative illustre l’une des principales forces de l’approche dfPPI : sa capacité à révéler des associations de voies biologiquement significatives entre divers types d’annotations, même à partir d’échantillons de taille relativement petite. La large couverture de Reactome observée ici reflète probablement le fait que le dfPPI est basé sur le recâblage des réseaux de protéines de capture des changements au niveau de l’interaction, qui s’appliquent directement aux processus multicomposants et aux cascades de signalisation, qui sont bien représentés dans la structure de Reactome. Parce que dfPPI exploite les changements de connectivité plutôt que d’expression, il est particulièrement bien adapté pour détecter les changements fonctionnels au niveau des systèmes qui peuvent être manqués par la transcriptomique ou la protéomique d’abondance uniquement. Cette constatation s’aligne sur d’autres travaux où Reactome a systématiquement produit les enrichissements les plus cohérents et les plus pertinents pour la maladie à partir d’ensembles de protéines dérivées de dfPPI 14,15,16,17,18,20,21.

Reactome est organisé autour de processus et de complexes multiprotéiques (cascades de transduction de signaux, modules de cycle cellulaire, assemblages métaboliques). Parce que le dfPPI enrichit les interacteurs engagés par l’épichaperome, c’est-à-dire les groupes de protéines qui sont fonctionnellement co-recrutés dans les échafaudages de la maladie, sa sortie contient naturellement des modules de voies cohésives plutôt que des coups isolés. Cette capture coordonnée permet d’obtenir une couverture large et significative de Reactome à travers les sous-chemins et les hiérarchies connexes. En revanche, les omiques centrées sur l’abondance (transcriptomique ; protéomique globale) signalent les changements d’expression, et non les états d’interaction ; l’AP-MS à appât unique ou l’étiquetage de proximité fournissent aux quartiers locaux un appât fabriqué à la fois ; et la réticulation/co-fractionnement offrent souvent une connectivité clairsemée. Aucun d’entre eux, à lui seul, ne produit systématiquement les ensembles au niveau du système sélectionnés en fonction du contexte que dfPPI renvoie à partir d’une capture endogène unique dans les cellules ou les tissus. Le résultat est un enrichissement de la voie qui est à la fois large (plusieurs branches du réactome s’allument) et mécaniquement cohérent (les protéines se déplacent ensemble parce que leurs interactions - et pas seulement leurs quantités - sont reprogrammées par les épichapéromes). Cependant, nous notons que la dfPPI est complémentaire, et non un remplacement : chaque méthode interactomique a des forces et des limites distinctes, et le choix optimal (ou la combinaison) doit être déterminé par la question biologique, les contraintes de l’échantillon et la résolution requise.

Ensemble, ces résultats confirment que le protocole produit des ensembles de données reproductibles et biologiquement informatifs qui peuvent être utilisés pour découvrir un remodelage différentiel de l’interactome entre les états pathologiques ou les perturbations expérimentales. La sortie dfPPI est bien adaptée à l’intégration avec les cadres d’enrichissement de voies et permet de cartographier les événements de recâblage fonctionnel non détectables par les méthodes standard basées sur l’abondance.

figure-results-1
Figure 1 : Vue d’ensemble de la plateforme dfPPI. (A) La plateforme dfPPI (dysfunctional Protein-Protein Interactome) permet d’identifier les dysfonctionnements du réseau d’IPP spécifiques à une maladie grâce à un flux de travail chimioprotémique. La section 1 implique la préparation d’échantillons et la capture d’interactomes à l’aide de sondes chimiques ciblant l’épichapérome immobilisées sur des matrices d’affinité (par exemple, des billes de PU). Les sections 2 et 3 décrivent deux flux de digestion compatibles - sur bille ou dans gel - suivis d’une LC-MS/MS sans marquage pour l’identification de l’interactome. Les analyses informatiques, y compris la modélisation statistique et l’enrichissement des voies, sont effectuées à l’aide du pipeline bioinformatique dfPPI, qui n’est pas couvert dans ce protocole mais est disponible gratuitement sur https://epichaperomics.mskcc.org/. (B) Principe du dfPPI. Dans des contextes pathologiques, les épichapéromes endogènes forment des échafaudages supramoléculaires qui réorganisent les réseaux d’IPP. Les sondes chimiques dirigées par l’épichapérome (par exemple, des billes de PU ou équivalent) capturent ces échafaudages avec leurs interacteurs liés directement à partir de cellules intactes ou de lysats natifs, ce qui permet d’obtenir une réduction de plusieurs appâts en une seule expérience. Les commandes appariées (par exemple, commande de billes inertes et/ou compétition avec sonde libre) peuvent être traitées en parallèle. Le matériel capturé est élué et digéré sur bille ou dans le gel, analysé par LC-MS/MS, et les protéines sont quantifiées (intensité ou comptage spectral MS/MS). L’interactome qui en résulte est utilisé pour calculer les interacteurs différentiels entre les conditions et pour effectuer l’enrichissement des voies/réseaux, révélant ainsi un dysfonctionnement de l’IPP spécifique au contexte au niveau des systèmes. Le flux de travail ne nécessite aucun marquage génétique ou surexpression, est compatible avec les cellules et les tissus, et s’adapte aux études de cohorte. À l’inverse, la MS traditionnelle d’affinité-purification se concentre sur un appât marqué à la fois, produisant un voisinage local par construction et nécessitant généralement de nombreuses constructions/exécutions pour échantillonner un réseau. En revanche, le dfPPI utilise des épichapéromes endogènes comme appât, capturant simultanément de nombreux IPP dysfonctionnels à partir du système natif, ce qui accélère la découverte d’un recâblage de réseau spécifique à la maladie et fournit des lectures au niveau de la voie à partir d’une seule capture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Validation d’un lot de billes de PU et spécificité de capture. (A) Spécificité biologique et cohérence d’un lot à l’autre. Les cellules MDA-MB-468 (épichapérome élevé) et ASPC1 (épichapérome faible) ont été lysées dans un tampon natif (20 mM Tris, pH 7,4 ; 20 mM KCl ; 5 mM MgCl2 ; 0,01 % NP-40 ; inhibiteurs de la protéase/phosphatase). Pour chaque capture, 40 μL de boue de billes de PU ont été incubés avec 250 μg de protéines totales (1 μg/μL) pendant 3 h à 4 °C avec rotation. Les perles ont été lavées dans un tampon natif ; complexes ont été dénaturés/élués dans ~100 μL de tampon d’échantillon SDS. 5 à 10 μL de chaque éluat ont été éliminés par SDS-PAGE et immunoblottés pour HSP90, HSC70 et HOP. Les lysats d’entrée sont indiqués à titre de référence. Deux lots de billes de PU (lot 1, frais ; Le lot 2, vieilli) produit un fort enrichissement dans MDA-MB-468 et un signal minimal dans ASPC1, démontrant une spécificité préservée et une cohérence de lot. (B) Fret global par rapport aux billes de contrôle. Les lysats MDA-MB-468 ont été traités comme en (A) avec des billes de PU ou des billes de contrôle appariées. ~20 μL de chaque éluat ont été chargés, séparés par SDS-PAGE, et colorés à Coomassie. Les billes de PU récupèrent une cargaison complexe et à forte puissance moléculaire caractéristique des assemblages liés à l’épichapérome, tandis que les billes de contrôle montrent un arrière-plan minimal. Les marqueurs de poids moléculaire (kDa) sont indiqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Résultats représentatifs de la capture d’affinité dfPPI, de l’identification des interactomes et des analyses bioinformatiques. (A) Gel SDS-PAGE de protéines colorées à Coomassie éluées à partir de captures d’affinité de billes PU d’interactomes liés à l’épichapérome à partir de quatre échantillons de cerveau humain représentatifs (PT1-PT4). Les assemblages de protéines liées aux billes ont été dénaturés par ébullition dans un tampon d’échantillon SDS, résolus par SDS-PAGE et colorés pour évaluer la récupération de l’interactome en fonction des poids moléculaires. Chaque échantillon a été chargé dans une voie distincte, avec une voie vide entre les échantillons afin de minimiser la contamination croisée ; Un signal faible observé occasionnellement dans ces voies vides reflète un léger débordement d’échantillon pendant l’électrophorèse. Ces gels sont représentatifs des échantillons soumis à l’installation de MS, où chaque voie a été sectionnée en cinq coupes pour la digestion dans le gel et l’identification des protéines par MS. (B) L’analyse en composantes principales (ACP) des intensités protéiques identifiées à partir d’interactomes d’épichapéromes digérés sur les billes à partir de huit échantillons de cerveau murin représentatifs (analysés en double) révèle un regroupement serré de répétitions techniques et une séparation biologique claire le long de PC1 et PC2. Cela confirme une reproductibilité technique élevée et une variance biologique suffisante pour une analyse dfPPI robuste. La structure des données démontre que les différences au niveau de l’interaction, et non les artefacts techniques, déterminent la séparation des échantillons, fournissant une base solide pour la modélisation de l’interactome différentiel en aval sans nécessiter de normalisation artificielle. (C) Les distributions des coefficients de variation (CV) pour les intensités d’ions précurseurs dans les huit groupes d’échantillon montrent une variance constamment faible, avec des CV médians allant de 9,7 % à 11,9 % (indiqués par des lignes pointillées verticales). Ces faibles CV mettent en évidence la reproductibilité et la robustesse du pipeline de détection et de quantification des MS. La cohérence soutient l’utilisation de l’intensité brute ou des valeurs MS/MS comme données d’entrée fiables pour l’analyse dfPPI, où la variance de l’intensité de l’interaction - et non l’expression globale des protéines - est le signal biologique d’intérêt. (D) Carte thermique de regroupement hiérarchique des valeurs d’intensité protéique transformées en log2 dans tous les échantillons (avec les doublons techniques indiqués). Les échantillons sont regroupés par origine biologique plutôt que par réplication, ce qui confirme la capture robuste des interactomes liés à l’épichapérome et la préservation de la variance biologiquement pertinente. Une large plage dynamique et une détection cohérente entre les protéines renforcent la qualité des ensembles de données pour l’analyse dfPPI. La barre d’échelle représente les valeurs d’intensité des protéines transformées en log2, allant de 2 (bleu, faible abondance) à 14 (jaune, abondance élevée). (E) Graphique de Manhattan de l’analyse de l’enrichissement de la voie réalisée sur des protéines en interaction différentielle identifiées par dfPPI. L’enrichissement a été réalisé à l’aide de g :Profiler, et les termes significatifs sont tracés par −log10(p-value), colorés par la source d’annotation : GO Molecular Function (GO :MF), GO Biological Process (GO :BP), GO Cellular Component (GO :CC), KEGG, Reactome, WikiPathways, et Human Phenotype Ontology (HP). Ce résultat représente l’utilité principale de dfPPI : découvrir des voies fonctionnelles biologiquement significatives perturbées par le remodelage de l’interactome induit par l’épichaperome. La large couverture d’annotations souligne l’aperçu au niveau des systèmes que cette approche permet d’obtenir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

MéthodeCe qu’il capturePrincipaux atoutsPrincipales limitesUtilisation typiqueÉvolutivité (cohortes)
AP-MS (purification d’affinité-MS)Interacteurs directs/quasi-directs d’un seul appâtHaute spécificité ; quantitatif; Bon pour les compositions complexesNécessite un appât/étiquette/anticorps ; un appât à la fois ; Peut manquer transitoire/faibleDéfinir les partenaires d’une protéine d’intérêtFaible-modéré (beaucoup d’appâts nécessaires)
Étiquetage de proximité (p. ex., variantes BioID/APEX)Protéines à proximité d’un appât à l’échelle nanométrique au fil du tempsCapture les voisins transitoires/faibles ; Fonctionne dans des cellules vivantesGénie génétique; étiquetage hors cible ; lourd en paramètresCartes locales des quartiers ; dynamiqueFaible à modérée (ingénierie par appât)
XL-MS (MS réticulant)Proximités spatiales/contacts dans/entre les protéinesContraintes structurelles ; Capture les contacts transitoiresAnalyse complexe ; largeur inférieure du protéome ; spécifique à l’échantillonTopologie structurelle/contextuelleFaible (spécialisé)
Co-fractionnement/MS (CF-MS)Co-élution d’assemblées indigènesPas de balisage ; Assemblées indigènesIntensif en main-d’œuvre ; inférence complexe ; sensibilité limitéePaysage complexe mondialModéré
CETSA/TPPProfils de co-stabilité/co-agrégationSans étiquette ; Conditions d’origineIndirecte pour les IPP ; contraintes de solubilitéEngagement cible ; Décalages thermiquesModéré
dfPPI (épichapéromique)Recâblage d’interaction au niveau du réseau capturé par des épichapéromes endogènes en tant qu’appâts multiplexEndogène; pas de balisage ; une capture interroge des milliers d’IPP dysfonctionnels ; lectures de chemins/réseaux ; compatible avec les tissus ; Adapté aux cohortesApplicable uniquement dans le contexte de la maladie ; sondes spécialisées (billes PU, YK5-B) ; non destiné à la découverte générique complexeRemodelage de l’interactome maladie-contexte, hiérarchisation des voies, génération d’hypothèsesÉlevée (centaines d’échantillons possibles)

Tableau 1 : Comparaison des approches de cartographie IPP et dfPPI. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Réglages complets des paramètres du spectronaute. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole décrit ici permet de cartographier les IPP dysfonctionnels dans des échantillons biologiques natifs à l’aide de la plateforme dfPPI. Contrairement aux méthodes traditionnelles qui déduisent un dysfonctionnement à partir de changements d’abondance ou d’expression, cette plateforme capture le recâblage du réseau au niveau structurel en isolant les interacteurs spécifiques à la maladie par purification d’affinité avec des sondes ciblant l’épichapérome, suivie d’une SEP quantitative basée sur l’intensité sans marquage. Bien que l’application actuelle se concentre sur le tissu cérébral post-mortem, la méthode est largement applicable à d’autres types d’échantillons et modèles de maladies, y compris des cellules et des tissus cultivés à partir de modèles de cancer, de neurodégénérescence et de dysfonctionnement immunitaire 16,17,18,19,20,22,23.

dfPPI s’appuie sur des sondes qui sélectionnent cinétiquement les épichapéromes et piègent les assemblages avec leurs interacteurs liés. Les billes de PU (dérivées de chémotypes de liaison à l’épichapérome tels que PU-H71/PU-AD) engagent les épichapéromes nucléés HSP90 de manière non covalente mais avec un long temps de séjour, une caractéristique de la sélectivité cinétique de la conformation de l’épichapérome par rapport aux complexes chaperons conventionnels23. YK5-B est une sonde covalente biotinylée dirigée vers HSC70 dans les épichapéromes, permettant une capture dans la cellule avant la lyse et préservant les IPP endogènes17. La sélectivité provient de PTM associées à la maladie qui remodèlent les conformations HSP90/HSC70 et la chimie des poches et stabilisent les assemblages d’épichapéromes 14,23,43,44 ; ces changements produisent une liaison KOff lente de haute affinité pour les sondes non covalentes de type PU45 (et permettent la capture covalente avec YK5-B dirigée par HSC70), conservant ainsi cinétiquement les complexes épichapéromes et co-isolant leurs interacteurs directs et indirects pour LC-MS/MS. En pratique, les billes de PU sont optimales pour les flux de travail de lysat/homogénat, tandis que YK5-B prend en charge la capture de cellules vivantes ; les deux conservent des assemblys dépendants du contexte qui peuvent être identifiés par LC-MS/MS et utilisés pour l’analyse dfPPI en aval.

Pour dfPPI, une expertise spécialisée en chimie est nécessaire pour synthétiser les sondes de capture. Cependant, cette exigence n’est pas propre à dfPPI : les méthodes PPI largement utilisées (AP-MS, marquage de proximité, XL-MS) s’appuient également sur des compétences spécialisées, par exemple, le clonage/l’ingénierie d’appâts marqués, la génération de lignées cellulaires stables, l’optimisation du marquage/réticulation et des pipelines bioinformatiques complexes. En revanche, la dfPPI évite la manipulation génétique et la surexpression des appâts, opère directement sur des cellules ou des tissus natifs (y compris des échantillons biologiques cliniques rares) et utilise des flux de travail standard de capture d’affinité et de LC-MS déjà courants dans les noyaux de protéomique. Pour réduire les obstacles à l’adoption, des billes de PU validées et des billes de contrôle adaptées sont disponibles via MTA auprès du laboratoire Chiosis, et les étapes de manipulation/assurance qualité sont entièrement spécifiées aux étapes 1.3 et 1.4. Enfin, l’analyse est prise en charge par une application dfPPI basée sur le Web qui met en œuvre les statistiques requises et les lectures de chemins/réseaux, réduisant ainsi le fardeau bioinformatique (c’est-à-dire pour les utilisateurs sans formation en codage et n’ayant que des compétences de base en bioinformatique).

L’AP-MS, XL-MS, l’étiquetage de proximité, le co-fractionnement et le CETSA/TPP répondent chacun à des questions différentes (liants directs, proximité spatiale, étiquetage de voisinage, co-assemblage ou co-stabilité thermique). La dfPPI est la méthode de choix lorsque l’objectif est de cartographier le recâblage endogène et dépendant du contexte dans la maladie, en particulier dans les tissus natifs ou les grandes cohortes cliniques où le marquage génétique n’est pas réalisable, et lorsque des lectures au niveau de la voie/du réseau à partir d’une seule capture sont souhaitées. dfPPI utilise des épichapéromes comme appâts multiplex pour capturer les changements d’interaction coordonnés entre de nombreuses protéines en un seul pull-down, permettant une identification LC-MS/MS évolutive et une analyse centrée sur la voie à partir du matériel primaire. En pratique, dfPPI peut amorcer en aval, une validation axée sur les appâts (par exemple, AP-MS sur des nœuds spécifiques), tandis que les méthodes traditionnelles peuvent affiner la topologie (contacts directs, contraintes spatiales) pour les complexes mis en évidence par dfPPI. Voir le tableau 1 pour une comparaison côte à côte.

Plusieurs étapes critiques influencent le succès du flux de travail. Tout d’abord, des extraits de protéines de haute qualité sont essentiels. Cela nécessite une manipulation soigneuse des tissus ou des cellules, idéalement congelés et stockés à -80 °C, afin de minimiser la protéolyse et de préserver les complexes natifs. L’inclusion d’inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase n’est pas négociable : l’intégrité de l’épichaperome, qui agit comme « l’appât » fonctionnel dans ce test, dépend de modifications post-traductionnelles spécifiques de composants de base tels que HSP9023,43. Par exemple, la phosphorylation de Ser226 et Ser255 est essentielle pour stabiliser la conformation de l’épichapérome et préserver sa fonction d’échafaudage23. L’omission d’inhibiteurs de la phosphatase risque d’entraîner un effondrement structurel et une perte de spécificité biologique.

Un autre déterminant clé est la qualité et la manipulation de la matrice d’affinité des billes de PU. Les billes doivent être stockées dans de l’isopropanol à 100 % à -20 °C et utilisées dans une fenêtre d’activité définie, idéalement dans un délai de 1 à 2 ans. L’activité doit être validée avant les expériences critiques, car les billes âgées peuvent présenter une capacité de liaison réduite ou une augmentation des interactions non spécifiques. Le temps d’incubation et l’apport en protéines doivent également être optimisés : une incubation excessive peut augmenter le bruit de fond, tandis qu’un apport insuffisant en protéines peut compromettre la profondeur de détection. Nous recommandons des incubations de 3 h et des descentes pilotes pour calibrer l’entrée appropriée pour chaque type d’échantillon.

Deux stratégies de digestion sont compatibles avec ce protocole : sur bille et dans le gel. Bien que les deux flux de travail produisent des résultats reproductibles, chacun offre des compromis. La digestion dans le gel peut introduire des contaminants tels que la kératine et nécessite des étapes de manipulation supplémentaires. La digestion sur bille rationalise le flux de travail et est généralement préférée lorsque le débit d’échantillons ou la quantité d’entrée sont limités. Cependant, les quantités de protéase doivent être calibrées en fonction de l’apport total en protéines : bien que la méthode soit conçue pour 750 ng de trypsine, une digestion incomplète peut se produire si les niveaux de protéines sont élevés, ce qui entraîne des clivages manqués et une récupération réduite des peptides. Il est conseillé d’évaluer l’efficacité de la digestion et d’ajuster l’apport enzymatique en conséquence. Toutes les étapes de la digestion doivent être effectuées dans des tubes à faible liaison utilisant des réactifs fraîchement préparés et sans contamination pour assurer l’uniformité et minimiser le bruit de fond.

La charge protéique par injection LC-MS dépend du flux de capture, du rendement en peptides et de la capacité de la colonne. Pour les digestions sur billes analysées sur des colonnes nano-LC C18 standard (~50-75 μm ID, ~15-25 cm), nous chargeons généralement 300-500 ng par injection ; Nous n’avons pas observé de gains de performance supérieurs à ~400-500 NG, tandis que des charges plus élevées risquent la suppression des ions et l’élargissement des pics. Pour les flux de travail en gel (par exemple, cinq tranches par voie), nous injectons généralement ~25 % de matériau dessalé par tranche et par réplication et conservons ~50 % en réserve pour la réinjection si nécessaire. Dans tous les cas, mesurez la concentration peptidique avant l’injection, vérifiez la réponse linéaire à l’aide d’un digest QC et ajustez la charge de manière à ce que la forme du pic chromatographique et la profondeur d’identification soient maintenues sans surcharge.

La quantification sans marquage par DIA est largement utilisée en protéomique en raison de sa reproductibilité et de sa profondeur46. Cependant, dans le contexte d’expériences de capture d’affinité comme celle-ci, où l’objectif est d’identifier les protéines interagissant avec les échafaudages de l’épichapérome plutôt que de mesurer l’abondance globale des protéines, les stratégies de normalisation comme MaxLFQ ne sont pas appropriées. Ces approches supposent une entrée uniforme et une similitude à l’échelle du protéome, qui sont violées par l’étape d’enrichissement intrinsèque à ce protocole. Au lieu de cela, les valeurs d’intensité ou les comptages spectraux MS/MS fournissent une quantification suffisante et biologiquement significative pour l’analyse fonctionnelle en aval. Ces paramètres reflètent la force d’interaction relative ou la fréquence des protéines avec les épichapéromes dans toutes les conditions. Comme l’ont démontré des études antérieures 16,17,18,20, ces valeurs sont bien adaptées aux analyses d’interactome au niveau des systèmes telles que le dfPPI, qui identifient les voies biologiques modifiées sans s’appuyer sur la normalisation à l’échelle du protéome. En préservant la véritable variance biologique introduite par la maladie ou le traitement, la quantification basée sur l’intensité ou la MS/MS permet une cartographie précise et robuste des dysfonctionnements du réseau IPP.

Bien que la capture d’affinité réduise l’espace de recherche par rapport au lysat entier, les pull-downs dfPPI contiennent toujours des centaines à des milliers de protéines couvrant une large gamme dynamique, ainsi qu’un arrière-plan co-enrichi. Pour les comparaisons à l’échelle de la cohorte, la sélection stochastique des précurseurs de DDA conduit à des valeurs manquantes d’une série à l’autre et à un échantillonnage variable d’interacteurs de faible abondance18. La DIA fragmente systématiquement tous les ions dans des fenêtres prédéfinies, offrant une plus grande profondeur, moins de valeurs manquantes et des propriétés de reproductibilité plus élevées d’une série à l’autre qui sont cruciales lorsque l’inférence en aval est au niveau de la voie/du réseau plutôt qu’à l’échelle d’une seule protéine. C’est pourquoi nous standardisons sur DIA pour dfPPI.

Comme pour toutes les méthodes de capture d’affinité, la liaison aux protéines non spécifiques est une considération inhérente. Les protéines peuvent être conservées en raison de leur adhérence à la résine, de leur abondance élevée ou de leur agrégation. Bien que de tels interacteurs non spécifiques puissent apparaître dans l’éluat pull-down, leur présence ne compromet pas l’objectif analytique en aval de ce protocole17. Le flux de travail dfPPI n’est pas conçu pour définir des interactions binaires, mais plutôt pour extraire des modèles de recâblage PPI au niveau des systèmes. Des analyses d’enrichissement fonctionnel sont effectuées sur des interacteurs différentiels et exploitent les statistiques basées sur le réseau pour révéler des altérations coordonnées au niveau de la voie. Comme démontré dans des travaux précédents17, cette approche au niveau des systèmes minimise l’impact des protéines non spécifiques isolées et permet d’obtenir des conclusions biologiques robustes à partir de données au niveau de la cohorte.

Par rapport aux approches conventionnelles de cartographie de l’interactome, telles que la co-immunoprécipitation, le marquage de proximité ou la réticulation, la plateforme dfPPI offre un avantage distinct : elle capture le remodelage fonctionnel de l’interactome dans des conditions pertinentes pour la maladie sans nécessiter d’ingénierie d’appât ou de surexpression. Parce que la méthode isole des complexes protéiques formés autour d’épichapéromes supramoléculaires, elle détecte des assemblages de protéines émergentes qui ne sont pas présents dans les systèmes sains, ce qui permet de découvrir de nouveaux facteurs de maladies. L’approche est évolutive et adaptable à tous les tissus, espèces et états pathologiques, et elle a déjà fourni des informations uniques sur le remodelage du protéome dans le cancer et la neurodégénérescence. En tant que telle, cette méthode offre un outil puissant pour découvrir des réseaux fonctionnels perturbés dans les maladies humaines.

Au-delà des exemples ici, dfPPI est bien positionné pour (i) de grandes cohortes cliniques pour stratifier les patients par dysfonctionnement du réseau et découvrir des biomarqueurs pharmacodynamiques qui rendent compte de l’engagement de la cible et de la correction de la voie ; (ii) l’échantillonnage longitudinal (p. ex., pré/post-traitement, stadification de la maladie) pour suivre les trajectoires de recâblage et prédire les répondeurs ; (iii) l’intégration avec la phosphoprotéomique et d’autres omiques sensibles au PTM pour relier les changements d’état d’interaction à la signalisation en amont ; (iv) des captures spatialement résolues dans des régions microdisséquées (interfaces tumorale-normale, sous-régions cérébrales) pour cartographier la pathobiologie du réseau local ; (v) des écrans de perturbation (génétiques ou composés) où les lectures dfPPI désignent des nœuds actionnables et des mécanismes d’action ; et (vi) la modélisation graphique/IA qui apprend les caractéristiques du réseau spécifiques à la maladie à partir de cartes dfPPI pour le pronostic et la conception thérapeutique. Sur le plan méthodologique, la miniaturisation, l’automatisation (par exemple, les formats à 96 puits) et le contrôle qualité standardisé permettront des pipelines à haut débit pour les études translationnelles et les essais cliniques. Enfin, les sorties dfPPI peuvent amorcer des suivis ciblés - AP-MS, XL-MS ou étiquetage de proximité - pour résoudre la topologie des modules prioritaires, soulignant la complémentarité de la méthode au sein de la boîte à outils interactomique.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) détient les droits intellectuels sur le portefeuille d’épichaperome. G.C., A.R., C.S.D. et S.S. sont des inventeurs sur la propriété intellectuelle sous licence. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par les NIH (R01 CA172546, U01 AG032969, P01 CA186866, R56 AG061869, R01 AG067598, R01 AG074004, R01 AG072599, R56 AG072599, RF1 AG071805, P30 CA008748, S10 RR027990) et M. William H. et Mme Alice Goodwin et la Fondation du Commonwealth pour la recherche sur le cancer et le Centre de thérapeutiques expérimentales du MSKCC (G.C.). S.S. tient à remercier la Fondation BrightFocus pour son soutien financier (numéro du prix : A2022020F).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-mercaptoéthanolSigma-AldrichM6250Toxique, Combustible
Acétonitrile (ACN) Optima  ;Fisher Scientific & nbsp ;A955-1Grade LC/MS (Inflammable)
Milieux de chromatographie d’affinité activée par Affi-Gel 10Bio-Rad1536099Utilisé pour fabriquer des billes de PU et des billes de contrôle (inflammable)
Bicarbonate d’ammonium (ABC)Sigma-Aldrich09830-500G
Colonne UHPLC Aurora Ultimate 25x75 C18IonOpticksAUR3-25075C18-CSI
Film autoradiographiqueEWEN-PARKER X-RAY CORPEBA45Alternative à la détection du signal chimiluminescent après Western blot
Biomasher micro homogénéiseur tissulaireDWK Sciences de la vie Kimble7496250010Utilisé pour homogénéiser les tissus cérébraux gelés pour l’extraction des protéines
Bleu de bromophénolBioréactif de FisherBP115-25
Centrifugeuse pour tubes de 1,5 mLEppendorf5424
Centrifugeuse pour tubes de 1,5 mL   ;Eppendorf5417RAvec contrôle de la température
Centrifugeuse pour tubes de 15 à 50 mLEppendorf5810RUtilisation pour les tubes coniques
Système d’imagerie ChemiDoc MPBio-Rad17001402Utilisé pour la densitométrie gel/blot
Four à colonnesSonation GmBH, AllemagneES071/ES072Maintient la colonne nanoLC à 50 °rés ; C pour une rétention constante
Tubes coniques (15 mL)Fisher Scientific352096
Billes de contrôleLaboratoire de chioseN/ATaldone et al. (PMID :  ; 21459002)
Coloration Coomassie G-250 (Bio-sûre)Bio-Rad1610786
Tubes Eppendorf sombres (1,5 mL)USA Scientific1415-2507
Dithiothréitol (TDT)Roche10197777001Irritant
Facile nLC 1000Thermo Fisher ScientificFacile nLC 1000Système LC utilisé avec Q Exactive HF
Disques d’extraction en phase solide EmporeCompagnie 3M2215-C18 (Octadécyle)Utilisé pour préparer les StageTips pour le désalage des peptides ; Activé avec du méthanol à 100 %
Kit de chimiluminescence améliorée (ECL)Thermo Fisher Scientific32209
Tubes d’Eppendorf (1,5 mL)Fisher Scientific05-408-129
Acide formique (FA) Optima  ;Fisher ScientificA117-10X1AMPGrade LC/MS
g :Profiler (e111_eg58_p18_f463989d)Groupe BIIT - Tartu & Uuml ; likoolhttps://biit.cs.ut.ee/gprofiler/gostEnrichissement des voies
GlycérolBioréactif de FisherBP229-1Grade en biologie moléculaire
GlycineBioréactif de FisherBP381-5Poudre cristalline
Anticorps secondaire conjugué HRP de la chèvre (RRID : AB_2619742)Sothern Biotech1030-05Secondaire pour l’anticorps H90-10
Anticorps secondaire conjugué HRP anti-lapin de chèvre (RRID : AB_2632593)Sothern Biotech4010-05Secondaire pour le HSP90 et alpha ; et anticorps HOP
Anticorps secondaire conjugué HRP anti-rat de chèvre (RRID : AB_2716837)Sothern Biotech3030-05Secondaire pour l’anticorps HSC70
Vibrateur orbital chaufféEppendorfThermoMixer C (2231001127)
HeLa protéine digérer standard-PierceThermo Fisher Scientific88329Utilisation pour l’évaluation du contrôle qualité LC-MS
Anticorps HOP (RRID : AB_10828378)Signalisation cellulaire5670Pour le contrôle qualité des billes en PU
Anticorps HSC70 (RRID : AB_10617277)EnzoSPA-815Pour le contrôle qualité des billes en PU
Anticorps HSP90 (H90-10) (RRID : AB_854214)StressMarqSMC-107Pour le contrôle qualité des billes en PU
Anticorps HSP90 alpha (RRID : AB_303423)AbcamAb2928Pour la normalisation conformément à la section 1.2
Lignée cellulaire humaine : ASPC1 (RRID :CVCL_0152)ATCCCRL-1682Ligne cellulaire de contrôle, épichaperome faible / chaperon élevé
Lignée cellulaire humaine : MDA-MB-468 (RRID : CVCL_0419)ATCCHTB-132Lignée cellulaire contrôle, épichaperome high / chaperone high
ImageJ (v1.54p)Wayne Rasbandhttps://imagej.net/ij/Densitométrie
Iodoacétamide (IAA)Sigma-AldrichI1149-5GToxique
Tubes microcentrifuges à faible liaison aux protéinesSarstedt72.706.600
Protéase Lys-CProméga  ;VA1170Grade LC/MS
Chlorure de magnésiumSigma-Aldrich63068Grade en biologie moléculaire
MaxQuant (v2.1.1.0)Institut Max-Planck de biochimiehttps://www.maxquant.org/Flux de travail MaxDIA pour l’identification peptide/protéine et la quantification sans marqueur basée sur l’intensité
MéthanolFisher ChemicalA454-4Grade HPLC, inflammable, toxique
Mini comprimé cocktail inhibiteur de protéase (Complet)Roche4693124001
Mini cellule de transfert électrophorétique Trans BlotBio-Rad1703930
Réservoir d’électrophorèse mini-gel & nbsp ;Thermo Fisher ScientificA25977Utilisation pour les gels préfabriqués Novex
Cellule d’électrophorèse verticale tétra-PROTEAN Mini-PROTEAN   ;Bio-Rad1658004Utilisé pour les gels protéiques préfabriqués mini-PROTÉENS ou les gels moulés à la main
Mini-PROTEAN  ; Gels protéiques préfabriqués TGX (4&ndash ; 20%)Bio-Rad4561094
NanoDropAgilentBioTek Synergy H1Utilisé pour estimer la concentration de peptides avant l’injection de LC-MS
NanoElute 2Brukerhttps://flextra.hu/images/keszulekek/daltonics/nanoelute-brosura_eng.pdfUtilisation dans le flux de travail diaPASEF
Source Nanospray FlexThermo Fisher ScientificES071Pour le couplage ESI du nanospray
Nouvel objectif PicoTip Emmiter/PicoFrit SELF/PNew Objective Inc.PF360-75-10-N-5Rempli de boue C18 jusqu’à 20 cm de longueur
Membrane de nitrocelluloseCytiva Amersham10600006
Lait sec écréméLaboratoire scientifiqueM0841
Gels préfabriqués Novex 8 % Tris-GlycineThermo Fisher ScientificXP00080BOX
NP-40Roche11754599001
Solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010023
Comprimé cocktail d’inhibiteur de phosphatase PhosSTOPRoche4906837001
Kit de test protéique Pierce BCAThermo Fisher Scientific23225
Contenants en plastiqueFisher ScientificFB0875711A
Oscillateur à plateformeCorning6705
Chlorure de potassiumBioréactif de FisherBP366-1Cristaux blancs
Alimentation universelle PowerPacBio-Rad1645070
Protéines Kaléidoscopes Protéines Préneinées Precision PlusBio-Rad1610375
Comptes de PU-perlesLaboratoire de chioseN/ATaldone et al. (PMID :  ; 21459002)
Spectromètre de masse HF exactif Orbitrap QThermo Fisher Scientifichttps://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/brochures/BR-64052-LC-MS-Q-Exactive-HF-Orbitrap-BR64052-EN.pdfUtilisation pour le DIA-MS
ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 & micro ; mDr. Maisch GmbH, AllemagneR13.aqdes milieux siliciformes pour la séparation des peptides ; Suspension de poudre/méthanol (1:3, v/v)
Unité de rotation (rotateur bout sur bout)Barnstead  ; International400110
Cartouches Sep-Pak C18 (100 mg)Waters CorporationWAT023590
Dodécyle sulfate de sodium (SDS)Bioréactif de FisherBP166-500Grade d’électrophorèse
SonicatorBranson2510
Lecteur de microplaques multimodes SpectraMax ParadigmDispositifs moléculairesParadigme SpectraMax
SpectronautBiognosyshttps://biognosys.com/software/spectronaut/Flux de travail directDIA
Concentrateur SpeedVacThermo Fisher Scientific & nbsp ;Savant SPD111V
Vide d’aspirationSanté CardinaleCDL-65651-320
Spectromètre de masse TimsTOF HTBrukerhttps://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-ht.htmlUtilisé pour l’analyse diaPASEF
Optima de l’acide trifluoracétique (TFA)Sigma-AldrichT6508-10AMPQualité LC/MS (Corrosive, combustible)
TrisBioréactif de FisherBP152-5Poudre cristalline ; Grade en biologie moléculaire
Tris, pH 6,8 (1 M)TeknovaT1068
Tris, pH 7,5 (1 M)Bioréactif de FisherBP1757-500Grade en biologie moléculaire
Tampon saline tris-tamponné (20x TBS)VWR, sciences de la vie97064-338
Tris-Glycine-SDS (TGS 10x) fonctionnant avec gel bufferBioréactif de FisherBP13414Électrophorèse
Trypsine & nbsp ;PromegaV5111Grade de séquençage
Trypsine GoldPromegaV5280
Préadolescent 20Bioréactif de FisherBP337-100
UréeSigma-AldrichU0631-500G
TourbillonFisher Scientific02-215-414
EauFisher ScientificW6-1Grade LC/MS

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Liu, Z., Miller, D., Li, F., Liu, X., Levy, S. F. A large accessory protein interactome is rewired across environments. Elife. 9, e62365(2020).
  2. Omranian, S., Nikoloski, Z., Grimm, D. G. Computational identification of protein complexes from network interactions: Present state, challenges, and the way forward. Comput Struct Biotechnol J. 20, 2699-2712 (2022).
  3. Ginsberg, S. D., Sharma, S., Norton, L., Chiosis, G. Targeting stressor-induced dysfunctions in protein-protein interaction networks via epichaperomes. Trends Pharmacol Sci. 44 (1), 20-33 (2023).
  4. Nussinov, R. Pioneer in molecular biology: Conformational ensembles in molecular recognition, allostery, and cell function. J Mol Biol. 437 (11), 169044(2025).
  5. Lacoste, J., et al. Pervasive mislocalization of pathogenic coding variants underlying human disorders. Cell. 187 (23), 6725-6741.e13 (2024).
  6. Liu, X., Abad, L., Chatterjee, L., Cristea, I. M., Varjosalo, M. Mapping protein-protein interactions by mass spectrometry. Mass Spectrom Rev. , (2024).
  7. Luck, K., Sheynkman, G. M., Zhang, I., Vidal, M. Proteome-scale human interactomics. Trends Biochem Sci. 42 (5), 342-354 (2017).
  8. Greenblatt, J. F., Alberts, B. M., Krogan, N. J. Discovery and significance of protein-protein interactions in health and disease. Cell. 187 (23), 6501-6517 (2024).
  9. Gonzalez-Avendano, M., Lopez, J., Vergara-Jaque, A., Cerda, O. The power of computational proteomics platforms to decipher protein-protein interactions. Curr Opin Struct Biol. 88, 102882(2024).
  10. Komives, E. A., Chiosis, G. Editorial overview: Protein networks in health and disease. Curr Opin Struct Biol. 90, 102953(2025).
  11. Botticelli, L., et al. Chemical cross-linking and mass spectrometry enabled systems-level structural biology. Curr Opin Struct Biol. 87, 102872(2024).
  12. Chakrabarty, S., Wang, S., Roychowdhury, T., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. Introducing dysfunctional protein-protein interactome (dfppi) - a platform for systems-level protein-protein interaction (ppi) dysfunction investigation in disease. Curr Opin Struct Biol. 88, 102886(2024).
  13. Pasala, C., et al. Epichaperomes: Redefining chaperone biology and therapeutic strategies in complex diseases. RSC Chem Biol. 6 (5), 678-698 (2025).
  14. Chu, F., Sharma, S., Ginsberg, S. D., Chiosis, G. PTMs as molecular encoders: Reprogramming chaperones into epichaperomes for network control in disease. Trends Biochem Sci. , (2025).
  15. Chiosis, G., Digwal, C. S., Trepel, J. B., Neckers, L. Structural and functional complexity of hsp90 in cellular homeostasis and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (11), 797-815 (2023).
  16. Rodina, A., et al. The epichaperome is an integrated chaperome network that facilitates tumour survival. Nature. 538 (7625), 397(2016).
  17. Rodina, A., et al. Systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation. Nat Commun. 14 (1), 26(2023).
  18. Inda, M. C., et al. The epichaperome is a mediator of toxic hippocampal stress and leads to protein connectivity-based dysfunction. Nat Commun. 11 (1), 19(2020).
  19. Joshi, S., et al. Pharmacologically controlling protein-protein interactions through epichaperomes for therapeutic vulnerability in cancer. Commun Biol. 4 (1), 20(2021).
  20. Bay, S., et al. Systems-level interactome mapping reveals actionable protein network dysregulation across the alzheimer's disease spectrum. Res Sq. , (2025).
  21. Moulick, K., et al. Affinity-based proteomics reveal cancer-specific networks coordinated by HSP90. Nat Chem Biol. 7 (11), 818-826 (2011).
  22. Kishinevsky, S., et al. Hsp90-incorporating chaperome networks as biosensor for disease-related pathways in patient-specific midbrain dopamine neurons. Nat Commun. 9, 15(2018).
  23. Roychowdhury, T., et al. Phosphorylation-driven epichaperome assembly is a regulator of cellular adaptability and proliferation. Nat Commun. 15 (1), 8912(2024).
  24. Roychowdhury, T., et al. Use of native-page for the identification of epichaperomes in cell lines. Methods Mol Biol. 2693, 175-191 (2023).
  25. Taldone, T., et al. synthesis, and evaluation of small molecule HSP90 probes. Bioorg Med Chem. 19 (8), 2603-2614 (2011).
  26. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  27. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  28. Kovalchuk, S. I., Jensen, O. N., Rogowska-Wrzesinska, A. Flashpack: Fast and simple preparation of ultrahigh-performance capillary columns for LC-MS. Mol Cell Proteomics. 18 (2), 383-390 (2019).
  29. Sinitcyn, P., et al. Maxdia enables library-based and library-free data-independent acquisition proteomics. Nat Biotechnol. 39 (12), 1563-1573 (2021).
  30. DiscoveryLibraries. , The Max Planck Institute of Biochemistry. Available from: https://datashare.biochem.mpg.de/s/qe1IqcKbz2j2Ruf?dir=/DiscoveryLibraries (2025).
  31. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal Chem. 75 (3), 663-670 (2003).
  32. Meier, F., et al. Diapasef: Parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 17 (12), 1229-1236 (2020).
  33. Lou, R., et al. Benchmarking commonly used software suites and analysis workflows for dia proteomics and phosphoproteomics. Nat Commun. 14 (1), 94(2023).
  34. Demichev, V., et al. Dia-pasef data analysis using fragpipe and dia-nn for deep proteomics of low sample amounts. Nat Commun. 13 (1), 3944(2022).
  35. Wen, C., et al. Evaluation of DDA library-free strategies for phosphoproteomics and ubiquitinomics data-independent acquisition data. J Proteome Res. 22 (7), 2232-2245 (2023).
  36. Bowler-Barnett, E. H., et al. Uniprot and mass spectrometry-based proteomics-A 2-way working relationship. Mol Cell Proteomics. 22 (8), 100591(2023).
  37. Demichev, V., Messner, C. B., Vernardis, S. I., Lilley, K. S., Ralser, M. Dia-nn: Neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods. 17 (1), 41-44 (2020).
  38. Wang, T., Digwal, C. S., Alam, A., Chiosis, G. R. script epichaperomics - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation. Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7416220 (2022).
  39. Chaperomics_ad_2019. , Chiosislab. https://github.com/chiosislab/Chaperomics_AD_2019 (2019).
  40. Chaperomics_controllability_2020. , Chiosislab. https://github.com/chiosislab/Chaperomics_controllability_2020 (2019).
  41. Alam, A., Wang, T., Chiosis, G. Cytoscape files - systems-level analyses of protein-protein interaction network dysfunctions via epichaperomics identify cancer-specific mechanisms of stress adaptation [data set]. Zenodo. , https://doi.org/10.5281/zenodo.7433980 (2022).
  42. Kolberg, L., et al. G:Profiler-interoperable web service for functional enrichment analysis and gene identifier mapping (2023 update). Nucleic Acids Res. 51 (W1), W207-W212 (2023).
  43. Yan, P. R., et al. Molecular stressors engender protein connectivity dysfunction through aberrant n-glycosylation of a chaperone. Cell Reports. 31 (13), 27(2020).
  44. Castelli, M., et al. How aberrant n-glycosylation can alter protein functionality and ligand binding: An atomistic view. Structure. 31 (8), 987-1004.e8 (2023).
  45. Sharma, S., et al. Unraveling the mechanism of epichaperome modulation by zelavespib: Biochemical insights on target occupancy and extended residence time at the site of action. Biomedicines. 11 (10), 2599(2023).
  46. Guzman, U. H., et al. Ultra-fast label-free quantification and comprehensive proteome coverage with narrow-window data-independent acquisition. Nat Biotechnol. 42 (12), 1855-1866 (2024).

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

R seaux d interactions prot ine prot inem thode chimioprot omiquecartographie des r seaux de maladiesenrichissement par affinitchromatographie en phase liquide coupl e la spectrom trie de masseassemblages d pichaperomesenrichissement de complexes prot iquesanalyse d enrichissement de voiesbiologie des syst mes

Articles connexes