Le Réseau d’évaluation préclinique des AVC Modèle multilaboratoire de l’AVC thromboembolique avec thrombolyse : TE-MCAo

Résumé

Pour simuler un AVC thromboembolique, des emboles préparés à partir de sang hétérologue de rat ont été injectés dans l’artère cérébrale moyenne, suivis d’une thrombolyse systémique pour la recanalisation. Cette version du modèle est optimisée pour une utilisation dans un réseau multi-laboratoires et permet de tester plusieurs thérapeutiques candidats.

Résumé

Les modèles actuels d’AVC translationnel chez les rongeurs induisent l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) à l’aide de filaments en nylon, d’emboles injectés, de thrombine intraluminale ou d’endothéline-1 périvasculaire pour simuler un AVC humain. Parmi ces méthodes, l’injection de thromboembolie suivie de thrombolyse imite le mieux les événements neuroinflammatoires observés chez les patients humains et peut être préférable à la méthode du filament de nylon inerte la plus largement utilisée. Les modèles thromboemboliques standards, utilisés dans les principaux laboratoires individuels, peuvent cependant être longs, produire des résultats variables et nécessiter une maîtrise considérable. Pour remédier à ces limitations, nous avons développé un modèle MCAo thromboembolique ciblant l’occlusion des vaisseaux et utilisant la thrombolyse intraveineuse pour obtenir une recanalisation, parallèlement à la thrombolyse systémique administrée dans les scénarios cliniques. Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons développé une méthode de stockage du sang provenant d’animaux donneurs pour une préparation ultérieure des emboles pour plusieurs sujets. Notre utilisation de microcathéters Doccol préfabriqués simplifie la préparation et l’injection des thrombus en préchargeant les thromboemboles dans les microcathéters qui sont ensuite insérés dans l’artère carotide interne. Pour obtenir la recanalisation, nous avons infusé du Tenecteplase par voie intraveineuse à une dose de 1,5 mg/kg. Pour promouvoir la reproductibilité, nous avons préparé et testé sur le terrain des procédures opérationnelles standard, des vidéos de formation et des ateliers pratiques de formation chirurgicale. Le modèle utilise une approche chirurgicale standard qui devrait être familière à tous les chercheurs utilisant le modèle largement accepté en filament de nylon. Le passage du microcathéter dans l’artère carotide interne distale, en évitant l’artère ptérygopalatine, se fait de manière similaire à l’insertion du filament de nylon. La récupération et les évaluations post-AVC peuvent être réalisées selon des protocoles comportementaux, radiographiques et histologiques habituels. Ce modèle propose une approche pratique, reproductible et accessible pour les chercheurs recherchant un modèle MCAo thromboembolique avec recanalisation contrôlée.

Introduction

L’AVC est une cause majeure de décès et d’invalidité dans le^{monde 1}. De nombreux patients bénéficient de la thrombolyse intraveineuse, et certains patients bénéficient de la thrombectomie mécanique. Puisque tous les patients n’arrivent pas à l’hôpital à temps pour une thrombolyse ou une thrombectomie, et que tous ne bénéficient pas d’une récupération complète, il existe un besoin important de développer davantage des traitements cérébroprotecteurs supplémentaires ou complémentaires. Le modèle d’AVC ischémique chez les rongeurs le plus utilisé est l’occlusion monofilament de l’artère cérébrale moyenne (MCA) suivie d’une réperfusion complète. Ce modèle simule l’occlusion des grands vaisseaux (LVO), modélisant des patients souffrant d’AVC importants subissant une thrombectomie mécanique complète réussie. Cependant, ce modèle regroupe un faible pourcentage d’AVC cliniques. En revanche, de plus en plus de patients souffrent d’AVC thromboemboliques secondaires à l’athérosclérose (rupture in situ de plaque athéroscléreuse ou athéro-embolie due à une maladie systémique), et sont traités uniquement par thrombolyse systémique, que le modèle en nylon ne parvient pas à reproduire ^2,3. De plus, le modèle MCAo en filament de nylon ne présente pas la cascade inflammatoire associée à l’occlusion^{thrombotique 4,5}. Les modèles animaux utilisant des thromboembolies suivis d’une administration systémique de thrombolytiques représenteraient la physiopathologie et la biologie de base chez de nombreux patients victimes^{d’AVC 4,6}. Jusqu’à présent, cependant, les modèles d’AVC thromboembolique chez les rongeurs sont connus pour être complexes et difficiles à reproduire. Dans des laboratoires isolés avec des experts dédiés, un modèle thromboembolique peut être réalisé avec une reproductibilité raisonnable. Un tel modèle ne se prête pas facilement à une utilisation généralisée, comme cela est nécessaire pour les projets multi-laboratoires.

Nous fournissons ici des protocoles détaillés pour une occlusion thromboembolique de l’artère cérébrale moyenne (TE-MCAo) mise à jour et standardisée, suivie d’un modèle de thrombolyse systémique. Plus précisément, nous avons simplifié la préparation du thrombus, standardisé le chargement du thrombus dans les cathéters, et validé la scalabilité de ce modèle pour des essais multi-laboratoires. Nous avons développé ce modèle pour une utilisation dans le Réseau d’évaluation préclinique des AVC (SPAN). Nous avions cependant l’intention que le modèle soit utile à tout réseau cherchant à mettre en œuvre des essais précliniques à fort volume de nouveaux traitements candidats. Grâce à notre modèle standardisé, nous avons pu induire TE-MCAo chez 6 rats par jour par site d’étude pendant la période d’étude.

SPAN et des réseaux similaires se sont développés en réponse à des échecs répétés et persistants à traduire les cérébroprotecteurs prometteurs du cadre préclinique au succès en pratique^{clinique 7}. En 2019, les National Institutes of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) ont lancé SPAN⁸. SPAN vise à filtrer plus efficacement les traitements potentiels en minimisant les biais grâce au masquage centralisé, à la randomisation et à l’analyse centralisée des résultats. SPAN 1 a utilisé le modèle en filament de nylon lors de ses deux premières itérations car tous les laboratoires participants l’utilisaient déjà, et il était facile de déployer^{le 9}. Pour modéliser plus fidèlement de nombreux aspects de la thromboembolie et de la thrombolyse, SPAN a cherché à créer le modèle TE-MCAo décrit ici. Ce modèle serait utile pour les chirurgiens précliniques qui passent du modèle en filament de nylon au modèle TE-MCAo. Nous recommandons que les laboratoires précliniques confirment la présence d’AVC 24h/48 après MCAo (ou TE-MCAo) à l’aide d’une technique d’imagerie, par exemple l’imagerie par résonance magnétique (IRM).

Le réseau SPAN a été entièrement décrit dans des études^{précédentes 9}, et toutes les procédures opérationnelles standard (SOP) SPAN sont disponibles sur le site web de SPAN. En résumé, le réseau est géré par un centre de coordination (CC) qui gère la distribution des médicaments, le contrôle de la qualité des données, la vérification du respect des protocoles et la communication réseau. Tous les SOP sont rédigés par le CC et approuvés par un comité directeur après révision. Dans SPAN, tous les rongeurs disposent d’une plaque auriculaire à code à barres compatible IRM placée à leur arrivée dans les laboratoires de recherche, et tous les sujets sont enregistrés dans la base de données REDCap (SPAN Research Electronic Data Captur). Les animaux sont randomisés par le CC à l’aide de tables de randomisation stratifiées pour site et sexe. Dans SPAN 1 et SPAN 2, des thérapies thérapeutiques présumées ont été étudiées pour leur efficacité dans six laboratoires de recherche participants. Tous les médicaments testés étaient emballés dans des fioles identiques, marqués au centre de coordination, puis expédiés aux laboratoires de recherche au début du projet.

Protocole

Tous les laboratoires SPAN participants, y compris le centre de coordination de l’USC, ont suivi les directives du NIH et de l’AAALAC pour le traitement humain et éthique des animaux. L’approbation de l’IACUC locale a été obtenue sur tous les sites.

1. Préparation du thrombus

REMARQUE : Tout le sang et le thrombus doivent être manipulés conformément à toutes les directives institutionnelles locales concernant les biohazards. Tous les matériaux entrant en contact avec le sang doivent être soit éliminés comme déchets biologiquement dangereux, soit, dans le cas des instruments chirurgicaux, soigneusement lavés et désinfectés par autoclave. Pour réduire l’utilisation d’animaux donneurs de sang dans cet essai, nous avons développé une méthode de stockage du sang des donneurs, puis d’utiliser le sang pour fabriquer des thromboemboles selon les besoins.

1. Prélever du sang frais du donneur d’une artère dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL ou des microtubes d’acide tétraacétique d’éthylénèdiamine pédiatrique (EDTA), remplissant seulement jusqu’au niveau de 500 μL.
   REMARQUE : Nous préférons la canulation de l’artère fémorale pour nos prises de sang, car l’artère fémorale a un grand diamètre luminal permettant la cathétérisation, elle est bilatérale permettant deux prises distinctes, et constitue une chirurgie survivante pour les rongeurs. Le sang peut être stocké à 4 °C pendant 4 semaines, selon notre expérience.
2. Ajoutez 1 mL de solution de CaCl₂ (5 mg/mL) à 500 μL du sang anticoagulé stocké.
3. Immédiatement après l’inversion de l’anticoagulation avec_{CaCl 2}, aspirez le sang du tube de microcentrifuge dans un tube de 100 cm de PE-50 en utilisant une aspiration douce.
   REMARQUE : Un retard entraînera une coagulation sanguine avant qu’elle ne puisse être aspirée dans le tube du PE-50.
4. Incubez le tube enroulé dans une solution saline préchauffée au phosphate (PBS) à 37 °C pendant 2 heures dans un four de table.
   REMARQUE : Placer la boîte de Petri sur une plaque chauffante ouverte donne un résultat irrégulier en raison d’une répartition irrégulière de la chaleur.
5. À la fin de l’incubation de 2 heures, transférez immédiatement le tube de PE-50 rempli de sang à 4 °C pour le stockage. Il restera utilisable pour les prochaines étapes entre 20 et 72 heures.

2. Chargement du cathéter

1. Reliez le tube enroulé de PE-50 (diamètre interne : 0,58 mm) à une seringue de 3 ou 5 cc remplie de solution saline et expulsez doucement le thrombus dans une boîte de Petri contenant du PBS.
   REMARQUE : Cela peut nécessiter une force considérable. Maintenez la pression sur le site de connexion pour éviter que le cathéter et la seringue ne se déconnectent lors de l’extrusion. Le cathéter PE-50 peut être découpé en segments plus petits (10 à 50 cm) si nécessaire pour faciliter l’extrusion.
2. Coupez des sections de thrombus d’environ 6 cm de long avec une lame de rasoir.
3. Lavez chaque segment de thrombus en le tirant doucement dans un cathéter PE-50 et en l’expulsant complètement 5 fois.
4. Ensuite, lavez le thrombus en le tirant doucement dans un cathéter PE-10 (diamètre interne : 0,279 mm) et en l’expulsant complètement 15 fois.
   REMARQUE : Si des casses fréquentes sont détectées durant cette étape, envisagez d’utiliser un grossissement avec un microscope opératoire ou une loupe chirurgicale afin de s’assurer que le thrombus est aspiré en ligne avec l’ouverture du cathéter.
5. OPTIONNEL : Utiliser le bleu d’Evan pour visualiser les thrombes
   1. Préparez du bleu d’Evan à 4 % en solution PBS 1x.
   2. Ajoutez 200 μL de bleu d’Evan’s à 4 % dans une boîte de Petri remplie de 10 mL de 1x PBS. Ce sera la solution la plus concentrée = dilution bleue d’Evan #1.
   3. Prenez 400 μL de dilution bleue d’Evan’s #1 et mélangez-les dans une boîte de Petri séparée remplie de 20 mL de 1x PBS. Il s’agit d’une solution diluée de Evan’s Blue = Dilution d’Evan’s Blue #2.
   4. Placez le caillot dans la solution plus concentrée de la boîte de Petri Evan’s Blue (dilution #1) pendant 1 seconde, puis transférez dans la boîte de Petri Evan’s Blue diluée (dilution #2).
6. Chargez un thrombus lavé dans des microcathéters préfabriqués (diamètre intérieur : 0,2 mm, diamètre extérieur : 0,360 mm, longueur : 300 mm, connecté à la serrure Luer femelle) sans emboles d’air en utilisant la méthode humide-humide.
   REMARQUE : Nous recommandons d’utiliser un grossissement (par exemple, des loupes 2,5x) pour cette étape.
7. Une fois le thrombus entièrement chargé, extrudez suffisamment de thrombus pour que exactement 5,0 cm restent dans le microcathéter. Coupez l’excédent avec une lame de rasoir.
   REMARQUE : La longueur du thrombus chargé peut être adaptée à différentes applications selon la taille de l’AVC souhaitée.
8. Marquez le microcathéter à 16 mm de la pointe, afin de délimiter l’étendue du cathéter qui doit être avancée intraluminiquement au-delà de la bifurcation de l’artère carotide commune.

3. Chirurgie animale et anesthésie

1. Induire une anesthésie avec 4 % d’isoflurane dans un mélange oxygène :protoxyde d’azote à 30:70 et maintenir l’anesthésie avec 1-2 % d’isoflurane dans le même mélange gazeux.
2. Administrez des analgésiques de carprofène 5 mg/kg par voie sous-cutanée et de l’atropine 0,05 mg/kg par voie intrapéritonéale pour maintenir le confort animal pendant l’opération.
   REMARQUE : De nombreux chirurgiens infusent le site de l’incision avec 1,0 mL de bupivacaïne (2,5 mg/mL).
3. Maintenez la température corporelle à 37 ± 0,5 °C tout au long de l’opération à l’aide d’une bouillotte contrôlée par une sonde rectale.

4. Collecte de sang de donneur

1. Prélever le sang du donneur par cathétérisme artériel fémoral. Correspondre au sexe biologique du donneur et des receveurs.
2. Si le sang doit être utilisé le même jour :
   1. Préparez trois tubes centrifugeuses de 1,5 mL. Marquez chaque tube à la marque des 500 μL avec un stylo de laboratoire indélébile.
   2. Préparez trois ensembles de tubes PE-50, chacun de 100 cm de long, fixés à une seringue de 1,0 mL à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 23.
3. Si le sang doit être stocké pour une utilisation ultérieure, préparez six microtubes EDTA pédiatriques. Desserre les bouchons pour faciliter l’utilisation plus tard.
4. Préparez un tube PE-50 de 10,0 cm de longueur, serré à une extrémité avec une pince chaussée en caoutchouc et biseauté émoussée à l’autre extrémité.
   1. Pour fabriquer une pince chaussée en caoutchouc, insérez une dente d’une pince hémostatique standard dans un tube PE-100 et garnissez pour l’ajuster. Répétez de l’autre côté.
   2. Pour rendre le PE-50 émoussé, il faut d’abord découper l’extrémité à un angle biseauté. Ensuite, coupez la pointe du biseau à l’aide de microciseaux.
      REMARQUE : Il est important de retirer la pointe pour éviter de perforer la paroi arrière de l’artère après l’insertion, mais si une trop grande partie de la pointe est retirée, la perte de l’effet de biseautage rendra très difficile l’insertion intraluminique du cathéter.
5. Effectuez une découpe standard sur l’artère fémorale.
6. Préparez l’animal (rasez l’intérieur de la cuisse), positionnez-vous en position dorsale couchée sur la table d’opération. Stériliser la peau avec 3 lavages à 70 % d’éthanol suivis d’un lavage avec de la bétadine ou une autre solution antiseptique.
7. Sécurisez les pattes arrière de façon écartée avec des attaches souples.
8. Réaliser une incision verticale sur l’intérieur de la cuisse d’environ 1,5 à 2 cm de long le long du pli naturel de l’intersection inguinale avec la jambe. Cette incision sera orthogonale au parcours anatomique attendu de l’artère fémorale.
9. À l’aide d’une dissection contondante, disséquez soigneusement jusqu’aux vaisseaux fémoraux. Séparez soigneusement l’artère fémorale de la veine et du nerf qui courent dans le même faisceau.
10. Obstruez distalement l’artère fémorale avec une ligature en soie 5-0 et utilisez les queues de la suture pour fournir une légère tension distale avec les hémostats.
11. Squelettiser l’artère fémorale aussi loin que possible proximalement, en retraçant l’artère jusqu’à son origine rétropéritonéale. Placez lâchement une boucle de soie 5-0 autour de l’artère fémorale et utilisez à nouveau les queues pour fournir une tension douce à l’extrémité proximale de l’artère. Ne serrez pas le nœud de soie à ce stade. Cette tension provoquera une hémostasie après la formation de l’artériotomie.
    REMARQUE : La boucle peut être déplacée plus loin proximalement avec une pince d’anévrisme.
12. À environ les deux tiers de la distance de la boucle de suture proximale, placez un morceau de suture de soie sous l’artère et faites une petite artériotomie distale à la suture lâche à l’aide de microciseaux. La suture lâche sera attachée pour fixer le cathéter intraluminien après la canulation.
13. À l’aide de pinces tranchantes, soulevez l’ouverture supérieure de l’artériotomie et introduisez le cathéter biseauté obtondant dans l’ouverture. Avancez le cathéter aussi loin que possible à proximité.
    REMARQUE : Il peut y avoir une friction entre le cathéter et la paroi intérieure du vaisseau. Deux choses peuvent aider à cela : 1) enrober l’extérieur de l’extrémité du cathéter avec un liquide séreux provenant de l’intérieur de la jambe juste avant de l’introduire dans le vaisseau, et 2) utiliser des pinces bloutantes et rainurées, tenir l’extérieur du vaisseau tout en avançant le cathéter en même temps. Cela empêche le vaisseau d’avancer simplement avec le cathéter.
14. Une fois la pointe du cathéter avancée presque jusqu’au point de la boucle proximale, relâchez la tension des queues de cette suture. Le saignement doit être évité grâce à l’ajustement serré du cathéter à l’intérieur du vaisseau.
15. Avancez suffisamment le cathéter pour que la boucle lâche, une fois serré, englobe le cathéter. Serrez doucement la suture, en veillant à ce qu’elle ne soit pas serrée au point d’obstruer le cathéter. Assurez-vous également que la suture ne se trouve pas sur le biseau du cathéter, étant donné la nature effilée de ce segment.
16. Relâche la pince chaussée en caoutchouc. Le cathéter doit immédiatement se remplir de sang.
17. Remplissez les tubes de centrifugeuse ouverts ou les microtubes EDTA pédiatriques, en ne dépassant pas 500 μL dans l’un ou l’autre récipient de collecte.
18. Une fois les microtubes remplis, retirez le cathéter PE-50 de l’artère fémorale, ligavez l’extrémité proximale et fermez l’incision avec une suture de prolène 5-0 interrompue.
19. Si le sang doit être utilisé plus tard, placez les capsules sur les tubes EDTA pédiatriques remplis et conservez-les à 4 °C.
20. Si le thrombus doit être préparé pour une utilisation le jour même, procédez à l’étape 1.2 ci-dessus.
21. Répétez immédiatement avec les autres tubes centrifugeuses.
22. Les donneurs artériels de sang peuvent être renvoyés au vivarium après la récupération de l’anesthésie si un cathétérisme unilatéral a été pratiqué. L’artère fémorale controlatérale pourrait être cathétérisée plus tard, mais après un cathétérisme bilatéral de l’artère fémorale, les donneurs doivent être euthanasiés conformément aux réglementations de l’IACUC.

5. TE-MCAo

REMARQUE : L’approche TE-MCAo utilise la coupe standard sur l’artère carotide commune. Le choix de l’anesthésie et de la méthode de réduction dépend de l’utilisateur. Le protocole commence ici au point où le chirurgien a déjà isolé l’artère carotide commune (ACC), l’artère carotide interne (ACI) et l’artère carotide externe (ACE).

1. Exposez le CCA et rétractez avec une ligature en soie 3-0. Faites de même pour l’ECA et l’ICA.
2. À l’aide d’une ligature ou d’une cautérisation, exposez et obstruez l’artère occipitale.
3. Exposer et rétracter ou occulter l’artère ptérygopalaine (PPA).
   REMARQUE : Avec suffisamment d’expérience, cette étape peut être omise. Nous recommandons de toujours effectuer cette étape lors de l’apprentissage de la procédure.
4. En utilisant une rétraction douce, déplacez l’ECA et l’ICA en configuration « T ».
5. Attachez la ligature CCA seulement après avoir terminé toutes les étapes ci-dessus.
6. Réalisez une artériotomie dans l’ECA (Zea Longa CCA Open^{Methodology 10}) à l’aide de microciseaux.
7. En utilisant la méthode du biseau émoussé décrite à l’étape 4.4.2, préparez la pointe de l’un des micro-cathéters déjà chargés (diamètre intérieur : 0,2 mm, diamètre extérieur : 0,360 mm, longueur : 300 mm, relié à la serrure Luer femelle).
8. Insérez soigneusement le microcathéter avec un thrombus préchargé dans l’ECA. Desserrez la boucle de retenue de l’ACI et avancez le microcathéter intracrânien à 16 mm au niveau de la bifurcation carotidienne sous visualisation directe afin d’éviter une canulation involontaire de l’APP extracrânienne.
   REMARQUE : Si le cathéter préfère entrer dans le CCA, une pression douce avec un applicateur pointu en coton peut aider à orienter le cathéter en avance vers l’ICA.
9. Fixez le microcathéter intraluminal à ICA et CCA à l’aide de soie 3-0, en faisant attention à ne pas trop serrer.
10. Injectez 20 μL dans la seringue de 1 mL avec une pompe à seringue motorisée à un rythme de 10 μL/min pendant une durée de 2 minutes.
    REMARQUE : En général, la pompe à seringue n’avance pas au début tant qu’une pression suffisante n’est pas montée.
11. Injectez 20 μL supplémentaires de solution saline stérile en utilisant les mêmes réglages de pompe.
    REMARQUE : Lors de l’étude du flux sanguin à l’aide d’imagerie laser mouchetée, nous avons obtenu un succès de 100 % avec un rinçage à 20 μL.
12. Retirez le microcathéter et ligavez définitivement l’ECA avec une suture proximale au site artériotomien. Retirez toutes les boucles de retenue. Observez attentivement toute fuite de sang et fixez avec des ligatures supplémentaires si nécessaire.
13. Fermez temporairement l’incision cutanée avec des agrafes ou une suture prolène 5-0 en cours.
14. Retirez l’animal de l’anesthésie et placez-le dans une cage de récupération chaude.
15. Optionnel : Les laboratoires peuvent utiliser la fluidité Doppler laser pour confirmer une occlusion MCA réussie. Alternativement, l’imagerie par résonance magnétique peut être réalisée à 24 ou 48 heures pour confirmer et quantifier un infarctus cérébral.
    REMARQUE : De nombreux utilisateurs préfèrent administrer 1,5 mL de solution saline ou de Ringer lactée par voie sous-cutanée à la fin de l’opération.

6. Thrombolyse systémique

REMARQUE : Le tenectéplase (TNK, 1,5 mg/mL) peut être acheté pour une thrombolyse systémique. Les utilisateurs peuvent préférer d’autres agents lytiques. Les fioles individuelles de 50 mg sont reconstituées avec 50 mL d’eau distillée, puis 2,5 mL sont précisément alicotées en fioles de 3,0 mL. Les aliquotes peuvent être congelées à -20 °C pour une utilisation ultérieure. La stabilité de l’activateur tissulaire recombinant reconstitué stocké à -20 °C est de 60 jours¹¹.

1. Décongelez une aliquote congelée de TNK pour chaque sujet. Dégel à température ambiante pendant environ 15 minutes.
2. Avec une seringue de 1 cc, prélèvez exactement 1,5 mg/kg. Par exemple, un rat de 300 g aura besoin de 0,45 mg.
3. Réanesthésiez l’animal et retirez la fermeture temporaire de la peau.
4. Exposez toute branche de la veine jugulaire externe.
   REMARQUE : La veine caudale pourrait être utilisée si le laboratoire est plus à l’aise avec cette voie. Nous avons préféré utiliser la veine jugulaire car les chirurgiens SPAN sont plus à l’aise avec la mobilisation externe de la veine jugulaire, et cela se fait régulièrement dans notre modèle de filament.
5. À l’aide d’une aiguille de 30 ou 32 G, administrez le TNK par perforation directe dans la veine.
   REMARQUE : Au début, les utilisateurs peuvent vouloir isoler la veine entre 3 et 0 boucles de soie. Avec de la pratique, cela ne sera pas nécessaire.
6. Fermez l’incision avec un prolène 5-0 interrompu ou une autre suture non absorbable.
7. Remet l’animal dans la cage de récupération comme à l’étape 5.14.

7. Méthodes statistiques

1. Pour réaliser des statistiques descriptives, utilisez la moyenne et l’écart-type pour les données numériques normalement distribuées, et utilisez la médiane et l’interquartile pour les données anormalement distribuées. Présentez les données catégorielles sous forme de distributions de fréquence. Pour le test d’hypothèses, appliquer le test t ou ANOVA selon les données paramétriques normalement distribuées ; sinon, ne faites pas de test d’hypothèse.

Résultats

Figure 1 : Prélèvement de sang sur des animaux donneurs et préparation du thrombus. Le sang a été prélevé sur l’animal donneur par cathétérisme de l’artère fémorale et transféré dans un tube microcentrifuge avec (peut être conservé jusqu’à 4 semaines) ou sans EDTA (usage le jour même). Pour préparer le thrombus, une solution de chlorure de calcium a été ajoutée aux tubes sanguins stockés puis immédiatement aspirée dans un cathéter PE-50. Le tube enroulé de PE-50 a été incubé dans une solution physiologique phosphatée préchauffée (PBS) à 37°C pendant 2 heures dans un four de table. Après 2 heures, le tube de PE-50 rempli de sang a été immédiatement transféré à 4°C pour être stocké. Voir la section 1 du protocole pour plus d’informations. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Chargement du thrombus dans le cathéter pour injection. (A) Le jour de l’opération MCAo, un thrombus a été extrudé du tube PE-50 dans une boîte de Petri contenant du PBS. (B) Sur la boîte de Pétri, le thrombus était taillé à environ 6 cm de long à l’aide d’une lame de rasoir. (C) Le thrombus était lavé avec du PBS en le tirant dans un tube PE-50 et en l’expulsant 5 fois, puis 15 fois dans un tube PE-10. (D) Le thrombus a été transféré dans une boîte de Petri contenant une solution concentrée d’Evan’s Blue. (E) Le thrombus a été transféré dans une boîte de Petri contenant une solution d’Evan’s Blue diluée et chargé dans un microcathéter préfabriqué. (F) Le microcathéter a été avancé à travers l’artère carotide interne du rat jusqu’à ce qu’à 16 mm de la pointe du cathéter passe par la bifurcation carotide de l’artère carotide commune et injecté à l’aide d’une pompe à seringue motorisée. Voir la section 2 du protocole pour plus d’informations. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine. 

Dans une étude pilote de faisabilité, nous avons recruté 135 sujets dans 6 laboratoires de recherche. Bien que les sujets aient été randomisés pour l’un des 8 traitements, nous ne rapportons ici que des données agrégées pour illustrer la faisabilité du modèle. Sur 135 sujets inscrits, la TNK a été administrée à la bonne dose et au bon moment chez 132 (98 %). L’IRM a été réalisée 3 jours après TE-MCAo dans 102 (75 %) en raison de la mort d’un animal avant l’échographie dans 33 (24 %). La perte d’animaux avant le 3e jour était constante dans les 6 laboratoires (Tableau 1), indiquant que le modèle peut être déployé sur plusieurs sites. La taille moyenne ± de l’écart des lésions était de 13 ± 16 % (la zone de la lésion inclut l’ischémie et l’œdème en pourcentage de l’hémisphère ipsilatéral), avec une certaine variabilité selon les laboratoires (tableau 2). Des images IRM représentatives et des emboles post-mortem peuvent être consultées dans la Figure supplémentaire 1.

	Laboratoire
Variable	AG	DK	IW	MG	SD	YL
Taille de l’échantillon (N)	23	30	11	28	24	19
IRM réalisée	19	24	9	23	14	13

Tableau 1 : Faisabilité par laboratoire. Les laboratoires d’étude étaient l’Université Augusta (AG), Duke (DK), l’Université de l’Iowa (IW), le Massachusetts General Hospital (MG), l’Université de San Diego (SD) et l’Université Yale (YL). Le nombre d’animaux inscrits (N) et le nombre de survivants pour passer une IRM réalisée le troisième jour après l’AVC sont indiqués. Ces données confirment la faisabilité du modèle.

Site	Taille de l’échantillon (N)	Volume de la lésion ( %) Moyenne ± DS	Indice de quart de milieu ( %) Moyenne ± SD
AG	19	11 ± 14	11 ± 12
DK	24	18 ± 17	19 ± 13
IW	9	08 ± 13	13 ± 12
MG	23	09 ± 11	15 ± 17
SD	13	14 ± 21	19 ± 04
YL	12	18 ± 22	14 ± 15

Tableau 2 : Volume de la lésion observé lors des IRM du jour 3, par site. Pour établir la reproductibilité du modèle sur six sites d’étude, le volume de la lésion (ischémie plus œdème) et le décalage de la ligne médiane ont été comparés. Le volume de la lésion est exprimé en pourcentage areal de l’hémisphère ipsilatéral. Le décalage de la ligne médiane s’exprime comme le pourcentage linéaire de la largeur maximale de l’espace intracrânien. Les données confirment l’hétérogénéité entre les laboratoires.

Figure supplémentaire 1 : Images représentatives. (A-E) Diverses images multi-écho, multi-balayage (MEMS) du cerveau de rat prises 48 heures après TE-MCAo. Les coupes sont d’environ 1 mm antérieures au bregma. (F-J) Plusieurs exemples d’emboles logés à l’origine du MCA. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figurine.

Discussion

Nous avons affiné le modèle de rongeur thromboembolique de l’AVC ischémique pour une utilisation dans un réseau de tests précliniques multi-laboratoires, SPAN. Nous avons considérablement réduit le nombre d’animaux utilisés en développant une méthode pour stocker le sang des donneurs pour une utilisation ultérieure. Nous avons également simplifié la préparation des thromboemboles et l’approche chirurgicale afin de faciliter la réalisation de plusieurs procédures MCAo en une seule journée. Notre intention est que le TE-MCAo atteigne les mêmes niveaux de confort utilisateur et de volume chirurgical que possible avec la version largement utilisée en filament de nylon du MCAo. Pour atteindre ce résultat, nous avons organisé deux ateliers de formation en présentiel, et tous les chirurgiens impliqués dans cette étude avaient déjà plusieurs mois, voire des années, d’expérience avec le modèle à filament plus standard. Nous avons démontré la faisabilité dans six laboratoires de recherche différents et avons démontré une excellente adhésion aux protocoles.

Lors du choix de mettre en œuvre ce protocole, un enquêteur doit prendre en compte les éléments suivants qui déterminent le succès du protocole. Premièrement, un soin scrupuleux lors de la collecte de sang influencera la formation réussie du thrombus. Le sang artériel, non veineux, doit être prélevé pour éviter une coagulation prématurée. Deuxièmement, il est important de prélever plus de sang que nécessaire. Parfois, un spécimen ne parvient pas à thromboser pendant la nuit, tandis que les autres oui. Troisièmement, nous recommandons fortement que le chargement du cathéter soit effectué à l’aide d’un grossissement optique, soit avec des loupes chirurgicales avec lampe frontale, soit une lentille louppante avec éclairage. Quatrièmement, une dissection prudente et attentive des ACC, ACI et ECA est essentielle pour éviter les déchirures et la thrombose intravasculaire. Il est également essentiel de visualiser le PPA pour s’assurer que le cathéter d’administration entre correctement dans l’ACI. Cinquièmement, il est rare de constater un effet indésirable chez les rongeurs dû à l’injection de thrombolytiques. Dans nos études, nous n’avons observé aucun effet indésirable, comme un angiō-œdème ou un saignement périphérique, après l’injection de TNK. Cela ne dis-le pas pour dire que ce n’est pas possible, mais nous ne sommes pas au courant d’effets secondaires systémiques des thrombolytiques chez les rongeurs. Un enquêteur choisissant de mettre en œuvre ce protocole pour la première fois pourrait bien être conseillé de consulter l’un des chercheurs nommés comme co-auteur ici, car nous avons trouvé que l’instruction personnalisée est très utile.

Lors du choix d’un modèle de maladie animale pour tester des thérapies candidates, il est important de représenter fidèlement la population de patients que le médicament est destiné à traiter. Les modèles focales de l’AVC ischémique incluent les modèles photothrombotiques de Rose Bengal, l’occlusion de l’artère piale corticale, et l’injection stéréotaxique d’endothéline-1 13,14,15. Ces modèles ont l’avantage de créer des lésions hautement reproductibles dans des zones prévisibles du cortex. Cet avantage les rend préférables dans les études des mécanismes cellulaires ou en corrélant la localisation des lésions aux résultats comportementaux. Le coût supplémentaire, la complexité et l’absence de composante de reperfusion les rendent moins utiles pour le dépistage de drogues.

Les MCAo avec monofilament intraluminal ou thromboembolie sont les modèles établis de choix pour l’occlusion des grands vaisseaux (LVO⁾10,16,17. Le modèle monofilament recouvert de silicium est simple à réaliser et largement utilisé. Bien que l’emplacement et la taille de la lésion soient moins prévisibles, dans les tests de dépistage à grande échelle, cette hétérogénéité est considérée comme un avantage car les AVC chez l’humain sont également assez hétérogènes^18,19. Un inconvénient de la méthode monofilament est que l’occlusion est biologiquement inerte. Chez les patients, les thrombes et la thrombolyse produisent une cascade inflammatoire associée à la libération de thrombine, plasminogène et d’autres éléments^{du thrombus} 20,21,22. Pour surmonter cette limitation, beaucoup ont proposé des modèles de thromboembolie dans les études sur les lapins, porcins, canines et primates^{non humains 23,24,25,26,27}. Ces études sont complexes et nécessitent une expertise spécialisée en général. Néanmoins, nous avons cherché à adapter le modèle thromboembolique pour notre réseau de tests précliniques multi-laboratoires. Cela a nécessité de simplifier la préparation des thromboembolies, de rationaliser l’approche chirurgicale et de réduire significativement le nombre d’animaux nécessaires. Nous avons conçu un modèle thromboembolique, le TE-MCAo, qui pouvait être déployé avec succès dans six laboratoires différents avec une excellente adhésion au protocole (Tableau 1) et une taille de lésione raisonnablement constante (Tableau 2). Le débit était suffisant, avec une moyenne de 6 matières par semaine.

Il existe plusieurs étapes de dépannage qui peuvent s’avérer utiles. L’absence de thrombose sanguine est la cause la plus fréquente d’échec du protocole et est le plus souvent due à une contamination du cathéter de préparation par de l’EDTA ou de l’héparine si elle est placée sur la table chirurgicale. Nous recommandons une technique de collecte scrupuleuse. Nous recommandons également de préparer la solution de chlorure de calcium utilisée pour inactiver l’EDTA fraîchement chaque semaine ou toutes les deux semaines. Après avoir élué le thrombus du cathéter de préparation, il peut être difficile de découper le thrombus en les fragments de 5 cm requis. Certains thrombes sont fragiles et se fracturent facilement. Nous recommandons de préparer les caillots avec un grossissement optique et, dans les cas extrêmes, de passer à un autre thrombus donneur. Les thrombes aspirants et éluants nécessitent un niveau modéré de compétence ; C’est pourquoi nous recommandons une période d’entraînement assez longue. Assurez-vous que la pointe du cathéter à aspiration est exempte de blocages grâce à un grossissement optique. Les thrombes peuvent être enfermés dans le cathéter d’implantation – nous recommandons une alternance douce d’avant et de retour entre aspiration et élution. Pour les chirurgiens expérimentés avec le modèle typique de filament MCAo, l’identification du PPA peut être une nouvelle étape. Nous recommandons vivement d’étiqueter le thrombi avec le bleu d’Evan, afin que le cathéter puisse être tracé et suivi lors de sa montée à travers l’ACI. La bifurcation de l’ACI/PPA peut être facilement localisée par une dissection soigneuse et profonde en suivant l’ACI, et est localisée de manière fiable jusqu’à une branche fine du nerf carotidien interne.

Ce protocole présente certaines limitations. Il faut un élément de compétence chirurgicale pour effectuer la canulation des artères carotides des rongeurs. Cependant, cela est tout aussi vrai pour le modèle à filament. La manipulation du thrombi sanguin nécessite également une habileté chirurgicale. Comme pour tous les modèles thromboemboliques, le taux d’infarctus réussi est plus faible que le modèle filamenteux. Si l’objectif de l’enquête est d’avoir des incidents d’infarctus plus fréquents, le modèle filament serait préférable. En revanche, si l’objectif est la réplique du thrombus et de la thrombolyse, alors ce modèle est souhaitable.

Ce modèle est destiné à tester les candidats protecteurs cérébraux en utilisant un modèle qui utilise fidèlement le thrombus et la thrombolyse. Les orientations futures pourraient également inclure des études sur la thérapie adjuvante ciblant le phénomène de non-reflux. Beaucoup ont proposé des anticoagulants et des agents antiplaquettaires à cette fin.

En conclusion, le protocole TE-MCAo présenté ici est adapté pour permettre le déploiement dans plusieurs laboratoires. Nous avons simplifié la préparation des thrombes et simplifié l’approche chirurgicale. Nous avons mis au point une méthode pour stocker le sang des donneurs, réduisant significativement le nombre d’animaux nécessaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1 ml de seringue	BD	309628
Loupes 10x
Seringue de 1 cc	Terumo	SS-01T
Aiguille émoussée de 23g	Grainger	5FVK7
Seringue de 3,0 cc	BD	309656
Ligature en soie 3-0
Aiguille 30g	BD	305128
Suture prolène 5-0	Ethicon	8698	Pour fermer la coupe de peau
Ligature en soie 5-0	Ethicon	A182
Pince pour anévrisme
Sulfate d’atropine	Vet One	NDC86136-006-10	Réduire les sécrétions bronchiques
Pinces à rainures émoussées
Bupivacaïne	Xelia Pharmaceuticals	NDC70594-118-01	Anesthésies locales
Chlorure de calcium	Sigma	C7902
Carprofène	Zoetis Inc	NADA #141-199	Analgésique
Tubes centrifugeuses	Eppendorf	22364111	Pour la collecte de sang
Éthanol	Koptec	UN1170
Evan' s Bleu	Sigma	E2129
Bouillotte	Appareil de Harvard	K021-435
Pince hémostatique
Isoflurane	Vet One	NDC13985-528-60
Boucles de tissage ultimes Made By Me	Groupes horizon	Non applicable	Attaches souples
Microciseaux	F.S.T.	15000-00
Microcathéters	Doccol Corporation	PE-FL-360-200-300	Cathéters d’injection préfabriqués
Cathéter PE-10	BD	427401
Tuyau PE-100	Intramédic	7426
Tubulure PE-50	BD	427410
Tubes EDTA pédiatriques	BD Microtainer	K2E-363706	Stocker le sang des donneurs
Boîte de Petri	Eppendorf	30702115
Solution physiologice tamponnée au phosphate	Fisher	B2438
Avant-goûts	PDI Inc.	NDC10189-1080-1	Antiseptique
Coton	VWR	89031-288
Lame de rasoir	AccuTec Pro	71960
Solution saline	Hospira, Inc.	NDC 0409-4888-02
Ciseaux	F.S.T.	14958-11
Pinces aiguës
Pompe à seringue	New Era Pumps Inc.	BS-300
Four de table	Boekel	132000
Tenecteplase (TNK)	Genentech, San Francisco	NDC50242-120-47	Thrombolyse
Plaquet d’oreille	RapID Lab, San Francisco, CA & nbsp ;	RapID Tags