In vivo Ca ^{2 +} - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant l'apprentissage olfactif dans le Honey Bee

Les abeilles peuvent être conditionnés dans un paradigme d'apprentissage olfactif appétitif (PER-conditionné). L'utilisation des odeurs comme stimuli, nous avons établi une méthode dans laquelle le comportement est enregistré pendant l'imagerie calcique simultanée est utilisée pour mesurer l'activité d'odeur évoquée dans les neurones du corps de champignons

Cette procédure commence par la fixation de l’abeille dans une chambre d’enregistrement. Un morceau de cuticule est retiré de la capsule céphalique pour colorer des structures sélectionnées dans le cerveau. Les signaux calciques dans les neurones colorés sont enregistrés in vivo à l’aide d’un dispositif d’imagerie à large champ.

Pendant l’imagerie, l’abeille peut être stimulée par des odeurs ou du saccharose envoyé à l’antenne. De cette façon, l’abeille peut être conditionnée à étendre la trompe en réponse à une odeur. La réponse d’extension du proboscis est surveillée à l’aide d’enregistrements d’électromyogrammes du muscle M 17.

Après l’expérience d’imagerie, le cerveau est disséqué pour une étude plus approfondie des structures colorées à l’aide d’un microscope confocal. Bonjour, je suis Melanie du Lab de rdo Mansel. Bonjour, je m’appelle Anya et je travaille également au Mansel Lab.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie calcique in vivo et le corps du champignon d’abeille. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le codage olfactif et l’apprentissage de la plasticité associée dans le cerveau de l’abeille. Alors commençons.

Commencez par attraper une butineuse d’abeilles à l’entrée de la ruche, puis immobilisez-la en la refroidissant sur de la glace. Ensuite, montez l’abeille sur une chambre d’enregistrement en plexiglas. Utilisez de la cire dure à bas point de fusion pour fixer les yeux et le thorax sur le mur.

Tous cassent un capillaire de verre à l’extrémité pour obtenir un diamètre de 10 microns. Recouvrez l’extrémité du capillaire avec de la pâte d composée d’un mélange de 10 à un d’URA, de deux dextrine et de dextrine Rodin fixable. Le capillaire préparé sera utilisé pour la coloration.

Pour commencer la procédure de coloration, immobilisez d’abord les antennes avec un koane. Ouvrez la capsule céphalique au-dessus du cerveau en retirant un morceau de cuticule et en poussant les glandes et la trachée sur les côtés, permettant ainsi d’accéder au corps du champignon. Utilisez une feuille de papier pour absorber la lymphe hémologique à l’intérieur de la capsule cérébrale.

Pour colorer les neurones du corps du champignon, injectez le capillaire dans le soma ou la région dendritique des neurones. Restaurez ensuite la cuticule sur la capsule céphalique et desserrez l’antenne. Enfin, nourrissez l’abeille avec une solution à 30 % de saccharose et conservez-la dans une boîte en polystyrène recouverte d’un torchon humide pendant au moins quatre heures ou toute la nuit à 20 degrés Celsius.

Une fois la préparation B terminée, nous pouvons commencer l’imagerie in vivo. Pour commencer, utilisez une éponge fixée à la chambre d’enregistrement pour empêcher l’abeille de se déplacer et de la presser contre l’abdomen. Fixez maintenant les antennes de l’abeille avec un ioane pour empêcher le cerveau de bouger en raison du pompage de l’œsophage.

Faites une petite incision dans la cuticule au-dessus du labrum et retirez soigneusement l’œsophage et ses structures solides environnantes et couvrez-les de silicone à deux composants. Ensuite, utilisez une aiguille pour faire des trous pour l’insertion de fils-électrodes utilisés pour enregistrer les électrogrammes du muscle rapporteur du labium. Retirez le morceau de cuticule, la trachée et les glandes au-dessus du cerveau.

Utilisez une feuille de papier pour absorber l’hémogramme à l’intérieur de la capsule céphalique afin d’enregistrer les électrogrammes de M 17. Injectez un fil de cuivre dans le muscle près des pièces buccales. Injectez une électrode de terre dans l’œil.

Remplissez maintenant la capsule frontale avec du silicone à deux composants. Assurez-vous que le cerveau est complètement couvert. Placez l’abeille sur la platine du microscope et placez une goutte d’eau à la surface du silicone.

Immergez l’objectif de trempage du microscope dans la gouttelette, puis concentrez-vous sur les neurones de la scène. La préparation de l’imagerie in vivo étant terminée, nous pouvons maintenant décrire la stimulation olfactive et l’enregistrement des signaux. Pour fournir des stimuli olfactifs à l’abeille, nous utilisons un olfactomètre personnalisé contrôlé par ordinateur pour diluer les odorants dans un flux d’air constant.

Dirigée vers l’antenne, la stimulation des odeurs consiste en une impulsion de trois secondes d’air saturé d’odeurs. Pour l’imagerie calcique, nous utilisons un dispositif d’imagerie photonique til monté sur un microscope fluorescent zes pour enregistrer des images à température ambiante avec une fréquence d’échantillonnage de cinq hertz. Les signaux calciques sont enregistrés à travers un objectif dip Olympus X 60 0,9 W avec caméra CCD Ango, chaque mesure dure 10 secondes.

Les potentiels musculaires sont amplifiés à l’aide d’un amplificateur d’herbe, puis enregistrés et numérisés à l’aide d’un convertisseur numérique analogique. Les enregistrements de M 17 sont utilisés pour suivre les réponses comportementales liées à l’apprentissage l’enregistrement du signal terminé, nous pouvons maintenant passer à l’analyse morphologique et à la reconstruction. Parce que les deux colorants utilisés lors du remblayage ont le même poids moléculaire.

Ils sont co-localisés dans les neurones. L’imagerie à grand champ a une résolution spatiale limitée, c’est pourquoi nous utilisons la microscopie confocale à balayage pour étudier les structures colorées. Après l’expérience, disséquez d’abord le cerveau et fixez-le pendant la nuit dans du formaldéhyde à 4 % à quatre degrés Celsius le lendemain, rincez-le dans du PBS puis déshydratez-le dans de l’éthanol par étapes 10 minutes à 50%70%90%99 % et deux fois 10 minutes à 100 %Placez le cerveau sur une lame d’objet rainurée avec une goutte de couverture de salicylate de méthyle, Glissez-le puis placez-le sur la platine d’un microscope confocal à balayage.

Scannez le cerveau avec un objectif aérien et un zoom numérique de 1,1 à 1,2 à quatre sections optiques micrométriques. Ici, nous voyons la réponse des neurones extrinsèques du corps du champignon à la stimulation olfactive des antennes enregistrée à travers un objectif de 60 x et visualisée en fausses couleurs. Le carré rouge à gauche représente la persistance du stimulus olfactif.

Après l’expérience, le cerveau est disséqué et les structures de coloration sont étudiées plus en détail à l’aide d’un microscope confocal à un grossissement de 20 x. Nous venons donc de vous montrer comment imager les neurones du corps des champignons chez l’abeille pendant l’apprentissage olfactif. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les expériences impliquant des colorants sensibles à la lumière doivent être effectuées dans l’obscurité.

Donc c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences. Bye bye.