Name: In vivo Ca 2 + - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant lapprentissage olfactif dans le Honey Bee (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Découvrez l'imagerie calcique in vivo des neurones des corps champignons chez l'abeille pendant l'apprentissage olfactif. Cette méthode permet d'étudier l'activité neuronale en temps réel et les mécanismes de la mémoire.

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Préparation d&#39;abeille et de remblayage <ol><li> Catch abeilles butineuses à la ruche et le froid sur la glace pour l&#39;immobilisation. </li><li> Mont d&#39;enregistrement en plexiglas chambres 3. Fixer les yeux et le thorax pour les murs de la chambre d&#39;enregistrement avec de la cire à point de fusion bas dur. </li><li> Tirez capillaires en verre que couramment utilisées pour l&#39;électrophysiologie et de pause à la pointe pour obtenir un diamètre de l&#39;extrémité de ca. 10 microns. Couvrir la pointe du capillaire avec de la pâte de teinture. Pâte colorante se compose d&#39;un mélange 10:01 de Fura-2 dextrane et lysine fixable tétraméthylrhodamine dextrane. </li><li> Pour la procédure de coloration immobiliser antennes avec minutie ou n-eicosane. Supprimer un morceau de la cuticule au-dessus du cerveau et des glandes et de la trachée pousser sur le côté pour permettre l&#39;accès au corps des champignons. </li><li> Injecter capillaires soit dans le soma ou région axonales des neurones du corps de champignons. Cela peut être fait main libre ou en utilisant un manipulateur micro. Puis restaurer morceau cuticule sur la capsule céphalique et desserrer antennes. </li><li> Nourrir les abeilles avec une solution de saccharose à 30% avant de les stocker dans une affaire humidifié pendant au moins quatre heures ou une nuit à 20 ° C. </li></ol> L&#39;imagerie in vivo <ol><li> Empêcher les mouvements de l&#39;ex abeille avec un petit morceau d&#39;éponge qui est pressée contre le ventre et fixe avec un clip ou une bande à la chambre d&#39;enregistrement. </li><li> Pour empêcher le mouvement du cerveau résultant du pompage de l&#39;œsophage, couper une petite incision dans la cuticule au-dessus du labrum et tirez soigneusement l&#39;œsophage et de ses environs des structures solides pour le mettre sous tension, sans endommager l&#39;œsophage 4. Couvrir avec deux de silicone composant. </li><li> Faire des trous avec une aiguille et insérez électrodes en fil pour l&#39;enregistrement de M17. </li><li> Retirer morceau cuticule, la trachée et des glandes au-dessus du cerveau. Suce heamolymph intérieur de la capsule tête avec un morceau de papier. </li><li> Remplissez la capsule céphalique avec deux de silicone composant. Il est important que le cerveau est complètement couvert. </li><li> Abeilles lieu sur scène microscope et placer une goutte d&#39;eau sur la surface de la silicone, de plonger l&#39;objectif du microscope trempette dans la gouttelette. Focus sur les neurones colorés. </li></ol> Odeur et la stimulation d&#39;enregistrement des signaux Olfactomètre: Nous utilisons un ordinateur contrôlé, la stimulation périphérique personnalisé construit ou «olfactomètre» comme décrit précédemment par Galizia et Vetter 3. Les odeurs sont diluées dans un flux d&#39;air constant orienté vers les antennes. Toute relance se compose d&#39;une impulsion de l&#39;odeur de l&#39;air l&#39;odeur 3s 0.2ml saturé. Le protocole de stimulation peut être réglé dans le TILLVision logiciel d&#39;enregistrement. Microscope et imagerie mis en place: Nous utilisons un microscope à fluorescence Zeiss. Les images sont enregistrées à 25 ° C avec un taux d&#39;échantillonnage de 5 Hz en utilisant un dispositif d&#39;imagerie photonique TILL-monté sur le microscope. Signaux calciques sont enregistrées grâce à un X60, Olympus 0,9 W DIP objectif avec une caméra CCD Imago (640x480 pixels, 4X binned sur puce à 160x120 pixels). Fura-2 est excité par une lumière monochromatique de longueur d&#39;onde 340 et 380nm pour les mesures ratiométrique. La fluorescence est détectée à travers un miroir dichroïque 410 nm et un filtre passe 440 nm de long. Les paramètres pour l&#39;enregistrement sont définis dans le logiciel d&#39;enregistrement. Chaque mesure dure 10s et le temps d&#39;exposition pour les deux longueurs d&#39;onde peut être ajustée à l&#39;intensité de coloration dans chaque préparation. M17 enregistrement: Le muscle rapporteur du labium (M17) est enregistrée de façon extracellulaire de surveiller les réponses comportementales liées à l&#39;apprentissage, c&#39;est à dire le 5 p., 6. Injecter un fil de cuivre dans le muscle près de la bouche de pièces. Injecter électrode de masse dans l&#39;œil. Les potentiels musculaires sont amplifiés avec une version personnalisée de pré-amplificateur, numérisés et stockés sur un ordinateur. Le début du stimulus est déclenchée par l&#39;olfactomètre. Analyse des données <ol><li> Pendant l&#39;expérience: Les enregistrements du signal de calcium sont introduits dans un ordinateur et stockées. Le logiciel d&#39;enregistrement TILLVision permet une inspection initiale des signaux, comme le calcul du rapport entre les longueurs d&#39;onde (340nm/380nm) et le calcul des deltaF (soustraction de base). </li><li> Traitement de l&#39;image est réalisée avec la coutume des programmes écrits en langage IDL. Calculer le ratio de Ca 2 + signaux de 340nm et 380nm mesures pour chaque pixel. Déterminer fond de fluorescence (F) en moyenne plus de cadres avant le stimulus et soustraire au signal ratiométrique (deltaF). </li><li> Pour définir la région d&#39;intérêt (ROI): Calculer moyenne des cadres lors de la relance et appliquer un filtre passe-bas (3X3px). Convertir une échelle de gris à l&#39;échelle de couleurs fausses. Déterminer l&#39;activité dans les structures neuronales comme des taches d&#39;activité dans les images en fausses couleurs et de définir comme un retour sur investissement. </li><li> Calculer la dynamique temporelle des régions actives en faisant la moyenne des pixels dans la ROI sur toutes les trames sans aucun filtrage ou de correction. </li></ol> En collaboration avec le dextrane Fura-2, nous remplissons les neurones avec le colorant rhodamine fixable dextrane (&quot;mini-ruby&quot;). Les deux colorants ont le même poids moléculaire, ils doivent être co-localisés dans les neurones. Imagerie à grand champ ne permet que la résolution spatiale très limitée, il est donc recommandé d&#39;étudier les structures tachés après l&#39;expérience en utilisant la microscopie confocale à balayage. <ol><li> Après les mesures physiologiques, disséquer les cerveaux et les fixer. </li><li> Rincer avec du PBS et déshydrater par étapes dans l&#39;éthanol et le salicylate de méthyle dans les claires. </li><li> Pour la microscopie confocale intégrer cerveau en salicylate de méthyle. </li><li> Nous utilisons un Leica TCS SP2 microscope. Longueur d&#39;onde d&#39;excitation est 543nm. </li><li> Nous scannons le cerveau avec un air ou un objectif à immersion et de comparer les structures colorées avec les données d&#39;imagerie. </li></ol> Les résultats représentatifs: Si la coloration et la préparation a été réussie, le signal à l&#39;échelle de fausses couleurs, par exemple dans le corps du lobe des champignons neurones alpha extrinsèques, pourrait ressembler à la figure 1. La réponse comportementale (PER) peut être calculée comme la fréquence pic lors de la relance moins fréquence pic avant le stimulus (figure 2). Les structures tachés peuvent être étudiés plus en détail à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal (figure 3). <img src="/files/ftp_upload/1353/figure1_new.png" alt="Figure 1" /> Figure 1: Représentant des signaux d&#39;imagerie calcique (stimulation avec heptanal). A: région imagée du cerveau d&#39;abeille. B: Raw image fluorescente comme vu à travers un objectif à immersion X20 longueur d&#39;onde d&#39;excitation 380nm, l&#39;alpha-lobe du corps champignon est décrite en violet. Dye a été injecté dans la jante ventro-latérale des lobes alpha-tacher neurones extrinsèques. C: l&#39;image en fausses couleurs à partir du signal moyenne, deltaF (340/380), lors de la relance trois secondes; alpha du lobe décrites en violet, sélectionnés ROI bordées de noir. D: Dynamique temporelle du signal calcique en réponse à la stimulation d&#39;odeurs, de signal moyen de la région d&#39;intérêt, comme indiqué dans C. E: Dynamique temporelle du signal calcique en réponse à la stimulation de saccharose de l&#39;IPSI et contra-latérale antenne respectivement à la RSI indiquée en C. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure2_new.png" alt="" /> Figure 2: Représentant M17 réponse. Après conditionnement olfactif de l&#39;abeille s&#39;étend la trompe lorsque l&#39;odeur est présenté sans récompense. La ligne rouge indique relance odeur. En médaillon: PER de l&#39;abeille. <img src="/files/ftp_upload/1353/figure3_new.png" alt="" /> Figure 3: la pile d&#39;images représentant. Après l&#39;expérience d&#39;imagerie du cerveau a été disséqué. Le neurone de la figure 1 est scanné à l&#39;aide d&#39;un microscope confocal avec un objectif X20 immersion dans l&#39;huile, l&#39;alpha-lobe décrites en violet.

<ol><li>Joerges, J., Küttner, A., Galizia, C. G., Menzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Representations+of+odors+and+odor+mixtures+visualized+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Representations of odors and odor mixtures visualized in the honeybee brain.</a> Nature. 387 (6630), 285-288 (1997).</li>
<li>Rehder, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+the+honeybee%27s+proboscis+reflex+by+electromyiographic+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantification of the honeybee's proboscis reflex by electromyiographic recordings.</a> J. Insect Physiol. 33, 501-507 (1987).</li>
<li>Galizia, C. G., Vetter, R. S. Optical Methods for Analyzing Odor-Evoked Activity in the Insect Brain. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGalizia%2C+CG+%22Methods+in+Insect+Sensory+Neuroscience%22">Methods in Insect Sensory Neuroscience</a>. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 345-388 (2004).</li>
<li>Mauelshagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+correlates+of+olfactory+learning+paradigms+in+an+identified+neuron+in+the+honeybee+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Neural correlates of olfactory learning paradigms in an identified neuron in the honeybee brain.</a> J Neurophysiol. 69 (2), 609-625 (1993).</li>
<li>Kuwabara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bildung+des+bedingten+Reflexes+von+Pavlovs+Typus+bei+der+Honigbiene+Apis+mellifica%2C+Hokaido+Univ%5BTitle%5D)+AND+%22Zool.+J.+Sci%22%5BJournal%5D)">Bildung des bedingten Reflexes von Pavlovs Typus bei der Honigbiene Apis mellifica, Hokaido Univ.</a> Zool. J. Sci. 13, 458-464 (1957).</li>
<li>Bitterman, M. E., Menzel, R., Fietz, A., Schafer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+conditioning+of+proboscis+extension+in+honeybees+%28Apis+mellifera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Psychology%22%5BJournal%5D)">Classical conditioning of proboscis extension in honeybees (Apis mellifera.</a> Journal of Comparative Psychology. 97 (2), 107-119 (1983).</li>
</ol>

Dans cette présentation, nous avons traversé toutes les mesures nécessaires pour enquêter dans les signaux calciques in vivo chez l&#39;abeille. Nous avons appliqué cette technique à des neurones du corps de champignons, mais l&#39;imagerie peut être effectuée sur tous les neurones pour lesquels une technique de coloration peut être établie. Nous nous sommes concentrés sur les neurones de la voie olfactive de l&#39;abeille. Les expériences sont toutes effectuées dans une chambre noire. La mise en place...

<table><tbody><tr><td>cire dure à bas point de fusion Deiberit 502</td><td>Dr. B&amp;#246;hme Sch&amp;#246;ps Dental GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FURA-2 dextran, sel de potassium, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>F-3029</td><td>Protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>dextran tétraméthylrhodamine, 10 000 MW</td><td>Invitrogen</td><td>D-3312</td><td>Protéger de la lumière.</td></tr><tr><td>n-eicosane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21, 927-4</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif Kwik Sil</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>KWIK SIL</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d'imagerie</td><td>TILL Photonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>caméra CCD</td><td>Imago</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CED</td><td>Texas Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo ca 2 + - imagerie des neurones du corps champignons pendant l&#39;apprentissage olfactif dans le honey bee

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

L&#39;in vivo et semi-en préparation pour l&#39;imagerie in vivo de calcium a été développé dans notre laboratoire par Joerges, Kuttner et Galizia il ya dix ans, pour mesurer l&#39;activité d&#39;odeur évoquée dans le lobe antennaire 1. Dès lors, il a été constamment affiné et appliqué à neuropiles différents dans le cerveau de l&#39;abeille. Ici, nous décrivons la préparation actuellement utilisés dans le laboratoire pour mesurer l&#39;activité des neurones du corps en utilisant un champignon couplé dextrane sensible au calcium colorant (Fura-2). Nous rétrograde tache neurones du corps de champignons en injectant un colorant dans leurs axones ou région soma. Nous nous concentrons sur la réduction de l&#39;envahissement, de réaliser une préparation dans laquelle il est encore possible de former l&#39;abeille en utilisant PER conditionné. Nous sommes en mesure de surveiller et de quantifier la réponse comportementale par l&#39;enregistrement électro-myograms du muscle qui contrôle le PER (M17) 2. Après l&#39;expérience des structures imagées physiologiques sont étudiés plus en détail en utilisant la microscopie confocale à balayage à l&#39;adresse de l&#39;identité des neurones.

Les abeilles peuvent être conditionnés dans un paradigme d&#39;apprentissage olfactif appétitif (PER-conditionné). L&#39;utilisation des odeurs comme stimuli, nous avons établi une méthode dans laquelle le comportement est enregistré pendant l&#39;imagerie calcique simultanée est utilisée pour mesurer l&#39;activité d&#39;odeur évoquée dans les neurones du corps de champignons<em&gt; In vivo</em&gt;.

In vivo Ca 2 + - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant l&#39;apprentissage olfactif dans le Honey Bee

La préparation in vivo et semi-in vivo pour l'imagerie calcique a été développée dans notre laboratoire par Joerges, Küttner et Galizia il y a plus de dix ans, afin de ...

Cette procédure commence par la fixation de l'abeille dans une chambre d'enregistrement. Un fragment de cuticule est retiré de la capsule céphalique afin de colorer certaines structures cérébrales. Les signaux calciques dans les neurones colorés sont enregistrés in vivo à l'aide d'un dispositif d'imagerie à large champ.Pendant l'imagerie, l'abeille peut être stimulée par des odeurs ou par l'administration de saccharose sur l'antenne. Ainsi, on peut conditionner l'abeille à étendre le proboscis en réponse à une odeur. La réponse d'extension du proboscis est surveillée à l'aide d'enregistrements électromyogrammes provenant du muscle M 17.Après l'expérience d'imagerie, le cerveau est disséqué pour examiner plus en détail les structures marquées à l'aide d'un microscope confocal. Bonjour, je suis Melanie du laboratoire de rdo Mansel. Bonjour, je suis Anya, également du laboratoire Mansel.Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie calcique in vivo et du corps en champignon de l'abeille. Nous utilisons cette procédure dans notre laboratoire pour étudier le codage olfactif et la plasticité liée à l'apprentissage dans le cerveau de l'abeille. Commençons donc.Commencez par capturer une butineuse d'abeille à l'entrée de la ruche, puis immobilisez-la en la refroidissant sur de la glace. Ensuite, fixez l'abeille sur une chambre d'enregistrement en plexiglas. Utilisez de la cire dure à point de fusion bas pour fixer les yeux et le thorax sur la paroi.Cassez une capillaire en verre à l'extrémité afin d'obtenir un diamètre de 10 microns. Recouvrez l'extrémité de la capillaire avec une pâte d constituée d'un mélange de dextrine URA deux et de dextrine fixable dans un rapport de 10 à 1. La capillaire préparée sera utilisée pour la coloration.Pour commencer la procédure de coloration, immobilisez d'abord les antennes à l’aide d’un koane. Ouvrez la capsule céphalique au-dessus du cerveau en retirant un fragment de cuticule et en déplaçant les glandes et la trachée sur les côtés, afin d’accéder au corps pédonculé. Utilisez un morceau de papier pour absorber l’hémolymphe à l’intérieur de la capsule céphalique.Pour colorer les neurones du corps mushroom, injecter le capillaire dans la région somatique ou dendritique des neurones. Ensuite, remettre en place le morceau de cuticule sur la capsule céphalique et desserrer l'antenne. Enfin, nourrir l'abeille avec une solution de saccharose à 30 % et la conserver dans une boîte en polystyrène recouverte d'un torchon humide pendant au moins quatre heures ou toute la nuit à 20 degrés Celsius.Une fois la préparation B terminée, nous pouvons commencer l'imagerie in vivo. Pour commencer, utilisez une éponge fixée à la chambre d'enregistrement afin d'empêcher l'abeille de bouger, en l'appuyant contre l'abdomen. Fixez maintenant les antennes de l'abeille avec un ioane pour éviter que le cerveau ne bouge à cause du pompage de l'œsophage.Faites une petite incision dans la cuticule au-dessus du labre et retirez délicatement l'œsophage ainsi que les structures solides environnantes, puis recouvrez-les de silicone bi-composant. Ensuite, utilisez une aiguille pour percer des trous destinés à l'insertion d'électrodes filaires permettant l'enregistrement d'électrogrammes du muscle protracteur du labium. Retirez le fragment de cuticule, les trachées et les glandes situés au-dessus du cerveau.Utilisez un morceau de papier pour absorber l'hémolymphe à l'intérieur de la capsule céphalique afin d'enregistrer des électrogrammes à partir du M 17. Injectez un fil de cuivre dans le muscle proche des pièces buccales. Insérez une électrode de référence dans l'œil.Remplissez maintenant la capsule céphalique avec du silicone bi-composant. Veillez à ce que le cerveau soit entièrement recouvert. Placez l'abeille sur la platine du microscope et déposez une goutte d'eau sur la surface du silicone.Immergez l'objectif à immersion du microscope dans la goutte, puis mettez au point les neurones de la préparation. Une fois la préparation pour l'imagerie in vivo terminée, nous pouvons maintenant décrire la stimulation olfactive et l'enregistrement du signal. Pour délivrer des stimuli odorants à l'abeille, nous utilisons un olfactomètre sur mesure commandé par ordinateur afin de diluer les odorants dans un flux d'air constant.La stimulation dirigée de l'antenne par les odeurs consiste en une impulsion de trois secondes d'air saturé en odeur. Pour l'imagerie calcique, nous utilisons un dispositif d'imagerie à photons multiples monté sur un microscope fluorescent ZES afin d'enregistrer des images à température ambiante avec une fréquence d'échantillonnage de cinq hertz. Les signaux calciques sont enregistrés à l'aide d'un objectif Olympus X 60 0,9 W en immersion dans l'eau et d'une caméra CCD Ango ; chaque mesure dure 10 secondes.Les potentiels musculaires sont amplifiés à l'aide d'un amplificateur Grass et enregistrés ainsi que numérisés à l'aide d'un convertisseur analogique-numérique. Les enregistrements provenant de M 17 sont utilisés pour surveiller les réponses comportementales liées à l'apprentissage. L'enregistrement des signaux étant terminé, nous pouvons désormais passer à l'analyse morphologique et à la reconstruction. Étant donné que les deux colorants utilisés lors du remplissage rétrograde ont le même poids moléculaire.Ils sont co-localisés dans les neurones. L'imagerie en champ large possède une résolution spatiale limitée, nous utilisons donc la microscopie à balayage confocal pour étudier les structures marquées. Après l'expérience, commencez par disséquer le cerveau et fixez-le toute la nuit dans du formaldéhyde 4 % à quatre degrés Celsius. Le lendemain, rincez-le dans du PBS, puis déshydratez-le dans des bains d'éthanol : 10 minutes à 50 %, 70 %, 90 %, 99 %, puis deux fois 10 minutes à 100 %. Placez le cerveau sur une lame porte-objet cannelée avec une goutte de salicylate de méthyle, posez un couvre-objet, puis installez-la sur la platine du microscope à balayage confocal.Scannez le cerveau avec un objectif à air et un zoom numérique de 1,1 à 1,2 par sections optiques de quatre micromètres. Ici, nous observons la réponse des neurones extrinsèques du corps en crochets à une stimulation olfactive des antennes, enregistrée à l’aide d’un objectif 60 x et visualisée en fausses couleurs. Le carré rouge à gauche représente la persistance du stimulus odorant.Après l'expérience, le cerveau est disséqué et les structures colorées sont examinées plus en détail à l'aide d'un microscope confocal avec un grossissement de 20 x. Nous venons donc de vous montrer comment imager les neurones du corps pédonculé de l'abeille lors d'un apprentissage olfactif. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler que les expériences impliquant des colorants sensibles à la lumière doivent être réalisées à l'obscurité.Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences. Au revoir.

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