Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

Dans cette présentation, nous présenterons un système de perfusion des paupières basé sur la microfluidique pour la mesure simultanée de la sécrétion dynamique d’insuline, de l’afflux de calcium et des changements de potentiel mitochondrial des œillets pancréatiques en réponse aux chiens sécrétants d’insuline. Le système de perfusion est composé d’un dispositif microfluidique à trois couches, de pousse-seringues et d’un collecteur d’insuline à fraction. L’afflux de calcium induit par les sécrétagogues et les potentiels mitochondriaux sont imagés à l’aide d’un microscope fluorescent.

Bonjour, je m’appelle Ola, une Waller du laboratoire du Dr Val Holter au Département de chirurgie de transplantation de l’Université de l’Illinois à Chicago. Bonjour, je m’appelle Don Lee, je suis également du laboratoire d’octobre. Bonjour, je m’appelle Tricia Hart, je suis également du laboratoire de Dr.Al Holster.

Aujourd’hui, nous allons vous montrer une procédure d’imagerie simultanée des paupières à l’aide d’un gradient de glucose linéaire. Nous avons utilisé cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les visuels et la fonction des œillets. Alors commençons.

Le dispositif microfluidique utilisé pour cette procédure est assemblé à partir de trois couches de PDMS durcis générés par photolithographie standard. La première couche générée à partir d’un maître en silicone a les puits du dispositif microfluidique qui maintiendra doucement les œillets en place, 150 micromètres de profondeur et 500 micromètres de diamètre. La deuxième couche a des canaux de 500 micromètres de haut et deux millimètres de large.

Le milieu du canal est élargi pour étaler le flux pour un meilleur échange de solution À l’intérieur de l’appareil, en échange, bien est fait en perçant un trou de trois millimètres de haut et sept millimètres de large au milieu de la couche. La troisième couche est une épaisse dalle de PDMS. Pour préparer cette couche, percez de petits trous des deux côtés qui s’alignent avec l’entrée et la sortie du canal.

Sur la deuxième couche, une fois que les trois couches ont été générées, la première couche est liée à une lame de verre avec les puits vers le haut. La deuxième couche est ensuite collée à la première couche avec l’espacement des canaux vers le haut. Enfin, la troisième couche est collée à la deuxième couche.

Une fois les couches collées, l’appareil est prêt à être utilisé pour des expériences. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres remplie d’éthanol à 70 % et connectée à l’orifice d’entrée de l’appareil avec du Tai sur la tubulure, stérilisez le dispositif microfluidique en faisant circuler l’éthanol à travers les canaux de l’appareil. Ensuite, en utilisant le même flux de configuration, de l’eau déminéralisée pour laver l’éthanol.

Une fois l’appareil stérilisé, placez-le sur une platine de microscope chauffée à l’aide d’un tube tigon, connectez les pousse-seringues contenant des solutions à haute et basse teneur en glucose à un connecteur en Y. Connectez-vous ensuite à l’entrée du dispositif microfluidique. Connectez la sortie du dispositif microfluidique à un collecteur de fractions.

Assurez-vous que le tube repose sur une plaque chauffante à 37 degrés Celsius. Il est très important de maintenir les solutions à température physiologique tout au long de l’expérience. Ensuite, utilisez le programme de vue de laboratoire pour initier le gradient de glucose qui sera perfusé à travers le réseau microfluidique pendant l’expérience.

Ce logiciel fait varier le débit de deux solutions de glucose. En contrôlant les pousse-seringues, il est possible de créer différents profils de gradient de glucose, linéaires, en forme de cloche et de forme carrée. Par rapport aux valeurs attendues calculées montrées dans cette expérience, le gradient linéaire de deux millimolaires à 25 millimolaires de glucose sera utilisé avec un débit variable de 0,01 millilitre par minute des deux solutions de glucose et un débit constant de 0,25 millilitres par minute entrant dans le dispositif après le mélange des solutions.

Une fois que le profil de pente approprié a été sélectionné, testez la stabilité de la pente. Tout d’abord, démarrez le système de dégradé. Ensuite, démarrez le collecteur de fractions et collectez huit perfusés dans des tubes d’un millilitre et d’orph.

Ensuite, à l’aide d’un glucomètre, testez la concentration de glucose dans chaque tube à l’aide d’Excel. Analysez les résultats obtenus à partir du glucomètre. Ensuite, remplacez la seringue à haute teneur en glucose par une seringue contenant une solution BSA à 0,5 % dans le tampon de sonnerie Krebs PERFUSE 50 millilitres à travers l’appareil à raison d’un millilitre par minute.

Cela empêchera l’absorption non spécifique de l’insuline dans les parois des microcanaux afin d’assurer la précision lors de la mesure ultérieure des niveaux d’insuline sécrétés après une perfusion avec BSA. Remplacez-le par la solution à haute teneur en glucose reus. Suspendez 25 à 30 œillets de souris triés sur le volet dans un tampon de sonnerie de glucose Krebs de deux millimètres molaires contenant le colorant indicateur de calcium fira 2:00 AM et le colorant indicateur de potentiels mitochondriaux rumine 1 2 3, incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l’incubation, débranchez le dispositif du système de perfusion et chargez soigneusement les œillets dans le dispositif microfluidique en insérant la pointe de la pipette, contenant les îlots dans l’orifice d’entrée, et en distribuant lentement les îlots après le chargement, reconnectez le dispositif au système de perfusion. Veiller à ne pas introduire de bulles. Ensuite, démarrez le pousse-seringue pour commencer à perfuser les œillets avec du KRB contenant deux millimolaires de glucose.

Cette étape permettra de laver l’excès de colorant du milieu, de désigner les ensembles de filtres d’excitation et d’émission et les temps d’exposition à utiliser pendant l’expérience. Réglez ensuite le collecteur de fractions pour qu’il recueille à des intervalles d’une minute tout en utilisant les œillets avec la solution à faible teneur en glucose. Utilisez l’outil de région d’intérêt ou de retour sur investissement du logiciel d’imagerie PCI simple pour définir les zones ou les œillets que vous souhaitez imager.

De plus, encerclez la zone d’arrière-plan qui sera soustraite après que les cellules aient été lavées pendant 10 minutes, démarrez le collecteur de fractions de gradient de glucose et lancez l’imagerie en accéléré. Après 30 minutes, éteignez le logiciel et la pompe à seringue à glucose élevé. Continuez à perfuser avec un faible taux de glucose pour éliminer l’effet de l’hyperglycémie.

Après 10 minutes, arrêtez le flux de faible glucose en éteignant le tire-seringue. Suite à la perfusion, exportez les données vers excel pour analyse. La quantité d’insuline sécrétée dans le perfu huit peut être déterminée par les œillets de souris ELA.

Ont été perfusés avec un gradient linéaire de 2 à 25 millimolaires de glucose, comme indiqué ici. L’afflux de calcium et la sécrétion d’insuline sont déclenchés après environ 13 minutes de perfusion correspondant à six millimolaires. Glucose. Les changements dans les potentiels mitochondriaux sont observés plus tôt, comme prévu à environ 11 minutes.

Ces données démontrent l’intérêt d’utiliser ce réseau microfluidique pour caractériser la physiologie des œillets. Nous venons de vous montrer comment utiliser notre dispositif de parafusion microfluidique pour l’étude de la physiologie des œillets. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de s’assurer qu’il n’y a pas de bulles dans l’appareil, car cela pourrait provoquer le déplacement des œillets pendant une expérience.

De plus, la rafale peut être ajustée jusqu’à un ml par minute sans perturber les œillets. Alors c’est tout. Merci d’avoir regardé et bonne chance dans votre expérience.