Un système multi-paramétriques Islet périfusion dans un dispositif microfluidique périfusion

Dans cette présentation, nous présenterons un système de perfusion de paupière basé sur la microfluidique permettant la mesure simultanée de la sécrétion dynamique d'insuline, de l'influx calcique et des variations du potentiel mitochondrial des ilots pancréatiques en réponse à des sécrétagogues d'insuline. Le système de perfusion est composé d'un dispositif microfluidique à trois couches, de pompes à seringue et d'un collecteur fractionné d'insuline. L'influx calcique induit par les sécrétagogues et les potentiels mitochondriaux sont visualisés à l'aide d'un dispositif de microscopie fluorescente.

Bonjour, je m'appelle Ola, un Waller du laboratoire du Dr Val Holter du Département de chirurgie transplantatoire de l'Université de l'Illinois à Chicago. Bonjour, je suis Don Lee, également du laboratoire d'octobre. Bonjour, je suis Tricia Hart, également du laboratoire du Dr Al Holster.

Aujourd'hui, nous allons vous présenter une procédure d'imagerie simultanée des paupières à l'aide d'un gradient linéaire de glucose. Nous avons utilisé cette procédure dans notre laboratoire pour étudier les structures oculaires et leur fonction. Commençons donc.

Le dispositif microfluidique utilisé pour cette procédure est assemblé à partir de trois couches de PDMS durci obtenues par photolithographie standard. La première couche, obtenue à partir d'un moule en silicone, présente des puits pour le dispositif microfluidique qui maintiendront délicatement les œilletons en place, de 150 micromètres de profondeur et de 500 micromètres de diamètre. La seconde couche comporte des canaux de 500 micromètres de hauteur et de deux millimètres de largeur.

Le milieu du canal est élargi afin de répartir l'écoulement pour un meilleur échange de solution. À l'intérieur du dispositif, un puits d'échange est créé en perçant un trou de trois millimètres de haut sur sept millimètres de large au centre de la couche. La troisième couche est un bloc épais de PDMS. Pour préparer cette couche, percez de petits trous sur les deux côtés, alignés avec l'entrée et la sortie du canal.

Sur la deuxième couche, une fois les trois couches générées, la première couche est liée à une lame de verre avec les puits orientés vers le haut. La deuxième couche est ensuite liée à la première couche avec l'espacement des canaux vers le haut. Enfin, la troisième couche est liée à la deuxième couche.

Une fois les couches assemblées, le dispositif est prêt à être utilisé pour les expériences. À l’aide d’une seringue de 10 millilitres remplie d’éthanol à 70 % et raccordée au port d’entrée du dispositif avec un tube Tai, stériliser le dispositif microfluidique en faisant circuler l’éthanol à travers les canaux du dispositif. Ensuite, avec le même montage, faire circuler de l’eau désionisée pour éliminer l’éthanol.

Une fois le dispositif stérilisé, placez-le sur un plateau chauffant de microscope à l’aide d’un tube en teflon, puis reliez les pompes à seringue contenant les solutions de glucose à forte et faible concentration à un connecteur en Y. Ensuite, connectez-le à l’entrée du dispositif microfluidique. Reliez la sortie du dispositif microfluidique à un collecteur de fractions.

Veillez à ce que le tube repose sur une plaque chauffante réglée à 37 degrés Celsius. Il est très important de maintenir les solutions à la température physiologique tout au long de l'expérience. Ensuite, utilisez le programme LabVIEW pour initier le gradient de glucose qui sera perfusé à travers le réseau microfluidique durant l'expérience.

Ce logiciel fait varier le débit de deux solutions de glucose. En contrôlant les pompes à seringue, divers profils de gradient de glucose peuvent être créés ici, tels que des profils linéaires, en forme de cloche et en forme carrée. Dans le cadre de cette expérience, où les valeurs mesurées sont comparées aux valeurs théoriques calculées, un gradient linéaire de glucose allant de deux millimolaires à 25 millimolaires sera utilisé, avec un débit variable de 0,01 millilitre par minute pour les deux solutions de glucose et un débit constant de 0,25 millilitre par minute entrant dans le dispositif après le mélange des solutions.

Une fois le profil de gradient approprié sélectionné, vérifiez la stabilité du gradient. Commencez par démarrer le système de gradient, puis mettez en marche le collecteur de fractions et recueillez huit millilitres de perfusat dans des tubes Eppendorf d'un millilitre.

Ensuite, à l’aide d’un glucomètre, mesurez la concentration de glucose dans chaque tube en utilisant Excel. Analysez les résultats obtenus à partir du glucomètre. Puis, remplacez la seringue contenant du glucose concentré par une seringue contenant une solution d’albumine (BSA) à 0,5 % dans un tampon Krebs-Ringer, et perfusez 50 millilitres à travers le dispositif à un débit de un millilitre par minute.

Cela permettra d'éviter l'absorption non spécifique de l'insuline sur les parois des microcanaux afin d'assurer la précision lors de la mesure ultérieure des niveaux d'insuline sécrétée après perfusion avec du BSA. Remplacez-le par la solution de glucose élevée reus. Suspendez 25 à 30 îlots de souris sélectionnés manuellement dans un tampon Krebs-Ringer contenant deux millimolaires de glucose et les colorants indicateurs de calcium fura-2 AM et de potentiel mitochondrial rhodamine 123, puis incubez pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Après l'incubation, déconnectez l'appareil du système de perfusion et chargez soigneusement les billes dans le dispositif microfluidique en insérant la pointe de la pipette, contenant les îlots, dans le port d'entrée, puis en délivrant lentement les îlots. Après le chargement, reconnectez l'appareil au système de perfusion, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Ensuite, démarrez la pompe à seringue pour commencer à perfuser les billes avec du KRB contenant deux millimolar de glucose.

Cette étape permettra de laver l'excès de colorant dans le milieu, de définir les jeux de filtres d'excitation et d'émission ainsi que les temps de pose à utiliser pendant l'expérience. Ensuite, régler le collecteur fractionné pour recueillir les fractions à intervalles d'une minute tout en utilisant les orifices avec la solution à faible teneur en glucose. Utiliser l'outil de région d'intérêt (ROI) du logiciel d'imagerie Simple PCI pour délimiter les zones ou orifices que vous souhaitez imager.

En outre, entourez la zone du fond qui sera soustraite après que les cellules aient été lavées pendant 10 minutes, démarrez le collecteur fractionné de gradient de glucose et initiez l'acquisition d'images en laps de temps. Après 30 minutes, arrêtez le logiciel et la pompe à seringue de glucose à concentration élevée. Poursuivez la perfusion avec du glucose à faible concentration afin d'éliminer l'effet du glucose à concentration élevée.

Après 10 minutes, arrêter l'écoulement du glucose faible en éteignant la pompe à seringue. Après la perfusion, exporter les données vers Excel pour analyse. La quantité d'insuline sécrétée dans le liquide de perfusion peut être déterminée par les puces ELA pour souris.

Ont été perfusés avec un gradient linéaire de glucose allant de 2 à 25 millimolaire, comme indiqué ici. L'entrée de calcium et la sécrétion d'insuline sont déclenchées après environ 13 minutes de perfusion, correspondant à 6 millimolaire de glucose. Les variations des potentiels mitochondriaux apparaissent plus tôt, comme prévu, vers 11 minutes.

Ces données démontrent l'avantage de l'utilisation de ce réseau microfluidique pour caractériser la physiologie des œillets. Nous venons de vous montrer comment utiliser notre dispositif microfluidique de paraperfusion pour l'étude de la physiologie des œillets. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de veiller à ce qu'il n'y ait aucune bulle dans le dispositif, car cela pourrait provoquer le déplacement des œillets pendant une expérience.

De plus, le débit peut être ajusté jusqu'à un ml par minute sans perturber les œillets. Voilà, c'est tout. Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.