Stimulation de tranches de cerveau utilisant un réseau microfluidique et de chambre de perfusion standard

L'objectif principal du projet que nous allons vous présenter aujourd'hui est de pouvoir contrôler spatialement et temporellement la stimulation cérébrale. Un autre point essentiel est qu'en apportant une modification simple au dispositif électrophysiologique déjà complexe, nous pouvons diffuser ce dispositif microfluidique auprès des divers laboratoires qui utilisent actuellement cette stimulation cérébrale in vivo. Bonjour, je suis Java Chek Mohammad du laboratoire Edington, du département de génie biomédical de l'Université de l'Illinois à Chicago.

Aujourd'hui, je vais vous montrer comment nous allons appliquer un dispositif microfluidique microfabriqué simple pour la stimulation de tranches cérébrales. Le dispositif pour tranches cérébrales que nous allons démontrer aujourd'hui est très utile pour plusieurs raisons, les principales étant sa modularité, qui lui permet de s'intégrer facilement dans un dispositif d'électrophysiologie existant sans nécessiter de modifications supplémentaires. De plus, il évite l'utilisation de tubulures et de pompes, éléments qui compliquent habituellement tout dispositif microfluidique.

Et puisque nous utilisons la méthode de pompage passif, nous n'avons besoin d'aucun tube ni de pompe. La troisième chose est qu'il s'agit simplement d'une fine membrane en PDMS placée entre une lamelle et une chambre de perfusion standard, utilisée dans un montage standard d'électrophysiologie. La procédure que je vais démontrer aujourd'hui commence par un master C huit, fabriqué à l'aide du procédé classique de lithographie SV huit.

Et le modèle que nous avons ici aujourd’hui est un modèle à deux niveaux, un niveau comportant la conception des canaux, les microcanaux, et un autre dessin pour les ouvertures verticales situées au-dessus de ces canaux, de sorte que les solutions circulant dans les canaux puissent s’échapper par les ouvertures via. Nous réalisons donc ce modèle, qui se trouve sur une tranche de silicium, puis nous utilisons du silicone ou du PDMS que nous versons au-dessus de ce dispositif afin de moulir les structures présentes sur cette tranche dans le PDMS. Nous allons donc verser du PDMS au-dessus de ce dispositif.

Ensuite, nous allons prendre la membrane en PDMS formée après le durcissement et liée à une lamelle. Puis nous aurons notre dispositif microfluidique. Ensuite, nous allons modifier une chambre de perfusion standard en appliquant une fine couche de PDMS au fond de la chambre de perfusion.

Et une fois que nous avons cette chambre de perfusion modifiée, nous allons prendre le dispositif microfluidique que nous avons fabriqué précédemment et le fixer à la chambre de perfusion. Deux points sont critiques dans la fabrication du dispositif microfluidique. Le premier est que, avant de placer le PDMS, la plaque chauffante doit être éteinte afin que le PDMS ne durcisse pas instantanément lorsque nous le versons sur la tranche.

Un autre point critique est que les entretoises que nous utilisons aux quatre coins de la plaquette de silicium doivent avoir une hauteur inférieure à celle de la structure la plus haute sur la plaquette. Cela permet de s'assurer que les ouvertures de VR peuvent être obtenues lors du processus de durcissement du PDMS. Nous sommes ici dans cette salle propre modulaire à parois souples, et c'est le modèle maître que nous avons fabriqué à l’aide d’un procédé standard de lithographie en C huit.

Il s'agit d'un master à deux niveaux, le premier niveau comportant la conception des canaux avec quatre entrées et une sortie. Dans la région centrale des quatre canaux, se trouvent des vias ou points situés au-dessus des canaux. Ce sont des repères d'alignement créés lors du processus de fabrication.

Et maintenant, je vais vous montrer comment je vais le retirer et effectuer la polymérisation du PDMS. En raison de l'effet de bord, l'épaisseur en périphérie externe de la plaquette est supérieure à celle des dispositifs réels situés au centre de la plaquette. Nous allons donc retirer ces marques d'alignement à l'aide de la lame de réserve, puis, afin de placer les poids, nous utiliserons ces entretoises de 140 microns de hauteur que nous positionnerons aux quatre coins de la plaquette.

Vous devez donc vous assurer que la lame de rasoir ne s'approche pas des dispositifs réels. Je vais maintenant éliminer ces particules SVA à l'aide d'une bombe d'air comprimé, et la plaquette est désormais prête pour la préparation du moule en PDMS. Mais avant cela, nous devons placer ces entretoises de 140 microns de hauteur.

Je vais donc placer les quatre bandes adhésives aux quatre coins de la plaquette. Ensuite, je m'assurerai que le ruban adhère correctement à la plaquette. La raison pour laquelle le ruban fait 140 micromètres d'épaisseur est que le moule bicouche, comprenant les canaux et le VS, mesure 150 micromètres de hauteur.

Et lorsque nous plaçons le poids sur le dessus du PDMS pendant la polymérisation du PDMS, nous devons nous assurer que la feuille de PDMS ressorte bien plate. Nous utilisons donc quatre entretoises aux coins, ayant toutes la même hauteur. Je vais maintenant montrer comment nous allons découper le PDMS et le polymériser pour fabriquer les dispositifs.

Mais avant de faire cela, permettez-moi de vous montrer comment nous avons préparé la solution de PDMS. Nous prenons 10 parties de la base et 1 partie d'agent de réticulation, puis nous mélangeons soigneusement en raison du processus de mélange. Vous voyez que nous générons de nombreuses bulles dans la solution de PDMS ; pour éliminer ces bulles, nous allons placer le PDMS dans le dessiccateur. Après avoir mis le PDMS dans le dessiccateur pendant 10 minutes, il n’y a plus de bulles.

Et maintenant, le PDMS est prêt à être utilisé pour le vulcanisage. Je vais maintenant vous montrer comment nous allons déposer le PDMS sur la plaquette et le faire durcir afin d'obtenir la membrane en PDMS. Je vais donc appliquer le PDMS sur la plaquette, puis utiliser cette feuille transparente pour recouvrir le PDMS.

Et cela va nous aider à retirer le dispositif sup, à séparer le dispositif de la feuille transparente, puis je vais placer les poids sur le dessus de la feuille transparente. La raison pour laquelle nous utilisons les poids est d'obtenir une épaisseur uniforme du PDMS. Un autre point critique consiste à obtenir les ouvertures de via.

Donc, là où il y a des vs, nous ne voulons pas de PDMS et les poids vont nous aider à y parvenir. Comme vous pouvez le voir ici, le bloc chauffant est éteint, et la raison en est que nous ne souhaitons pas que le PDMS polymérise instantanément ; ainsi, nous le laissons éteint. Ensuite, vous devez vous assurer que la plaquette est bien plane avant de transférer le PDMS.

Et maintenant, nous pouvons transférer le PDMS que nous avons préparé précédemment. Veillez à déposer le PDMS suffisamment près de la plaquette pour ne pas générer de bulles. Et le point le plus critique ici est la manière dont vous placez la feuille transparente au-dessus du PDMS.

Vous devez vous assurer de ne pas générer de bulles en raison du positionnement de la feuille. Maintenant, je vais placer l'un de ces laboratoires en verre et laisser l'excès de PDMS s'échapper. Je place trois autres laboratoires en verre et je m'assure que les laboratoires en verre ne bougent pas par rapport à ce moule particulier.

Et pour ces caractéristiques particulières, nous avons constaté que le fait de placer ces quatre plots en verre permet d’obtenir le VS. Cela permet à l’excès de PDMS de s’échapper par les côtés entre la feuille transparente et la plaquette. Nous attendons une à deux minutes, puis nous pouvons enclencher la plaque chauffante. Selon les matrices et les conceptions utilisées, vous devrez peut-être augmenter ou réduire le nombre de plots en verre afin d’obtenir des ouvertures de vias. La plaque chauffante est désormais prête à être mise en marche, et je vais régler la température à 75 degrés.

Et une fois que la température atteint 75 degrés, nous pouvons régler la minuterie sur une heure et laisser le PDMS durcir. Maintenant que nous avons laissé le PDMS durcir pendant une heure, nous pouvons éteindre le bloc chauffant et le laisser refroidir jusqu'à 50 degrés Celsius. La raison pour cela est d'éviter que le SEA ne se fissure.

Si nous le retirons immédiatement de 75 degrés pour le ramener à la température ambiante, nous pouvons maintenant l'éteindre et attendre qu'il descende à 50 degrés Celsius. Maintenant que la température de la plaque chauffante est descendue à 50 degrés Celsius, nous pouvons retirer les poids de la feuille transparente. Nous pouvons maintenant retirer la plaquette de la plaque chauffante et elle est prête à être découpée.

La feuille de PDMS est maintenant prête à être retirée du moule en C huit et nous devons enlever la feuille d'aluminium. Ensuite, nous devons retirer la feuille transparente. Nous avons ici la chambre de perfusion standard.

Nous l'avons modifié afin de pouvoir l'aligner avec les trous, les orifices d'entrée et de sortie du dispositif microfluidique. Il s'agit donc des quatre orifices d'entrée et d'un orifice de sortie sur la membrane en PDMS.

Et ceux-ci doivent correspondre aux quatre entrées et à la sortie de la chambre de perfusion. Je vais maintenant faire glisser la chambre de perfusion, puis l’aligner avec les trous du membrane en PDMS. Une fois qu’ils sont alignés, elle est prête à être découpée.

Vous pouvez maintenant retirer la chambre à l’aide d’une sonde. Assurez-vous que tous les bords de la membrane en PDMS soient libres pour être retirés. Une fois ceci fait, vous pouvez utiliser un congélateur pour enlever la membrane en PDMS, et veillez, lorsque vous retirez le PDMS du dessus du dispositif, à déplacer le PDMS très lentement afin de ne pas déchirer la membrane en PDMS.

Je vais maintenant positionner la membrane en PDMS avec les cavités formées à l'aide des huit moules SC sur le dessus et m'assurer qu'elle est bien plate. La raison pour laquelle nous faisons cela est que, lorsque nous réaliserons les trous, les orifices d'entrée et de sortie, le PDMS ne sera pas rugueux sur le côté qui sera lié à la lamelle.

Nous devons donc nous assurer que les cavités se trouvent sur le côté supérieur. Nous pouvons maintenant créer les orifices d'entrée et de sortie afin de bien voir les trous. Nous plaçons un fond noir.

Maintenant, je vais créer les orifices d'entrée et de sortie, et je dois m'assurer qu'aucun PDMS n'est laissé au niveau de l'orifice. Il faut donc retirer tout résidu de PDMS. Nous allons maintenant transférer la membrane en PDMS sur une autre feuille de transparence.

Nous pouvons donc traiter la feuille et la lamelle avec du plasma et les poser de manière à ce que les cavités se retrouvent encore en haut. Une fois que cette surface a été traitée au plasma et que la lamelle a également été traitée au plasma, nous pouvons rapprocher ces deux surfaces pour former le réseau microfluidique, en éliminant les bulles d'air entre la feuille de PDMS. La transparence peut être assurée à l'aide d'un ruban adhésif transparent.

Ainsi, cela garantira que la feuille de PDMS soit plate et que l'adhérence s'effectue beaucoup mieux. Ensuite, utilisez à nouveau du ruban adhésif sur la surface supérieure pour éliminer toute poussière présente sur la membrane de PDMS. Nous pouvons maintenant placer la lame de couverture que nous allons lier à la membrane de PDMS.

Et maintenant, ces deux morceaux de PDMS et le verre sont prêts à être traités au plasma. Nous allons traiter au plasma le PDMS et la lamelle en utilisant ce système de plasma modifié par micro-ondes, dans lequel on voit que l'enceinte en verre nous permet de créer le plasma à l'intérieur du micro-ondes. Permettez-moi de placer les échantillons à l'intérieur en créant un vide dans l'enceinte.

Je peux maintenant faire circuler de l'oxygène. Le système de plasma est maintenant prêt à fonctionner et je vais utiliser une puissance de 10 % pendant 10 secondes pour ce système particulier, afin de visualiser le plasma. Pendant le traitement par plasma, nous avons augmenté la puissance à cent pour cent et nous avons éteint les lumières.

Et maintenant, vous pouvez observer le plasma immédiatement après le traitement au plasma. Vous devez assembler les deux surfaces, la lame de verre et le PDMS, sinon la surface du PDMS perdra sa hydrophilie due au traitement au plasma. Une fois la lame de verre placée, assurez-vous que toute la surface soit correctement liée sans aucune bulle d'air.

S'il y a des bulles d'air, vous pouvez les retirer. Laissez reposer maintenant pendant cinq minutes afin de permettre la liaison. Voici donc la chambre de perfusion modifiée, dans laquelle nous avons modifié la base de la chambre avec du PDMS.

Et cela a été fait précédemment. Nous avons donc placé une transparence sur une plaque chauffante éteinte. Ensuite, nous avons versé le P-D-M-S-P-D-M-S préparé de manière similaire à ce qui a été montré précédemment.

Ensuite, nous avons placé la chambre de perfusion sur le dessus du PDMS, puis ajouté un poids unique comme indiqué ici, et laissé polymériser pendant 30 minutes à 75 degrés Celsius. Maintenant, pendant que nous attendons la liaison entre le PDMS et la lame de couverture, je vais montrer que nous pouvons préparer la chambre. Ainsi, nous pouvons assembler la chambre et le dispositif microfluidique.

Nous devons donc éliminer l'excès de PDMS là où nous n'en avons pas besoin. Retirez la transparence, puis le PDMS. Ensuite, nous devons enlever le PDMS des orifices d'entrée et de sortie. La chambre est maintenant prête à être scellée avec le dispositif microfluidique que nous avons préparé précédemment.

Maintenant que nous avons attendu cinq minutes, le dispositif microfluidique est prêt à être séparé de la feuille transparente, mais vous devez vous assurer de retirer la feuille lentement, afin que le PDMS et la lame de couverture ne se séparent pas. Maintenant que la chambre de perfusion est prête, nous devons traiter au plasma la surface inférieure de la chambre, là où nous avons collé le PDMS, ainsi que la surface supérieure du dispositif microfluidique qui comporte le PDMS.

À présent, nous allons placer les deux éléments dans la chambre à plasma et effectuer le traitement plasma à 10 % de puissance pendant 10 secondes. Les deux surfaces ont maintenant été traitées au plasma et sont prêtes à être assemblées. Avant de procéder à l'assemblage, vous devez vous assurer que les orifices d'entrée et de sortie de la chambre sont alignés avec ceux du dispositif microfluidique.

Et puisque les éléments que nous alignons sont suffisamment grands, nous n'avons pas besoin d'équipement particulier et nous pouvons le faire à l'œil nu. Une fois l'alignement effectué et le dispositif placé au-dessus de la chambre, assurez-vous que toutes les surfaces sont bien en contact, puis laissez reposer pendant cinq minutes. La liaison sera alors suffisamment solide pour les expériences après ce délai de cinq minutes.

Maintenant que le dispositif microfluidique est lié à la chambre, nous allons rendre les canaux de la surface des canaux hydrophiles. Ainsi, lorsque nous ferons circuler une solution de CFS ou tout autre neurotransmetteur, les solutions pourront s'écouler plus facilement. Ce que je vais faire, c'est placer l'ensemble du dispositif dans le plasma et le traiter au plasma pendant une minute à 10 %, afin que toutes les surfaces internes des canaux deviennent hydrophiles.

Ensuite, je vais le remplir d'eau, puis l'emmener vers le dispositif d'électrophysiologie afin de réaliser les expériences proprement dites. Très bien, nous sommes maintenant prêts à nous rendre au dispositif d'électrophysiologie et à utiliser effectivement cet appareil avec la coupe de cerveau. Bonjour, je m'appelle uo.

Je travaille avec le Dr Arrington et le Dr Fall, du Département de génie biomédical de l'Université de l'Illinois. Et maintenant, je vais travailler avec le dispositif microbien libre que j'ai apporté et que je viens de placer sur cette plateforme. D'un côté, nous pouvons voir le tube de perfusion.

De l'autre côté, on peut voir le tube d'aspiration. Le dispositif va donc être perfusé avec une solution de LCR, qui est saturée avec 95 % d'oxygène et 5 % de CO2. Maintenant que le microdispositif V est prêt, je vais récupérer le tissu cérébral, puis je vais le placer au-dessus du microdispositif.

Maintenant, je vais placer la tranche de cerveau, euh, sur les ouvertures circulaires, puis je vais utiliser l'ancrage afin d'immobiliser la tranche de cerveau. Maintenant que la tranche de cerveau est immobilisée, je vais utiliser des neurotransmetteurs, euh, pour la stimuler. Ici, nous avons quatre entrées ; je vais donc introduire des neurotransmetteurs dans chaque entrée en utilisant la pompe passive à partir de ces quatre entrées jusqu'à cette sortie.

Et maintenant, le Dr Fall va parler de ce dispositif. Qu'est-ce qui est si important pour nous ? Bonjour, je suis Chris Fall et nous étudions la physiologie cérébrale.

La raison pour laquelle nous devons utiliser des tranches cérébrales est d'assurer l'accès aux microélectrodes et aux technologies d'imagerie. Jusqu'à présent, la seule manière de modifier l'environnement de neurotransmetteurs pour ces tranches cérébrales consistait à changer l'écoulement sur toute la tranche ou à appliquer des neurotransmetteurs directement à l'aide d'une très petite micropipette. Nous sommes donc vraiment enthousiastes à l'idée de collaborer avec le groupe d'Eddington.

Cette nouvelle technologie nous permettra d'explorer de vastes régions du cerveau et de modifier localement l'environnement des neurotransmetteurs. Ensuite, nous pourrons simultanément intervenir à l’aide de nos électrodes et de notre technologie d’imagerie, et peut-être intégrer à terme des dispositifs d’enregistrement multiélectrodes dans la même unité. Voici donc une coupe de cerveau de souris placée dans le dispositif microfluidique.

Et vous pouvez remarquer même à l'œil nu que le cerveau est composé de nombreuses régions différentes. Ces régions accomplissent des fonctions distinctes. Et chez l'animal vivant, ces différentes régions du cerveau présenteraient des tonus neuromodulateurs et neurotransmetteurs distincts.

Et nous souhaitons pouvoir reproduire cela dans notre chambre à tranches pendant que nous effectuons des enregistrements électrophysiologiques et d'imagerie. Il est donc particulièrement intéressant de pouvoir cibler ces différentes régions avec divers neurotransmetteurs, à différentes concentrations et selon des cinétiques différentes. Bien que nous ne puissions pas véritablement visualiser les neurotransmetteurs, nous pouvons vous montrer ici un exemple de colorant fluorescent qui est injecté dans la tranche cérébrale au niveau de différentes régions.

Ici, vous voyez un film dans lequel nous faisons circuler un colorant fluorescent à travers les canaux du dispositif et où nous visualisons simplement sa sortie par les pores réalisés. Même dans ce prototype précoce, vous pouvez constater à quel point la résolution spatiale du flux est précise. En regardant le film, vous verrez le colorant s'écouler dans les canaux, puis sortir par les trous, avant que nous ne rinçions ce colorant, ce qui vous donnera une idée de la résolution temporelle du flux.

Merci de nous avoir rejoints aujourd'hui. Je pense que nous avons pu démontrer comment la microfluidique, et en effet les micro-machines, peuvent être associées à des techniques physiologiques traditionnelles afin de nous aider à comprendre le fonctionnement du cerveau. Merci.