Stimulation de tranches de cerveau utilisant un réseau microfluidique et de chambre de perfusion standard

L’objectif principal du projet que nous allons vous montrer aujourd’hui est de pouvoir contrôler spatialement et temporairement la stimulation par barre oblique cérébrale. Et un autre point majeur est qu’en utilisant une simple modification dans le dispositif électrophysiologique déjà compliqué, nous pouvons disséminer ce dispositif microfluidique parmi les différents laboratoires qui utilisent réellement cette stimulation de la vie cérébrale. Bonjour, je suis Java Chek Mohammad du laboratoire Edington du département de bio-ingénierie de l’Université de l’Illinois à Chicago.

Aujourd’hui, je vais vous montrer comment nous allons appliquer un dispositif microfluidique micro-fabriqué simple pour la stimulation par tranches de cerveau. Le dispositif de tranche de cerveau que nous allons démontrer aujourd’hui est très utile pour plusieurs raisons, et les principales raisons sont qu’il est si modulaire qu’il peut s’intégrer dans la configuration électrophysiologique existante sans aucune nouvelle modification supplémentaire. Et il évite l’utilisation de tubes et de pompages, ce qui complique tout dispositif microfluidique.

Et comme nous utilisons la méthode de pompage passif, nous n’avons pas besoin de tubes ou de pompes. Et la troisième chose, c’est qu’il ne s’agit que d’une mince feuille de membrane PDMS qui se place entre une lamelle de recouvrement et une chambre de profusion standard, qui est utilisée dans une configuration d’électrophysiologie standard. La procédure que je vais démontrer aujourd’hui commence par un master C huit, qui est fabriqué à l’aide du procédé de lithographie standard SV huit.

Et le master que nous avons aujourd’hui ici est un master à deux niveaux, avec un niveau ayant la conception des canaux, les micro-canaux, et un autre design pour les ouvertures VR qui vont au-dessus de ces canaux afin que les solutions qui circulent à travers les canaux puissent sortir des ouvertures via. Nous fabriquons donc ce maître, qui se trouve sur une plaquette de silicone, puis nous utilisons du silicone ou le PDMS pour verser sur le dessus de cet appareil et mouler les structures qui se trouvent au-dessus de cette plaquette sur le PDMS. Nous allons donc faire couler le PDMS sur cet appareil.

Ensuite, nous allons prendre la membrane PDMS qui s’est formée après le durcissement et qui est collée à une lamelle. Et puis nous avons notre dispositif microfluidique. Ensuite, nous allons modifier une chambre de profusion standard en citant une fine couche de PDMS au fond de la chambre de perfusion.

Et une fois que nous aurons cette chambre de perfusion modifiée, nous prendrons le dispositif microfluidique que nous avons fabriqué précédemment et le collerons à la chambre de perfusion. Il y a deux points critiques dans la fabrication du dispositif microfluidique. L’une d’entre elles est qu’avant de mettre le PDMS, la plaque chauffante doit être éteinte afin que le PDMS ne fasse pas la queue instantanément lorsque nous le versons sur la plaquette.

Et un autre point critique est que les entretoises que nous utilisons aux quatre coins de la plaquette de silicium doivent avoir une hauteur inférieure à la structure la plus haute de la plaquette de silicium. Il s’agit de s’assurer que les ouvertures VR peuvent être obtenues lorsque nous effectuons le processus de durcissement du PDMS. Nous voici dans cette salle blanche modulaire à parois souples et c’est le maître que nous avons fabriqué en utilisant un procédé de lithographie standard C huit.

Et il s’agit d’un master à deux niveaux, le premier niveau ayant la conception des canaux avec quatre entrées et une sortie. Et dans la région centrale des quatre canaux, il y a des vias ou des pos qui se trouvent au-dessus des canaux. Et ce sont les marques d’alignement qui ont été créées au cours du processus de fabrication.

Et maintenant, je vais vous montrer comment je vais l’enlever et faire le durcissement PDMS. En raison de l’effet de perle de bord, l’épaisseur dans la périphérie extérieure de la plaquette est supérieure à celle des dispositifs réels au centre du papier. Donc, ce que nous allons faire, c’est supprimer ces marques d’alignement à l’aide de la lame de réserve, puis pour accueillir les poids, nous allons utiliser ces entretoises qui ont une hauteur de 140 microns et nous allons les placer aux quatre coins de la plaquette.

Vous devez donc vous assurer que la lame de rasoir ne s’approche pas des appareils réels. Maintenant, je vais enlever ces particules SVA à l’aide de l’air duster et la plaquette est maintenant prête pour la préparation du moule PDMS. Mais avant de faire cela, nous devons mettre ces entretoises qui font 140 microns de haut.

Je vais donc placer les quatre bandes aux quatre coins de la plaquette. Ensuite, je vais m’assurer que le ruban adhère correctement à la plaquette. Donc, la raison pour laquelle la bande avait une hauteur de 140 microns est que le master à deux niveaux avec les canaux et le VS fait 150 microns de haut.

Et lorsque nous plaçons le poids sur le PDMS pendant le durcissement PDMS, nous voulons nous assurer que la feuille PDMS ressort à plat. Nous utilisons donc quatre entretoises sur les coins de hauteurs égales. Maintenant, je vais montrer comment nous allons coder le PDMS et le guérir pour fabriquer les appareils.

Mais avant de le faire, permettez-moi de vous montrer comment nous avons préparé la solution PDMS. Nous prenons donc 10 parties de la base et une partie de l’agent de durcissement et les mélangeons soigneusement en raison du processus de mélange. Vous voyez que nous générons beaucoup de bulles dans la solution PDMS pour éliminer ces bulles, nous allons mettre le PDMS dans la dessiccation après avoir mis le, après avoir mis le PDMS dans la dessiccation pendant 10 minutes, il n’y a pas de bulles.

Et maintenant, le PDMS est prêt à être utilisé pour le durcissement. Maintenant, je vais vous montrer comment nous allons mettre le PDMS sur la plaquette et la polymériser pour obtenir la membrane PDMS. Je vais donc mettre le PDMS sur la plaquette, puis utiliser cette transparence pour couvrir le PDMS.

Et cela nous aidera à retirer l’appareil sup, à séparer l’appareil de la transparence, puis je vais placer les poids sur la transparence. Et la raison pour laquelle nous utilisons les poids est d’obtenir une épaisseur uniforme du PDMS. Et un autre problème critique est d’obtenir les ouvertures de via.

Donc, où qu’il y ait des vs, nous ne voulons pas de PDMS et les poids nous aideront à le faire. Comme vous pouvez le voir ici, la plaque chauffante est éteinte et la raison en est que nous ne voulons pas que le PDMS durcisse instantanément, nous le laissons donc être éteint. Ensuite, vous devez vous assurer que la plaquette est plate avant de porter le PDMS.

Et maintenant, nous pouvons porter le PDMS que nous avons préparé plus tôt. Assurez-vous de distribuer le PDMS suffisamment près de la plaquette pour ne pas générer de bulles. Et le point le plus critique ici est la façon dont vous mettez la transparence au-dessus du PDMS.

Vous devez vous assurer que vous ne générez pas de bulles dues au placement de la feuille. Et maintenant, je vais placer l’un de ces laboratoires de verre et laisser le PDMS en excès s’échapper. Je place trois autres laboratoires de verre et je m’assure que les laboratoires de verre ne bougent pas pour ce maître particulier.

Et pour ces caractéristiques particulières, nous avons découvert que le placement de ces quatre laboratoires de verre rend le VS. Et pour laisser l’excès de PDMS s’interposer entre la transparence et la plaquette. Nous attendons une à deux minutes, puis nous pouvons démarrer la plaque chauffante pour différents maîtres et pour différents designs, vous devrez peut-être augmenter le nombre de laboratoires de verre ou diminuer les laboratoires de verre afin d’obtenir les ouvertures de via. Maintenant, la plaque chauffante est prête à être allumée et je vais régler une température de 75 degrés.

Et une fois que la température de 75 degrés atteinte, nous pouvons régler la minuterie sur une heure et laisser le PDMS durcir. Maintenant que nous avons laissé le PDMS durcir pendant une heure, nous pouvons éteindre la plaque chauffante et la laisser refroidir à 50 degrés centigrades. La raison de le faire est que le SEA ne se fissure pas.

Si nous le retirons immédiatement de 75 degrés à température ambiante, nous pouvons maintenant l’éteindre et attendre qu’il descende à 50 degrés centigrades. Maintenant que la température de la plaque chauffante est descendue à 50 degrés centigrades, nous pouvons retirer les poids de la transparence. Maintenant, nous pouvons retirer la plaquette du lecteur chaud et elle est prête à être coupée.

Maintenant, la feuille PDMS est prête à être retirée du maître C huit et nous devons retirer la feuille d’aluminium. Ensuite, nous devons retirer la feuille de transparence. Nous avons ici la chambre de perfusion standard.

Nous l’avons modifié pour pouvoir l’aligner. Les trous, les orifices d’entrée et de sortie du dispositif microfluidique. Il s’agit donc des quatre ports d’entrée et d’un port de sortie sur la membrane PDMS.

Et ceux-ci doivent correspondre aux quatre entrées et à une sortie de la chambre de perfusion. Maintenant, je vais faire glisser la chambre de perfusion, puis l’aligner avec les trous de la membrane PDMS. Maintenant qu’ils sont alignés, il est prêt à être coupé.

Vous pouvez maintenant retirer la chambre à l’aide d’une sonde. Assurez-vous que tous les bords de la membrane PDMS sont libres pour être retirés. Une fois que nous avons fait cela, nous pouvons utiliser un congélateur pour retirer la membrane PDMS et nous assurer que lorsque vous retirez le PDMS du haut de l’appareil, vous déplacez le PDMS très lentement afin de ne pas déchirer la membrane PDMS.

Maintenant, je vais placer la membrane PDMS avec les cavités formées avec les huit maîtres SC sur le dessus et m’assurer qu’elle est plate. Et la raison pour laquelle nous le faisons est que lorsque nous faisons les trous, les orifices d’entrée et de sortie, le PDMS n’est pas rugueux sur le côté. Cela va être collé avec le bordereau de couverture.

Nous devons donc nous assurer que les cavités sont sur la face supérieure. Maintenant, nous pouvons faire les orifices d’entrée et de sortie juste pour que nous puissions voir clairement les trous. Nous avons mis un fond noir.

Maintenant, je vais faire en sorte que les orifices d’entrée et de sortie doivent s’assurer qu’il n’y a plus de PDMS au port. C’est aussi le cas, supprimez tout PDMS. Nous allons maintenant transférer la membrane PDMS sur une autre feuille de transparence.

Ainsi, nous pouvons traiter la feuille et la lamelle avec du plasma et la poser de sorte que les cavités soient encore une fois sur le dessus. Ainsi, une fois que cette surface est traitée au plasma et que la lamelle est traitée au plasma, nous pouvons réunir ces deux surfaces pour former le réseau microfluidique afin d’éliminer les bulles d’air entre la feuille PDMS. Et la transparence peut utiliser un scotch.

Ainsi, cela garantira que la feuille PDMS est plate et que le collage se produit beaucoup mieux. Et encore une fois, utilisez le scotch sur la surface supérieure pour enlever toute poussière de la membrane PDMS. Maintenant, nous pouvons mettre la lamelle de recouvrement que nous allons coller avec la membrane PDMS.

Et maintenant, ces deux PDMS et le verre sont prêts à être traités au plasma. Nous allons traiter au plasma le PDMS et la lamelle à l’aide de ce système de plasma modifié par micro-ondes où vous pouvez voir que cette chambre en verre nous permet de créer le plasma à l’intérieur de ce micro-ondes. Et permettez-moi de placer les échantillons à l’intérieur, créant ainsi un vide à l’intérieur de la chambre.

Maintenant, je peux circuler dans l’oxygène. Maintenant, le système plasma est prêt à fonctionner et je vais utiliser 10 % de puissance et 10 secondes pour ce système particulier afin d’aider à visualiser le plasma. Pendant que le traitement au plasma se poursuivait, nous avons monté la puissance à cent pour cent et nous avons éteint les lumières.

Et maintenant, vous pouvez voir le plasma immédiatement après le traitement au plasma. Vous devez coller les deux surfaces, le glissement de vache et le PDMS, sinon la surface du PDMS perdra son hydrophilie en raison du traitement au plasma. Une fois que vous avez placé la barbotine de vache, assurez-vous que toute la surface est collée sans bulles d’air.

S’il y a des bulles d’air, vous pouvez les enlever. Maintenant, vous le mettez de côté pendant cinq minutes et le laissez se lier. Nous avons donc ici la chambre de perfusion modifiée où nous avons modifié la base de la chambre avec PDMS.

Et cela a été fait plus tôt. Nous avons donc placé une transparence sur une plaque chauffante sur une plaque chauffante qui était éteinte. Et puis nous avons versé le P-D-M-S-P-D-M-S qui a été préparé de la même manière que comme indiqué précédemment.

Ensuite, nous avons placé la chambre de perfusion sur le PDMS, puis nous avons placé un seul poids comme indiqué ici et nous l’avons laissé durcir pendant 30 minutes ou 75 degrés centigrades. Et maintenant, je vais montrer que pendant que nous attendons que le PDMS et le collage de la lamelle de recouvrement se produisent, nous pouvons aller de l’avant et préparer la chambre. Nous pouvons donc lier la chambre et le dispositif microfluidique.

Nous devons donc supprimer les PDMS excédentaires là où nous n’en avons pas besoin. Supprimez la transparence puis le PDMS, Ensuite, nous devons retirer le PDMS des orifices d’entrée et de sortie. La chambre est maintenant prête à être collée avec le dispositif microfluidique que nous avons préparé précédemment.

Maintenant que nous avons attendu cinq minutes, le dispositif microfluidique est prêt à être séparé de la transparence, mais vous devez vous assurer que vous supprimez la transparence à un rythme lent. Ainsi, le PDMS et le bordereau de recouvrement ne se séparent pas. Maintenant que la chambre de perfusion est prête, nous devons traiter au plasma la surface inférieure de la chambre où nous venons de citer le PDMS et la surface supérieure du dispositif microfluidique sur lequel se trouve le PDMS.

Alors maintenant, nous allons mettre les deux, ces deux pièces dans la chambre à plasma et faire le traitement au plasma à 10 % de puissance pendant 10 secondes. Maintenant, les deux surfaces ont été traitées avec le plasma et elles sont prêtes à être liées. Avant de vous coller, vous devez vous assurer que les orifices d’entrée et de sortie de la chambre s’alignent avec le dispositif microfluidique.

Et comme les caractéristiques que nous alignons sont suffisamment grandes, nous n’avons pas besoin d’équipement spécial et nous pouvons le faire à l’œil nu. Une fois que vous avez aligné et placé sur le dessus de la chambre, assurez-vous que toutes les surfaces sont en contact, puis vous pouvez le laisser reposer pendant cinq minutes. Ainsi, la liaison est assez bonne pour les expériences après avoir attendu cinq minutes.

Maintenant que le dispositif microfluidique s’est lié à la chambre, nous allons rendre les canaux de la surface du canal hydrophiles. Ainsi, lorsque nous faisons circuler la solution A CFS ou tout autre neurotransmetteur, les solutions peuvent circuler plus facilement. Donc, ce que je vais faire, c’est mettre tout cet appareil dans le plasma et le plasma, le traiter pendant une minute à 10 % pour que toutes les surfaces des canaux internes deviennent hydrophiles.

Ensuite, je vais le remplir d’eau, puis l’amener à l’installation d’électrophysiologie pour que nous puissions faire les expériences réelles. D’accord, nous sommes maintenant prêts à passer à la configuration de l’électrophysiologie et à utiliser cet appareil avec la tranche de cerveau. Bonjour, je m’appelle uo.

Je travaille avec le Dr Arrington et le Dr Fall, du département de bio-ingénierie de l’Université de l’Illinois. Et maintenant, je vais travailler avec l’appareil micro gratuit qui a apporté et vient de manger sur la, sur cette plate-forme. D’un côté, on peut voir la tubulure de profusion.

De l’autre côté, on peut voir la tubulure d’aspiration. Ainsi, l’appareil va être perfusé avec une solution de LCR, qui est remplie de 95 % d’oxygène et de 5 % de CO2. Maintenant que le dispositif micro V est prêt, je vais obtenir la licence cérébrale, puis je vais les mettre sur le dispositif micro.

Maintenant, je vais mettre la tranche de cerveau, hein, sur le dessus des ouvertures circulaires, puis je vais utiliser l’ancre afin d’immobiliser la tranche de cerveau. Maintenant que la tranche de cerveau est immobilisée, je vais utiliser des neurotransmetteurs afin de la stimuler. Ici, nous avons quatre entrées, donc je vais mettre un neurotransmetteur dans chaque entrée en utilisant le pompage passif de ces quatre entrées jusqu’à cette sortie.

Et maintenant, le Dr Fall va parler de cet appareil. Qu’est-ce qui est si important pour nous ? Bonjour, je m’appelle Chris Fall et nous faisons de la physiologie cérébrale.

Et la raison pour laquelle nous devons utiliser des tranches de cerveau est l’accès avec des micro-électrodes et la technologie d’imagerie. Et jusqu’à présent, la seule façon de modifier l’environnement des neurotransmetteurs pour ces tranches de cerveau est de modifier le flux sur toute la tranche ou de souffler directement les neurotransmetteurs à l’aide d’une très petite micro-pipette. Nous sommes donc vraiment ravis de travailler avec le groupe d’Eddington.

Cette nouvelle technologie nous permettra de nous adresser à de grandes zones du cerveau et de modifier localement, l’environnement des neurotransmetteurs. Et puis, en même temps, nous pouvons maintenant entrer avec notre, avec nos électrodes et notre technologie d’imagerie et peut-être éventuellement construire des appareils d’enregistrement à plusieurs électrodes dans la même unité. D’accord, vous voyez ici une tranche d’entorse de souris dans le dispositif microfluidique.

Et vous pouvez remarquer même à l’œil nu que le cerveau est composé de nombreuses régions différentes. Ces régions font des choses différentes. Et chez l’animal vivant, ces différentes régions du cerveau auraient des tonalités neuromodulatrices et de neurotransmetteurs différentes.

Et nous voulons être en mesure de reproduire cela dans notre chambre de coupe pendant que nous faisons des enregistrements électrophysiologiques et d’imagerie. C’est vraiment génial de pouvoir s’adresser à ces différentes zones avec différents neurotransmetteurs, à différentes concentrations et avec des durées différentes. Et bien que nous ne puissions pas vraiment visualiser les neurotransmetteurs, nous pouvons vous montrer ici un exemple de colorant fluorescent qui est pompé dans la tranche de cerveau dans différentes régions.

Ici, vous voyez un film où nous faisons couler un colorant fluorescent à travers les canaux de l’appareil et le visualisons simplement sortir des pores qui ont été fabriqués. Et même dans ce premier prototype, vous pouvez voir à quel point la résolution spatiale est précise avec le flux. En regardant le film, vous verrez le colorant s’écouler dans les canaux, puis sortir des trous, puis nous rinçons ce colorant, ce qui vous donne une idée de la résolution temporelle du flux.

Merci de vous joindre à nous aujourd’hui. Je pense que nous avons pu démontrer comment la microfluidique et, en fait, les micro-machines peuvent être associées à des techniques physiologiques traditionnelles afin de nous aider à comprendre le fonctionnement du cerveau. Merci.