Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo

Les cartes de destin cellulaire sont générées en marquant et en suivant des cellules in vivo afin de déterminer comment les progéniteurs contribuent à des structures spécifiques et à des types cellulaires dans les tissus en développement et adultes. Une avancée dans ce domaine est la cartographie génétique inductible du destin (GIFM), qui relie l'expression génique et les comportements cellulaires in vivo pour créer des cartes de destin basées sur la lignée génétique. Bonjour, je m'appelle Deborah Ellisor du laboratoire Mark Services et du département de biologie moléculaire, biologie cellulaire et biochimie de l'université Brown.

Aujourd'hui, mes collègues Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown et moi-même allons démontrer une procédure de cartographie génétique inducible du destin cellulaire. Nous utilisons cette procédure au laboratoire pour étudier le développement précoce du cerveau. Nous pouvons également appliquer cette technique à des études d'inactivation de gènes et à des modèles animaux de maladies humaines.

Commençons donc avec les embryons X cre, E-R-M-G-F-P. L'allèle rapporteur MGFP LAE est présent dans toutes les cellules, représentées par des ovales gris X cre, er, où X désigne les éléments régulateurs du gène. L'expression de C ER est restreinte spatialement au domaine d'expression du gène X, indiqué en bleu, et la protéine CRE ER est séquestrée dans le cytoplasme par la HSP 90.

En l'absence de tamoxifène, le gène rapporteur sera inactif. L'administration de tamoxifène entraîne le marquage des cellules issues du domaine X, car le CER, libéré de la HSP 90, transloque vers le noyau et excise la cassette d'arrêt de l'allèle rapporteur. Une recombinaison permanente et héréditaire assure l'expression constitutive de MG FP LA Z. La combinaison de l'allèle rapporteur CER et du tamoxifène permet le marquage : lorsque la population cellulaire est initialement marquée dans une région cérébrale primordiale de l'embryon selon l'expression génique, ces cellules marquées par lignée sont suivies même après que l'expression génique initiale ayant conduit à l'activation du CER a cessé.

De cette manière, la distribution finale et le destin terminal d'une lignée cellulaire définie génétiquement peuvent être identifiés chez l'adulte. Cette procédure commence par la préparation d'une solution de tamoxifène à 20 milligrammes par millilitre : dissoudre 200 milligrammes de tamoxifène dans 10 millilitres d'huile de maïs préchauffée dans un flacon en verre pour inhalation.

Incubez ensuite la solution à 37 degrés Celsius pendant deux heures sur un agitateur vortex Tator. Protégez périodiquement la solution mère de tamoxifène préparée de la lumière en enveloppant le flacon avec du papier d'aluminium et stockez-la à quatre degrés Celsius. La solution mère peut être utilisée pendant un mois maximum.

Pour les expériences de cartographie du destin cellulaire, établissez un couple reproducteur composé d'une femelle de souche sauvage Swiss Webster et d'un mâle porteur à la fois d'un allèle spécifique du gène CreER et d'un allèle rapporteur. Aux fins de cette démonstration, nous utiliserons un mâle win to one CreER MG FP. Vérifiez chaque matin la présence d'un bouchon vaginal chez la femelle Swiss Webster.

Désignez le matin du jour de la découverte du bouchon vaginal comme étant 0,5 jour post coïtum et calculez la date d'administration du tamoxifène. À partir de ce point de départ dans cette expérience, le tamoxifène sera administré au 8,5e jour embryonnaire. À l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une canule pour alimentation animale, prélevez 200 microlitres de la solution mère de tamoxifène.

Immobilisez fermement la femelle Swiss Webster gestante en saisissant le sommet du cou et le dos pour bloquer la tête, puis retournez la souris afin que la face ventrale soit orientée vers le haut. Maintenez la queue entre vos doigts libres pour garder le corps en ligne droite. Ensuite, insérez l'aiguille d'alimentation dans le coin de la bouche et guidez délicatement l'aiguille parallèlement au palais jusqu'à ce que l'extrémité de l'aiguille d'alimentation se trouve approximativement au niveau de l'œil.

Inclinez doucement la tête vers l'arrière pour accéder à l'œsophage. Dirigez l'aiguille au-delà de l'épiglotte et vers le bas de l'œsophage en direction de l'estomac. Veillez à ne pas pénétrer dans la trachée.

Une fois que l'aiguille d'alimentation est dans l'estomac, administrer le tamoxifène et retirer l'aiguille. Puis remettre la femelle dans sa cage d'origine jusqu'à la date de la dissection. À la date de la dissection, les embryons E 12,5 provenant de la femelle gestante à intervalle contrôlé sont disséqués puis évalués pour la marque GFP.

Dans un embryon GFP positif, nous observons que les neurones issus du vent un contribuent au mésencéphale, au rhombencéphale et à la moelle épinière. Le rapporteur MG FP marque les projections axonales, qui peuvent également être observées sur des embryons transférés. Les embryons GFP positifs sont montés à plat dans une boîte de Pétri contenant du PPS, puis photographiés à l’aide d’un cadre photo. Après avoir pris les photographies, utilisez une pince pour pincer un petit morceau de queue sur chaque embryon et placez chaque fragment dans un tube PCR. Les tissus seront génotypés par PCR pour les deux allèles afin de confirmer les résultats observés par analyse sur embryon entier.

Les procédures suivantes nous permettent d'analyser la manière dont les cellules marquées issues de régions embryonnaires colonisent le cerveau adulte avant de commencer la craniotomie. Vérifier par une pincée de l'orteil que la souris est complètement anesthésiée. Procéder à des incisions afin d'accéder au cœur par la cage thoracique après anesthésie avec du nembutal.

Ensuite, insérez une aiguille papillon dans l'apex ou le ventricule gauche du cœur et fixez-la avec la pince en C. Créez un site de sortie du liquide dans l'oreillette droite à l'aide de ciseaux, puis perfusez avec 10 à 15 millilitres de solution saline glacée jusqu'à ce que le liquide s'écoule clair. Suivi de 20 à 25 millilitres de paraformaldéhyde à 4 %.

Lorsque la perfusion intracardiaque est terminée, retirez la tête avec des ciseaux en coupant la colonne vertébrale juste au-dessus des épaules. Passez un scalpel le long de la ligne médiane dorsale de la tête, de l'avant vers l'arrière, afin de sectionner le cuir chevelu et d'exposer le crâne. À l'aide du scalpel, grattez soigneusement tous les tissus ou muscles excédentaires sur les côtés et à l'arrière du crâne.

Avec une pince, percer le crâne dans la ligne médiane, juste en avant des bulbes olfactifs, et créer un petit trou permettant d'insérer les pointes de ciseaux fins. Insérer les ciseaux fins dans ce trou et pratiquer deux incisions bilatérales partant de la ligne médiane et suivant la longueur des bulbes olfactifs. Cette incision fracturera le crâne au niveau de l'intersection entre l'os nasal et l'os frontal, offrant ainsi un bon accès aux ciseaux.

Coupez le long des sutures sagittales du crâne, en veillant à orienter les pointes des ciseaux vers l'extérieur par rapport au cerveau afin d'éviter d'endommager les tissus sous-jacents. Ensuite, saisissez délicatement le crâne avec une pince et retirez l'os le long de l'incision médiane pour exposer le cerveau. Le crâne peut se détacher par petits morceaux ou se briser en sections plus grandes.

Continuer à utiliser la pince pour retirer tous les os frontaux, pariétaux, interpariétaux et occipitaux. Libérer les para-oculis situés le long des bords latéraux du cerveau au niveau du cervelet en pinçant doucement les os sphériques de chaque côté. Utiliser des ciseaux pour couper soigneusement la partie dorsale de l'os qui entoure le tronc cérébral.

Insérez un côté des ciseaux juste sous le bord dorsal de l'os, en partant de l'endroit où la moelle épinière a été coupée et en sectionnant vers le cervelet. Pour libérer le tronc cérébral et le cervelet. Retirez l'os restant autour du tronc cérébral à l’aide de la pince.

Retirer délicatement les os, retourner la tête avec le côté dorsal vers le bas et utiliser la pince pour sectionner les nerfs crâniens et libérer le cerveau du crâne. Placer le cerveau dans une boîte de Pétri contenant de la glace. Évaluer le cerveau adulte pour la marque GFP à l’aide d’un microscope stéréo fluorescent et prendre une photographie à l’aide d’un cadre photo.

Dans cet exemple, le mésencéphale est marqué par la GFP, en complément de son utilisation pour l'analyse de lignage au cours de l'embryogenèse, et le GIFM chez l'adulte peut être combiné à d'autres applications couramment utilisées en biologie du développement, telles que la microdissection et les expériences sur explants tissulaires. Par exemple, le mésencéphale ventral constitue la zone précurseur des neurones dopaminergiques en développement, qui expriment le gène wind one. Ainsi, l'isolement du mésencéphale ventral par microdissection permet de créer un système in vitro afin d'étudier plus en détail son développement.

Ceci représente un exemple parmi d'autres de l'utilisation de la méthode GIFM pour isoler une zone de progéniteurs d'intérêt définie par l'histoire génétique. Pour commencer cette procédure, transférez les embryons positifs pour la GFP précédemment identifiés dans du PBS stérile refroidi sur glace, dans une boîte de culture cellulaire, à l'aide de fines ciseaux. Retirez la partie céphalique d'un embryon en effectuant une coupe transversale coddled à rommy.

Ensuite, retirez la portion rostrale de la tête à l'aide d'une incision coronaire traversant le céphalon. Cela mettra en évidence une structure en forme de tube dans laquelle le quatrième ventricule, traversant la vésicule mésocéphalique, forme un conduit entre les tissus dorsal et ventral. Insérez soigneusement la pointe des ciseaux dans le quatrième ventricule et sectionnez le long de la ligne médiane dorsale jusqu'à l'extrémité rostrale, ouvrant complètement le tube, afin de créer une préparation en livre ouvert.

Le mésencéphale ventral sera désormais exposé médialement. Alors que les deux moitiés dorsales du mésencéphale se trouveront latéralement, il peut être nécessaire d'éliminer tout tissu non neural restant sous le mésencéphale ventral. Pour que l'explants s'étale à plat, il doit maintenant ressembler à un papillon dont les ailes sont représentées par le mésencéphale dorsal et la queue par le thrombo mere one.

Pour isoler davantage le mésencéphale ventral en vue d'une analyse par fax ou d'expériences de culture cellulaire, retirez les régions latérales du tissu. Nous allons maintenant présenter quelques résultats représentatifs de la MIGF. Dans cette expérience, les cellules exprimant WINT un, marquées à E 8,5, sont visualisées afin de déterminer comment les cellules dirigées par wint un contribuent aux structures nerveuses au cours du développement.

Par exemple, chez les embryons C EER MG FP à E 12,5, la fluorescence GFP apparaît principalement dans le mésencéphale, le métencéphale postérieur et la moelle épinière ; en fort grossissement, on observe de fines projections neuronales innervant ces régions. Les cellules marquées dans la paroi du tronc, les membres, ainsi que dans les régions crânio-faciales peuvent également être visualisées et analysées au niveau cellulaire par immunohistochimie. Comme illustré sur cette coupe optique d’un embryon de 1 µm d’épaisseur à E 12,5, marquée par administration de tamoxifène à E 8,5, l’étiquetage par anticorps anti-bêta-galactosidase en rouge et l’étiquetage par anticorps anti-GFP en vert indiquent des cellules dont le destin développemental a été cartographié, visibles dans le mésencéphale ventral.

Ici, les cellules combinées sont doublement positives en raison de la nature du rapporteur conditionnel MGFP dans le cerveau adulte. La densité du tissu mature peut masquer la fluorescence GFP émanant des structures cérébrales internes. Par conséquent, la microscopie de fluorescence en montage entier révèle uniquement une faible fluorescence GFP dans la région supérieure du CUI de l'adulte lors de l'évaluation du gain.

Une lignée marquée à E 8,5 sur des coupes adultes observées par microscopie à faible grossissement révèle que la lignée WIN donne naissance à des structures du mésencéphale, notamment au colliculus supérieur et inférieur. Sur cette image à plus fort grossissement, prise dans la région ventrale du mésencéphale à proximité des neurones dopaminergiques, on observe des cellules positives pour la bêta-galactosidase nucléaire et un dense plexus axonal positif pour la GFP, mis en évidence par contraste. Un marquage effectué à E 9,5 entraîne une étiquetage GFP important, facilement observable dans le colliculus inférieur du mésencéphale par fluorescence sur montage entier. La lignée WINT marquée à E 9,5 sur des coupes adultes est concentrée dans le colliculus inférieur, comme le montre l'observation en microscopie à faible grossissement.

Dans cette image à plus fort grossissement, prise dans le mésencéphale ventral des neurones dopaminergiques, on observe des cellules positives pour la bêta-gal nucléaire et un riche plexus axonal positif pour la GFP. Ainsi, alors que les neurones dérivés de WIN1, marqués à E 8,5 par rapport à E 9,5, contribuent de manière de plus en plus restreinte au mésencéphale dorsal, la lignée WIN1 persiste dans sa contribution au mésencéphale ventral.

Nous venons de vous montrer la procédure de cartographie génétique inductible du destin cellulaire permettant de marquer et de suivre les lignées cellulaires in vivo. Cela nous permet de marquer les cellules en fonction de leur lignée génétique et de les suivre dans le temps, même après l'extinction de l'expression génique. Grâce à l'administration de tamoxifène à huit semaines et demie, nous avons montré que le domaine wit un contribue au mésencéphale en développement ainsi qu'à l'ensemble du mésencéphale chez l'adulte.

En revanche, l'administration de tamoxifène à neuf jours et demi, lorsque le domaine wit1 devient restreint, entraîne une contribution plus limitée au mésencéphale en développement au cours de l'embryogenèse, contribution qui persiste à l'âge adulte. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de prendre en compte que le système marque les cellules de manière mosaique, et par conséquent, toutes les cellules d'une structure particulière ne sont pas nécessairement marquées. Ceci est probablement dû à la lignée CRE-ER ou à l'allèle rapporteur conditionnel utilisée.

Importamment, bien que le marquage cellulaire soit en mosaique, le motif et la répartition des cellules marquées sont hautement reproductibles. Nous avons constaté que l'administration de tamoxifène par gavage oral présente un avantage par rapport à l'injection intrapéritonéale, car elle minimise l'inflammation de l'espace intrapéritonéal ainsi que les dommages mécaniques aux embryons. Voilà donc tout.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.