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A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Une approche pratique de la cartographie inductible destin génétique: un guide visuel à Mark et Track Cellules In Vivo

Full Text

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13:36 min

December 30, 2009

DOI: 10.3791/1687-v

Ashly Brown¹, Stephen Brown², Debra Ellisor², Nellwyn Hagan¹, Elizabeth Normand¹, Mark Zervas²

¹Department of Neuroscience, Division of Biology and Medicine,Brown University, ²Department of Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Division of Biology and Medicine,Brown University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Summary

Cartographie génétique inductible Fate (GIFM) les marques et les cellules des pistes avec un contrôle spatial et temporel bien

Transcript

Les cartes du devenir sont générées en marquant et en suivant les cellules in vivo afin de déterminer comment les progéniteurs contribuent à des structures et à des types de cellules spécifiques dans les tissus en développement et adultes. Et l’avancée de ce concept est la cartographie du destin inductible génétique, ou GIFM, reliant l’expression des gènes, le sulfate et les comportements cellulaires in vivo pour créer des cartes de destin basées sur la lignée génétique. Bonjour, je m’appelle Deborah Ellisor du Mark Services Laboratory et du département de biologie moléculaire, de biologie cellulaire et de biochimie de l’Université Brown.

Aujourd’hui, mes collègues Ashley Brown, Liz Norman Neen Hagen, Steve Brown et moi-même allons faire la démonstration d’une procédure de cartographie du devenir inductible génétique. Nous utilisons cette procédure en laboratoire pour étudier le développement précoce du cerveau. Nous pouvons également appliquer cette technique à des études d’inactivation de gènes et à des modèles animaux de maladies humaines.

Commençons donc par les embryons X cre, E-R-M-G-F-P. MGFP LAE est un allèle rapporteur présent dans toutes les cellules représentées par des ovales gris X cre, er, où X représente des éléments régulateurs de gènes. Le contrôle de l’expression de C ER est spatialement limité au domaine d’expression du gène X montré en bleu et la protéine CRE ER est séquestrée dans le cytoplasme par HSP 90.

L’administration de tamoxifène entraîne la mise en place de cellules dont le destin est cartographié dans le domaine X, car la CER libérée par HSP 90 se déplace vers le noyau et retire la cassette d’arrêt de l’allèle rapporteur. La combinaison de l’allèle rapporteur CER et du tamoxifène entraîne un marquage lorsqu’une population cellulaire est initialement marquée dans une région cérébrale primordiale de l’embryon sur la base de l’expression génique, ces cellules cartographiées sont suivies même après l’extinction de l’expression génique initiale utilisée pour piloter CER.

De cette façon. La distribution finale et le devenir final d’une lignée cellulaire génétiquement définie peuvent être identifiés chez l’adulte. Cette procédure commence par la préparation d’une solution de tige de 20 milligrammes par millilitre de tamoxifène, la dissolution de 200 milligrammes de tamoxifène dans 10 millilitres d’huile de maïs d’avant-guerre dans un flacon d’inhalation en verre.

Ensuite, incubez la solution à 37 degrés Celsius pendant deux heures sur un vortex Tator. La solution protège par intermittence la solution mère de tamoxifène préparée de la lumière en enveloppant le flacon avec une feuille d’aluminium et en la stockant à quatre degrés Celsius. Le stock peut être utilisé jusqu’à un mois.

Pour les expériences de cartographie du devenir, établissez un couple reproducteur composé d’une femelle Webster suisse de type sauvage et d’un mâle porteur à la fois d’un allèle CreER spécifique au gène et d’un allèle rapporteur. Pour les besoins de cette démonstration, nous utiliserons une victoire à un CreER MG FP mâle. Vérifiez chaque matin la femelle Swiss Webster pour détecter l’apparition d’un bouchon vaginal.

Désignez le matin du jour du plug vaginal comme étant 0,5 jour après le cotus et calculez la date d’administration du tamoxifène. Sur la base de ce point de départ de cette expérience, le tamoxifène sera administré au jour embryonnaire 8,5. À l’aide d’une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille d’alimentation animale, prélevez 200 microlitres de la solution de tige de tamoxifène.

Retenez fermement la femelle Swiss Webster enceinte en saisissant le poil du cou et du dos pour immobiliser la tête et retournez la souris de manière à ce que la face ventrale soit tournée vers le haut. Tenez la queue entre vos doigts libres pour garder le corps en ligne droite. Ensuite, placez l’aiguille d’alimentation dans le coin de la bouche et guidez doucement l’aiguille parallèlement au toit de la bouche jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille d’alimentation soit à peu près à la position de l’œil.

Inclinez doucement la tête vers l’arrière pour accéder à l’œsophage. Guidez l’aiguille au-delà de l’épiglotte et descendez dans l’œsophage vers l’estomac. Attention à ne pas entrer dans la trachée.

Une fois que l’aiguille d’alimentation est dans l’estomac, administrez le tamoxifène et retirez l’aiguille. Remettez ensuite la femelle dans sa cage d’origine jusqu’à la date de la dissection. À la date de la dissection, les embryons E 12.5 de la femelle enceinte sont disséqués librement, puis évalués pour le marquage GFP.

Chez un embryon positif à la GFP, nous observons que les neurones dérivés du vent contribuent au mésencéphale, au dorlotage du cerveau postérieur et à la moelle épinière. Le rapporteur MG FP marque les projections axonales, qui peuvent également être vues transférer des embryons positifs à la GFP par montage à domicile dans une boîte de Pétri contenant du PPS et les photographier à l’aide d’un cadre photo Une fois que les embryons ont été photographiés, utilisez une pince pour pincer un petit morceau de queue de chaque embryon et placez chaque morceau dans un tube PCR. Les tissus seront génotypés à l’aide de la PCR pour les deux allèles afin de confirmer les résultats obtenus par l’analyse de l’ensemble du montage.

Les procédures suivantes nous permettent d’analyser comment les cellules marquées dérivées des régions embryonnaires peuplent le cerveau adulte avant de commencer la craniotomie. Confirmé par une pincée de l’orteil que la souris est entièrement innue. Les initiés avec le nembutal effectuent des incisions pour accéder au cœur à travers la cage thoracique.

Ensuite, placez une aiguille papillon dans l’apex ou le ventricule gauche du cœur et fixez-la avec la pince en C. Créez un site d’évacuation de liquide dans l’oreillette droite avec des ciseaux, puis perfuser avec 10 à 15 millilitres de solution saline glacée jusqu’à ce que le liquide soit clair. Suivi de 20 à 25 millilitres de 4 % d’aldéhyde paraforme.

Lorsque la profusion intracardiaque est terminée, retirez la tête avec des ciseaux en coupant la colonne vertébrale juste au-dessus des épaules. Passez un scalpel le long de la ligne médiane dorsale de la tête, rostrale de cottle pour couper le cuir chevelu et exposer le crâne en S. À l’aide du scalpel, grattez tout excès de tissu ou de muscle sur le côté et à l’arrière du crâne.

À l’aide d’une pince, percez le crâne sur la ligne médiane, juste rostral jusqu’aux bulbes olfactifs et créez un petit trou pour accueillir les pointes de ciseaux fins. Insérez les ciseaux fins dans ce trou et faites deux incisions bilatérales à partir de la ligne médiane en suivant la longueur des bulbes olfactifs. Cette coupure brisera le crâne à l’intersection de l’os nasal et de l’os frontal et offrira un bon accès aux ciseaux.

Coupez le long des sutures sagittales du crâne, en veillant à garder les pointes des ciseaux inclinées loin du cerveau pour éviter d’endommager les tissus sous-jacents. Ensuite, saisissez doucement le crâne avec une pince et retirez l’os le long de l’incision médiale pour exposer le cerveau. Le crâne peut s’écailler en petits morceaux ou se détacher en sections plus grandes.

Continuez à utiliser la pince pour enlever tous les os pariétaux frontaux, interpariétaux et occipitaux. Libérez les para oculi situés le long des bords latéraux du cerveau au niveau du cervelet en pinçant doucement les os sphériques de chaque côté. À l’aide de ciseaux, vous coupez soigneusement la partie dorsale de l’os qui entoure le tronc cérébral.

Insérez un côté des ciseaux juste en dessous du bord dorsal de l’os, en commençant par l’endroit où la moelle épinière a été coupée et en coupant vers le cervelet. Pour libérer le tronc cérébral et le cervelet. Retirez l’os restant autour du tronc cérébral à l’aide de la pince.

Retirez doucement les os, tournez la tête du côté dorsal vers le bas et utilisez la pince pour sectionner les nerfs crâniens et libérer le cerveau du crâne. Placez le cerveau dans une boîte de Pétri de glace. Évaluez le marquage GFP dans le cerveau adulte, à l’aide d’une lunette de dissection fluorescente et photographiez à l’aide d’un cadre photo.

Dans cet exemple, le mésencéphale est marqué par la GFP en plus de son utilisation pour l’analyse de la lignée pendant l’embryogenèse et chez l’adulte, la GIFM peut être combinée avec d’autres applications couramment utilisées en biologie du développement telles que la micro-dissection et les expériences d’explants de tissus. Par exemple, le mésencéphale ventral est la zone progénitrice du développement des neurones dopaminergiques qui expriment le gène du vent. Ainsi, l’isolement du mésencéphale ventral par microdissection permet d’établir un cadre in vitro pour étudier davantage son développement.

Ce n’est qu’un exemple de l’utilisation de GIFM pour isoler une zone d’intérêt progénitrice définie par l’histoire génétique. Pour commencer cette procédure, transférez les embryons positifs à la GFP précédemment identifiés dans du PBS stérile glacé dans une boîte de culture cellulaire à l’aide de ciseaux fins. Retirez la partie de la tête d’un embryon en le coupant transversalement dorloté en rommy.

Ensuite, retirez la partie rostrale de la tête avec une coupe coronale à travers le céphalon. Cela exposera une structure en forme de tube dans laquelle le quatrième ventricule à travers la vésicule mésocéphale forme un conduit entre les tissus dorsaux et ventraux. Insérez soigneusement les pointes des ciseaux dans le quatrième ventricule et coupez le long de la ligne médiane dorsale dorlotée à rostrale en ouvrant complètement le tube, créant ainsi une préparation à livre ouvert.

Le mésencéphale ventral sera maintenant exposé médialement. Bien que les deux moitiés dorsales du mésencéphale résident latéralement, il peut être nécessaire d’enlever tout tissu non neural restant sous le mésencéphale ventral. Pour que l’explan soit plat, il doit maintenant ressembler à un papillon chez lequel le mésencéphale dorsal représente les ailes et le thrombo simplement la queue.

Pour isoler davantage le mésencéphale ventral pour une analyse par fax ou des expériences de culture cellulaire, retirez les aspects latéraux du tissu. Nous allons maintenant montrer quelques résultats représentatifs de GIFM. Dans cette expérience, les cellules exprimant WINT one marquées à E 8.5 sont visualisées pour déterminer comment les cellules directes de Wint One contribuent aux structures neuronales tout au long du développement.

Par exemple, les embryons d’un seul C EER MG FP à E 12,5 présentent une fluorescence GFP principalement dans le mésencéphale, le cerveau postérieur postérieur et la moelle épinière à fort grossissement. Les cellules marquées de la paroi du corps du mésencéphale, des membres et de la région faciale crânienne peuvent également être visualisées et analysées au niveau cellulaire par immunohistochimie. Comme le montre cette coupe optique d’un micromètre d’épaisseur d’un embryon E 12.5 marqué par l’administration de tamoxifène à E 8.5, le marquage des anticorps nucléaires bêta-galacto en rouge et le marquage des anticorps GFP en vert indiquent des cellules dont le destin est indiqué dans le mésencéphale ventral.

Ici, les cellules combinées sont doublement positives en raison de la nature du rapporteur MGFP conditionnel dans le cerveau adulte. La densité des tissus matures peut masquer la fluorescence de la GFP émanant des structures cérébrales internes. Par conséquent, la microscopie à fluorescence à monture entière ne révèle qu’une faible fluorescence GFP dans l’IUC supérieure de l’adulte évaluant la victoire.

Une lignée marquée à E 8,5 sur des coupes adultes avec une microscopie à faible grossissement révèle que la lignée WIN one donne naissance à des structures cérébrales moyennes, y compris le cui supérieur et inférieur. Dans cette image à plus fort grossissement prise du mésencéphale ventral à proximité des neurones dopaminergiques, des cellules nucléaires bêta-cal positives et un plexus axonal riche en GFP positif peuvent être observés en contraste, le marquage à E 9,5 entraîne un marquage GFP substantiel qui est facilement observé dans le col inférieur du mésencéphale par fluorescence de monture entière. La lignée WINT one marquée à E 9,5 sur les coupes adultes est concentrée dans le kaulu inférieur, comme on le voit avec la microscopie à faible grossissement.

Dans cette image à plus fort grossissement prise du mésencéphale ventral dans les neurones dopaminergiques, on peut voir des cellules nucléaires bêta-gel positives et un plexus axonal riche en GFP positif. Ainsi, alors que les neurones dérivés de Win One sont marqués à E 8,5 contre E 9,5 sont progressivement limités dans leur contribution au mésencéphale dorsal. La lignée WIN one persiste à contribuer au mésencéphale ventral.

Nous venons de vous montrer la procédure de cartographie du destin inductible génétique pour marquer et suivre les lignées cellulaires in vivo. Cela nous permet de marquer les cellules en fonction de leur lignée génétique et de les suivre au fil du temps, même après l’extinction de l’expression des gènes. Avec le tamoxifène administré à huit ans et demi, nous avons montré que le domaine with one contribue au développement du mésencéphale en plus de l’ensemble du mésencéphale chez l’adulte.

En revanche, l’administration de tamoxifène à neuf ans et demi lorsque le domaine de l’esprit devient restreint entraîne une contribution plus restreinte au mésencéphale en développement pendant l’embryogenèse, qui persiste chez l’adulte. Lors de cette procédure, il est important de tenir compte du fait que le système marque les cellules en mosaïque et que, par conséquent, toutes les cellules d’une structure particulière ne peuvent pas être étiquetées. Cela est probablement dû à la lignée CRE er ou à l’allèle rapporteur conditionnel utilisé.

Il est important de noter que, bien que le marquage cellulaire soit en mosaïque, le motif et la distribution des cellules marquantes sont hautement reproductibles. Nous avons constaté que l’administration de tamoxifène par gavage oral est avantageuse par rapport à l’administration par injection interpéritonéale car elle minimise l’inflammation dans l’espace interpéritonéal ainsi que les dommages mécaniques aux embryons. Donc c’est tout.

Merci d’avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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