Transgénèse vectorielle miniCoopR : une technique de criblage des gènes induisant le mélanome dans un modèle de tumeur de poisson-zèbre

- Chez le poisson-zèbre, le mélanome résulte de la transformation maligne des mélanocytes - les cellules productrices de mélanine. Pour étudier l’apparition du mélanome, utilisez un modèle de poisson-zèbre transgénique sujet au mélanome et déficient en mélanocytes. Ce modèle est dépourvu de mélanocytes en raison d’une mutation de perte de fonction dans son promoteur mitfa spécifique aux mélanocytes.

Commencez par prélever un embryon unicellulaire de ce modèle transgénique sur une plaque de gélose. Co-injecter dans l’embryon un mélange contenant un vecteur miniCoopR basé sur un transposon et des ARNm de l’enzyme transposase. Le vecteur contient une cassette de gènes, comprenant un minigène mitfa porteur d’un promoteur couplé à un gène candidat pris en sandwich entre deux éléments de transposon.

Les ARNm co-injectés codent pour les protéines transposases. Ces protéines agissent sur les éléments transposons et catalysent l’excision de la cassette du vecteur miniCoopR, suivie de son intégration dans l’ADN génomique de l’embryon. Par la suite, le promoteur de la cassette pilote l’expression à la fois du gène mitfa et du gène candidat d’intérêt.

Le gène mitfa soutient le sauvetage et le développement des mélanocytes, tandis que le gène candidat, s’il est oncogène, induit l’apparition du mélanome. Examinez le poisson-zèbre développé. Les poissons transgéniques avec des mélanocytes sauvés développent une pigmentation de la mélanine, tandis que ceux porteurs de mélanomes portent des lésions pigmentaires surélevées.

Dans le protocole suivant, nous montrerons le criblage des modificateurs d’apparition du mélanome à l’aide de vecteurs miniCoopR dans des modèles de tumeurs transgéniques de poisson-zèbre.

- Pour générer des constructions à injecter, commencez par créer des clones d’entrée intermédiaire de Gateway par PCR en amplifiant le cadre de lecture ouvert complet des gènes d’intérêt et en les recombinant en pDONR221. Ensuite, utilisez la technologie Multisite Gateway pour recombiner le promoteur mitfa spécifique au mélanocyte, le gène d’intérêt et le signal de polyadénylation dans le vecteur miniCoopR afin de placer les gènes d’intérêt sous le contrôle du promoteur mitfa.

Injectez 25 picogrammes de chaque clone ainsi que 25 picogrammes d’ARNm de la transposase Tol2 dans des embryons de poisson-zèbre unicellulaire, transgéniques et triplement homozygotes. Les animaux mutants mitfa-BRAF-p53 sont déficients en mélanocytes et sujets à la transformation et à la formation de mélanomes. En plus du gène d’intérêt, le vecteur miniCoopR contient un minigène mitfa sauveteur. Ainsi, les animaux injectés avec succès développeront des mélanocytes sauvés, qui expriment le gène d’intérêt.

Incuber les embryons injectés à 28,5 degrés Celsius. À 24 heures après la fécondation, ou hpf, retirez tous les embryons morts. 72 heures après la fécondation, à l’aide d’un microscope de dissection sous lumière incidente sur fond blanc, sélectionner des animaux transgéniques avec des mélanocytes sauvés.

Lorsque les animaux atteignent 4 jours après la fécondation, transférez-les dans des réservoirs de 3 litres dans la nurserie de l’installation du poisson zèbre. À l’âge de 2 mois, sélectionnez les animaux dont au moins une zone de sauvetage de mélanocytes est supérieure à 4 millimètres carrés. Dépister chaque semaine les animaux sélectionnés pour détecter la présence de tumeurs. Isolez des animaux porteurs de tumeurs pour l’étude.

Dessinez des courbes de survie sans mélanome avec l’âge et les semaines sur l’abscisse et le pourcentage de survie sans mélanome sur l’ordonnée. Comparez des animaux avec des mélanocytes qui expriment un gène d’intérêt pour contrôler les animaux qui expriment l’EGFP dans les mélanocytes. Utilisez un test de log-rank pour déterminer si les deux courbes sont statistiquement différentes.