Ablation sélective assistée par laser des cellules endothéliales cornéennes porcines : une technique pour induire des lésions endothéliales cornéennes porcines focalisées pour des études ex vivo

La couche la plus interne de la cornée porcine - la partie avasculaire transparente de l’œil avant - est constituée de cellules endothéliales cornéennes, ou CEC, soutenues par la membrane basale - la membrane de Descemet, ou DM. Les CEC maintiennent la transparence cornéenne et une vision optimale. Tout dommage à ceux-ci pourrait affecter la vision.

Pour les dommages sélectifs à la CEC, commencez par un œil de porc fraîchement récolté dans un milieu approprié. Retirez les tissus environnants. Traitez l’œil avec un désinfectant approprié pour éliminer la contamination microbienne de surface. Après le lavage salin, examinez optiquement l’œil antérieur pour exclure toute anomalie avant l’irradiation laser.

Fixez l’œil dans un appareil de maintien personnalisé devant une unité de lampe à fente équipée d’un laser d’une longueur d’onde spécifique. Visualisez les différentes couches cornéennes. Avec l’énergie laser appropriée et la position du point focal, dirigez les impulsions laser vers la couche endothéliale cornéenne. Les impulsions focalisées, de courte durée et de haute puissance, provoquent une rupture sélective de la CEC de la surface exposée tout en évitant la diffusion de chaleur, protégeant ainsi le DM ou le tissu stromal.

En créant un port d’entrée près du limbe - la jonction cornéo-sclérale, injectez une solution viscoélastique dans la chambre antérieure contenant la cornée pour la stabiliser et protéger les CEC restants. Exciser et transférer le segment cornéen traité au laser dans une plaque multipuits contenant un milieu, côté CEC vers le haut. Le modèle ex vivo de lésion de l’endothélium cornéen peut être utilisé pour des études ultérieures.

Après avoir obtenu des yeux de porc fraîchement énucléés de l’abattoir local, placez les échantillons à 4 degrés Celsius, à pleine moyenne. Utilisez des ciseaux pour enlever les tissus extracellulaires et trempez les yeux dans une solution ophtalmique de povidone iodée à 5 % pendant cinq minutes. Ensuite, placez les échantillons désinfectés dans du PBS stérile à température ambiante.

À l’aide d’un appareil de tomographie par cohérence optique dans le domaine spectral, dépister les yeux pour détecter les principales pathologies du segment antérieur, telles que les cicatrices cornéennes, l’œdème et d’autres opacités. Après le dépistage, positionnez les yeux devant une unité de lampe à fente équipée d’un laser Nd :YAG d’une longueur d’onde de 1064 nanomètres, et d’un diamètre de point focal de 10 micromètres dans l’air. Sélectionnez le grossissement 12X et déviez l’éclairage pour visualiser les couches cornéennes individuelles.

Après avoir réglé l’énergie d’impulsion et le point focal sur les paramètres appropriés pour l’ablation sélective des cellules endothéliales cornéennes, appliquez plusieurs tirs laser sur le tissu. Ensuite, sous un microscope à dissection, placez une paracentèse cornéenne claire près du limbe et injectez du viscoélastique pour stabiliser la chambre intérieure. Ensuite, utilisez un trépan de 8 millimètres pour exciser la cornée centrale traitée au laser et placez la cornée isolée dans un puits d’une plaque à 12 puits, côté endothélial vers le haut. Lorsque toutes les cornées ont été prélevées, ajoutez 3 millilitres de milieu complet à chaque puits d’échantillon et incubez les échantillons jusqu’à trois jours à 37 degrés Celsius.