Réaction en chaîne par polymérase de microsphères pour amplifier l’ADN simple brin

La PCR des microsphères utilise une sphère de taille microscopique couplée à des oligonucléotides à leur surface, ce qui permet l’amplification préférentielle de l’ADN simple brin.

Pour commencer la PCR des microsphères, prenez un mélange réactionnel contenant des brins d’ADN simple brin matrice, des amorces directes avec un marqueur nucléotidique supplémentaire, de l’ADN polymérase thermostable, des dNTP et des microsphères présentant des sondes oligonucléotidiques simple brin

Placez le tube dans un thermocycleur et faites-le fonctionner dans les conditions définies.

Dans le premier cycle, à la température de recuit, l'ADN matrice se lie à la sonde à la surface de la microsphère, de sorte que l'ADN matrice fonctionne comme le brin sens. Pendant l’extension, la polymérase étend l’ADN et le duplex reste attaché à la microsphère.

Au cours du cycle suivant, lors de la dénaturation, l’ADN matrice se sépare de la microsphère, laissant le brin de la sonde lié à la surface, servant de matrice pour un nouveau brin.

Pendant le recuit, l’amorce marquée se lie au brin antisens. Plus tard, la polymérase l’étend pour synthétiser le brin sens avec l’étiquette nucléotidique.

Répétez le cycle plusieurs fois pour générer plusieurs copies de l’ADN simple brin détecte, qui entrent dans la solution, tandis que les contaminants double brin restent attachés.

Transférez les produits PCR dans un tube contenant un tampon de chargement. Chargez le produit et les marqueurs dans différents puits du gel et séparez-les à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose.

Les ADN matriciels forment une bande de faible poids moléculaire, tandis qu’une bande intense de haut poids moléculaire confirme l’amplification de l’ADN simple brin.