Dosage par transfert Western chimiluminescent pour le traitement des protéines

CD95 – un récepteur de mort – se lie à ses anticorps agonistiques, déclenchant l’assemblage d’un complexe de signalisation induisant la mort, ou DISC – un complexe multiprotéique qui recrute la procaspase 8. Au niveau du DISC, la procaspase 8 se dimérise et se transforme en divers produits de clivage intermédiaires et, enfin, en une forme active qui initie l’apoptose.

Pour analyser le traitement de la caspase-huit à l’aide d’un western blot chimiluminescent, prélever un lysat contenant des produits de clivage intermédiaires de la caspase 8 associés à DISC dans un tube. Complétez cela avec des anticorps anti-CD95 capturés par des billes de protéine A-agarose. Les anticorps anti-CD95 se lient au composant DISC, CD95, formant des complexes protéiques.

Chargez l’échantillon sur un gel de polyacrylamide SDS pour séparer les intermédiaires de la caspase 8 immunoprécipitée de différentes tailles en bandes distinctes. Placez le gel sur une membrane buvard et appliquez un courant électrique. Les intermédiaires de la caspase 8 sortent du gel sur la membrane de transfert.

Traitez la membrane avec une solution contenant des protéines bloquantes pour saturer les sites de liaison aux protéines, empêchant ainsi les liaisons non spécifiques.

Ajoutez une solution d’anticorps primaires, qui se lient aux produits de caspase-huit à un site spécifique.

Ajoutez des anticorps secondaires marqués d’enzymes qui se lient spécifiquement à la région Fc complémentaire de l’anticorps primaire pour former un complexe de produit de clivage caspase-huit-anticorps primaire-anticorps secondaire.

Ajoutez un substrat chimiluminescent qui réagit avec l’enzyme secondaire conjuguée aux anticorps et émet de la lumière. L’intensité de la lumière émise est en corrélation avec la quantité de produit de clivage caspase-huit.