La purification d'affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

Le but global de cette méthode de purification par affinité en tandem est d'isoler des complexes protéiques exprimés à partir de cellules eucaryotes afin de caractériser biochimiquement leurs assemblages moléculaires, d'identifier de nouveaux intermédiaires et les modifications post-traductionnelles qui régulent leur fonction. Cette méthode permet la purification de complexes protéiques intacts à partir de cellules eucaryotes, dans le but d'identifier de nouveaux intermédiaires ainsi que des modifications post-traductionnelles régulatrices qui ajustent finement leur fonction. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à fournir une pureté et un rendement élevés de complexes protéiques, adaptés à des applications in vitro ultérieures pour l'étude de leur fonction et de leur activité.

Les cellules sont collectées à partir d'une purification par affinité STREP 48 heures après la transfection. Éliminer le milieu et ajouter huit millilitres de PBS froid. Pippeter plusieurs fois pour détacher les cellules de la plaque.

Recueillir et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifuger les cellules à 800 ×g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant de PBS. Centrifuger à nouveau à 800 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius afin d'éliminer tout résidu de PBS.

Pour commencer cette procédure, resuspendre chaque culot cellulaire dans un volume de tampon de lyse passive, ou PLB, égal à cinq fois le volume du culot cellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Vortexer brièvement la suspension, puis agiter en rotation pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Faire centrifuger la suspension cellulaire à 10 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le lysat soluble dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et éliminer le culot cellulaire. Conserver 10 % du volume final du lysat soluble comme témoin d'entrée STREP-AP et le stocker à quatre degrés Celsius.

Il est important d'utiliser des billes STREP pour la première étape de purification par affinité, car les complexes immunoprécipités avec des billes STREP récupèrent significativement plus de protéines que ceux obtenus avec des billes FLAG. À l'aide d'une pipette à embout large, prélevez la quantité appropriée de suspension à 50 % de billes STREP nécessaire à la purification par affinité. Centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Éliminer le surnageant et ajouter 500 microlitres de PLB sur les billes. Agiter doucement le mélange de billes pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger à nouveau.

Après le troisième lavage, éliminer le surnageant et resuspendre les billes dans du PLB jusqu'à un volume final de n fois 40 microlitres, où n correspond au nombre d'échantillons. Ajouter 40 microlitres de suspension de billes STREP à 50 % à chaque échantillon de lysat cellulaire et incuber sous agitation lente pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Pendant cette étape de production et de récupération des protéines, plusieurs plaques de cellules peuvent être utilisées, et les mêmes échantillons protéiques lysés à partir de différentes plaques peuvent être combinés avec une même portion de billes lors de la purification par affinité STREP.

Après avoir incubé les mélanges de lyzat cellulaire et de suspension de billes STREP pendant deux heures, centrifuger à 1 500 × g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Conserver le surnageant comme flux STREP AP et stocker à quatre degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage STREP AP 1 sur les billes.

Agiter doucement les billes dans le mélange tampon pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver à nouveau avec 500 µL de tampon de lavage STREP AP 1. Après le troisième lavage, transférer la solution de billes dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL afin de réduire le fond protéique.

Lavez une quatrième fois avec le tampon de lavage STREP AP un. Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres du tampon de lavage deux. Équilibrez les billes en retournant les tubes, puis centrifugez à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Éluerez la protéine d'intérêt avec 50 microlitres de tampon d'élution STREP. Vortexez à 800 tr/min pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Faire centrifuger les billes à 1 500 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Récupérer le surnageant. Cette fraction correspond à l'échantillon d'élution STREP AP.

Conserver la fraction de billes à quatre degrés Celsius pour une seconde élution. Aliquoter 10 % de l'élution STREP AP pour une coloration argent et/ou un immunoblotting. Pour augmenter la quantité de matériau initial destiné à l'immunoprécipitation FLAG suivante, les première et seconde élutions STREP peuvent être regroupées afin d'obtenir une récupération plus efficace de l'élution FLAG.

Commencez cette procédure en utilisant une pipette à embout large pour transférer la quantité appropriée de solution de billes FLAG dans un tube de microcentrifugation. Faites centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Éliminez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage FLAG aux billes.

Centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver à nouveau avec le tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, retirer le surnageant et resuspendre les billes dans le tampon de lavage FLAG jusqu'à un volume final de n fois 16 microlitres, où n est le nombre d'échantillons.

Ajouter 16 microlitres de la suspension de billes FLAG à l'élution STREP AP restante et agiter en rotation toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après une incubation nocturne de la suspension de billes FLAG et de l'élution STREP AP, procéder à l'immunoprécipitation FLAG. Centrifuger la suspension de billes FLAG à 1 500 × g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Conserver le surnageant comme flux sortant de l'IP à la FLAG et stocker à quatre degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage FLAG sur les billes. Agiter doucement par basculement pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius puis centrifuger à 1 500 × g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et effectuez un nouveau lavage avec 500 microlitres de tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, transférez la solution de billes protéiques dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre afin de réduire le fond parasite. Effectuez un quatrième lavage avec le tampon de lavage FLAG.

Éliminer le surnageant après la dernière centrifugation et ajouter aux billes 30 microlitres de tampon de lavage FLAG contenant 200 nanogrammes par microlitre de peptide FLAG. Vortexer à 800 tr/min pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après deux heures, centrifuger la suspension à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Récupérez le surnageant et conservez-le à quatre degrés Celsius comme éluat de l'immunoprécipitation FLAG. Dans cette vidéo, la purification par affinité en tandem, ou méthode TAP, a été appliquée au complexe Cycline-T1 CDK9. La Cycline-T1 marquée par une étiquette STREP et le CDK9 marqué par une étiquette FLAG ont été surexprimés dans des cellules HEK293 T.

Une expérience réciproque a également été réalisée avec la CDK9 marquée par une étiquette STREP et la Cycline-T1 marquée par une étiquette FLAG. L'analyse par immunotransfert montre que la CDK9 marquée par l'étiquette FLAG a été co-éluée avec la Cycline-T1 marquée par l'étiquette STREP à partir des billes STREP, mais pas dans le contrôle négatif, l'AP ne contenant pas de Cycline-T1 marquée par l'étiquette STREP. Les deux protéines ont été détectées dans l'élution FLAG, ce qui a confirmé davantage la formation du complexe.

Les résultats TAP réciproques montrent que la cycline T1 marquée par FLAG co-élue avec la CDK9 marquée par STREP, confirmant davantage que l'interaction entre la cycline T1 et la CDK9 est indépendante des épitopes utilisés. Les résultats de la TAP et de la TAP réciproque ont également été analysés par coloration argent. Les astérisques indiquent les impuretés co-éluées.

La protéine CDK9 marquée par le marqueur FLAG a été co-éluée avec la Cycline-T1 marquée par le marqueur STREP à partir des billes STREP, mais pas à partir de l'AP témoin. Lors de l'élution suivante avec le marqueur FLAG, la Cycline-T1 marquée STREP a été co-éluée avec le CDK9 marqué FLAG à partir des billes FLAG. De même, la Cycline-T1 marquée FLAG a été co-éluée avec le CDK9 marqué STREP à partir des billes STREP, mais pas à partir de l'AP témoin. Le complexe protéine-protéine a été efficacement récupéré après la deuxième étape d'IP avec le marqueur FLAG. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours, à compter du moment où les cellules sont prêtes à être collectées, à condition qu'elle soit effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de penser à augmenter en conséquence le nombre de plaques cellulaires par expérience afin de garantir une récupération et une détection suffisantes de protéines. Par exemple, pour identifier de nouvelles sous-unités régulatrices et/ou étudier les modifications post-traductionnelles des sous-unités du complexe. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient les interactions protéine-protéine, leur permettant d'explorer de nouveaux intermédiaires et les modifications post-traductionnelles dans les cellules eucaryotes.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et caractériser des protéines à l'aide de marqueurs STREP et FLAG.