La purification d'affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

L’objectif global de cette méthode de purification par affinité en tandem est d’isoler les complexes protéiques exprimés à partir de cellules eucaryotes pour la caractérisation biochimique et les assemblages moléculaires, ainsi que pour l’identification de nouveaux interacteurs et de modifications post-traductionnelles qui régulent leur fonction. Cette méthode permet de purifier des complexes protéiques intacts à partir de cellules eucaryotes, afin d’identifier de nouveaux interacteurs et des modifications post-traductionnelles régulatrices qui affinent leur fonction. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une grande pureté et un rendement élevés de complexes protéiques pour des applications in vitro en aval afin d’étudier leur fonction et leur activité.

Les cellules sont prélevées à partir de la purification par affinité STREP 48 heures après la transfection. Retirez le support et ajoutez huit millilitres de PBS froid. Pipette de haut en bas pour détacher les cellules de la plaque.

Recueillez et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et faites tourner les cellules à 800 fois g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant PBS. Tournez à 800 fois g pendant une minute à quatre degrés Celsius pour éliminer tout PBS résiduel.

Pour commencer cette procédure, remplacez chaque pastille cellulaire en suspension dans cinq fois le volume de la pastille cellulaire du tampon de lyse passive, ou PLB. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Faites tourner brièvement la suspension et laissez agir pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.

Faites tourner la suspension cellulaire à 10 000 fois g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le lysat soluble dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et jetez la pastille de cellule. Économisez 10 % du volume final du lysat soluble en tant qu’entrée STREP-AP et stockez-le à quatre degrés Celsius.

Il est important d’utiliser des billes de STREP pour la première étape de purification d’affinité, car les complexes tirés vers le bas avec des billes de STREP récupèrent beaucoup plus de protéines que ceux tirés vers le bas avec les billes FLAG. À l’aide d’une pointe de pipette à large ouverture, prélevez la quantité appropriée de suspension de billes de STREP à 50 % pour la purification par affinité. Faites tourner à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de PLB aux billes. Nutez le mélange de perles pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Tournez à nouveau.

Après le troisième lavage, retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans la PLB jusqu’à un volume final de n fois 40 microlitres, où n est le nombre d’échantillons. Ajoutez 40 microlitres de boue de billes de STREP à 50 % à chaque échantillon de lysat cellulaire et nutez pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Au cours de cette production et de cette récupération de protéines, plusieurs plaques de cellules peuvent être utilisées, et les mêmes échantillons de protéines lysés à partir de différentes plaques peuvent être combinés avec une portion de billes lors de la purification par affinité STREP.

Une fois que les mélanges de lysat cellulaire et de billes de streptocoque ont incubé pendant deux heures, faites-les tourner à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Conservez le surnageant au fur et à mesure que le STREP AP circule et stockez-le à quatre degrés Celsius. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage STREP AP un sur les billes.

Nuter les billes dans un mélange tampon pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et lavez-le à nouveau avec 500 microlitres de tampon de lavage STREP AP. Après le troisième lavage, transférez la solution de billes dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour réduire le fond protéique.

Lavez une quatrième fois avec le tampon de lavage STREP AP un. Après l’essorage, retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de beurre de lavage deux. Équilibrez les billes en inversant les tubes, puis tournez-les à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant. Éluer la protéine d’intérêt avec 50 microlitres de tampon d’élution STREP. Vortex à 800 tr/min pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Faites tourner les perles à 1 500 fois g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Récupérez le surnageant. Cette fraction correspond à l’échantillon d’élution du STREP AP.

Conservez la fraction des billes à quatre degrés Celsius pour une deuxième élution. Aliquote 10 % de l’élution du STREP AP pour la coloration à l’argent et/ou le Western blot. Afin d’augmenter la quantité de matériau de départ pour l’immunoprécipitation FLAG ultérieure, les première et deuxième élutions STREP peuvent être regroupées pour une récupération plus efficace de l’élution FLAG.

Commencez cette procédure en utilisant une pointe de pipette à large ouverture pour transférer la quantité appropriée de solution de billes FLAG dans un tube de microcentrifugation. Faites tourner à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage FLAG aux billes.

Faites tourner à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Jetez le surnageant et lavez-le à nouveau avec le tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, retirez le surnageant et remettez les billes en suspension dans le tampon de lavage FLAG jusqu’à un volume final de n fois 16 microlitres, où n est le nombre d’échantillons.

Ajoutez 16 microlitres de boue de billes FLAG à l’élution restante de STREP AP et nutez pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après une incubation d’une nuit de la boue de billes FLAG et l’élution de STREP AP, procéder à l’immunoprécipitation FLAG. Faites tourner la suspension de la perle FLAG à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Enregistrez le surnageant au fur et à mesure que l’IP FLAG circule et stockez-le à quatre degrés Celsius. Ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage FLAG aux billes. Nuter pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Jetez le surnageant et lavez-le à nouveau avec 500 microlitres de tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, transférez la solution de billes de protéines dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre pour réduire le bruit de fond. Laver une quatrième fois avec le tampon de lavage FLAG.

Retirez le surnageant de l’essorage final et ajoutez aux billes 30 microlitres de tampon de lavage FLAG contenant 200 nanogrammes par microlitre de peptide FLAG. Vortex à 800 tr/min pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Au bout de deux heures, abaissez la suspension à 1 500 fois g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.

Récoltez le surnageant et stockez-le à quatre degrés Celsius comme élution FLAG IP. Dans cette vidéo, la purification par affinité en tandem, ou méthode TAP, a été appliquée au complexe Cyclin-T1 CDK9. La cycline-T1 marquée STREP et la CKD9 marquée FLAG étaient surexprimées dans les lymphocytes T HEK293.

Une expérience réciproque a également été réalisée avec CDK9 marqué STREP et Cyclin-T1 marqué FLAG. L’analyse par transfert Western montre que CKD9 marqué par FLAG a coélu avec la cycline-T1 marquée par STREP à partir des billes de STREP, mais pas dans le témoin négatif, AP manquant de Cyclin-T1 marqué par STREP. Les deux protéines ont été détectées dans l’élution de FLAG, ce qui a confirmé la formation du complexe.

Les résultats réciproques de TAP montrent que Cyclin-T1 marqué par FLAG a coélu avec CDK9 marqué par STREP, ce qui confirme que l’interaction Cyclin-T1 CDK9 est indépendante des épitopes utilisés. Les résultats du TAP et du TAP réciproque ont également été analysés par coloration à l’argent. Les astérisques indiquent les impuretés coéluées.

FLAG étiqueté CKD9 coélué avec STREP marqué Cyclin-T1 sur les billes de STREP, mais pas sur le témoin AP.In l’élution ultérieure de FLAG, STREP marqué Cyclin-T1 coélué avec FLAG étiqueté CDK9 sur les billes FLAG. De même, FLAG a marqué Cyclin-T1 coelué avec CDK9 marqué STREP sur les billes de STREP, mais pas sur le point d’accès témoin. Et le complexe protéine-protéine a été efficacement récupéré après la deuxième étape de FLAG IP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours, à partir du moment où les cellules sont prêtes à être collectées si elle est effectuée correctement.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler d’augmenter le nombre de plaques cellulaires par expérience en conséquence pour s’assurer qu’une quantité suffisante de protéines peut être récupérée et détectée. Par exemple, identifier les nouvelles sous-unités régulatrices et/ou étudier les modifications post-traductionnelles sur des sous-unités complexes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs étudiant les interactions protéine-protéine pour explorer de nouveaux interacteurs et des modifications post-traductionnelles dans les cellules eucaryotes.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de caractériser les protéines à l’aide de marqueurs STREP et FLAG.