Name: La purification daffinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Apprenez la purification d'affinité en tandem pour isoler des complexes protéiques à partir de cellules eucaryotes. Cette méthode permet d'identifier de nouveaux interacteurs et des modifications post-traductionnelles régulatrices.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses (NIAID) des NIH sous le numéro de bourse R01AI114362 et la subvention I-1782 de la Fondation Welch à Iván D’Orso.

1. Cellules Placage <ol><li> Un jour avant la transfection, la plaque de 3,5 x 10 6 cellules HEK293T dans 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS) et 1% (v / v) de pénicilline / streptomycine (10 000 U / ml stock) par boîte de 100 mm. Planche 3 - 5 boîtes de 100 mm par expérience / la condition pour assurer la récupération des protéines suffisante. REMARQUE: Le nombre de plaques doit être déterminé pour chaque expérience / condition, qui reposera sur les niveaux d&#39;expression et de la solubilité du complexe de protéine d&#39;intérêt. Par ailleurs, si la purification à plus grande échelle est nécessaire, les lignées cellulaires peuvent être adaptées pour se développer dans des suspensions dans des flacons spinner 2, mais cette méthode ne fonctionnera pas pour les transfections transitoires. </li></ol> 2. transfection de cellules ou Induire lignées cellulaires stables <ol><li> Le lendemain, vérifier les cellules au microscope. Les cellules doivent être de 70 - 80% confluentes avant proceeding. </li><li> Transfecter les cellules avec un mélange total de 7 pg d&#39;ADN de plasmide et 21 ul de réactif de transfection par boîte de 100 mm. Transfecter des cellules avec un vecteur exprimant la GFP (Tableau 1) en tant que contrôle pour l&#39; efficacité de la transfection. Remarque: Si l&#39;on utilise un HEK293 T-Rex ou une ligne semblable cellulaire stable qui induit l&#39;expression de deux ou plus complexes des sous - unités en réponse à la doxycycline 14, 15, l&#39;inducteur devra être ajouté aux cellules et incubé pendant 48 heures. De même, une lignée cellulaire stable qui induit l&#39;expression de la GFP lors de l&#39;addition de l&#39;inducteur serait également requis à des fins de validation. Passez à l&#39;étape 2.7. </li><li> Préparer le mélange de transfection par boîte de 100 mm. Dans un tube de 1,5 ml, mélanger 500 pi de DMEM non supplémenté avec 7 pg d&#39;ADN plasmidique totale (correspondant à deux ou plusieurs plasmides). Dans un tube de microcentrifugeuse, mélanger 500 pi de DMEM non supplémenté wie 21 pi du réactif de transfection. Répétez l&#39;opération pour chaque réaction de transfection. </li><li> Pipeter la solution de réactif de transfection dans la solution d&#39;ADN du plasmide (ne solutions dans l&#39;ordre inverse de mélange). Mélanger par pipetage au moins 4 fois. </li><li> Faire incuber ce mélange à la température ambiante pendant 10 à 15 minutes, mais pas plus de 15 min. </li><li> Inclinez la plaque pour créer un réservoir de médias et de la pipette le mélange de transfection goutte à goutte sur le côté intérieur de la plaque sans déranger les cellules avec soin. Remettre le plat à sa position originale plat et agiter doucement pour distribuer le mélange. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié de culture cellulaire avec 5% de CO 2 (cette condition est appelé ci - après &quot;incubateur de culture tissulaire»). Remplacer les médias 5 heures après la transfection (en option). </li></ol> 3. Vérification Transfection ou Induction efficacité <ol><li> À 24 h post-transfection, visualiser les cellules sous une grippemicroscope orescent pour vérifier l&#39;efficacité de transfection (ou l&#39;induction de contrôle HEK293T-REx lignée cellulaire stable exprimant la GFP). Incuber pendant 24 h. </li></ol> 4. STREP Affinity Purification (STREP AP) <ol><li> La collecte des cellules <ol><li> A 48 heures post-transfection, retirez le support et ajouter 8 ml de solution saline 1x froide tamponnée au phosphate (PBS). Pipeter vers le haut et vers le bas pour détacher les cellules de la plaque. </li><li> Recueillir et transférer la suspension de cellules dans un tube de 15 ml et tourner les cellules vers le bas à 800 g pendant 4 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant PBS. Répéter la rotation vers le bas (800 g pendant 1 min à 4 ° C) pour éliminer tout PBS résiduel. Stocker le culot cellulaire à -80 ° C pour une utilisation ultérieure ou suivez la procédure ci-dessous pour continuer la purification des protéines. </li></ol></li><li> Lyser les cellules <ol><li> Remettre en suspension les culots cellulaires à l&#39;aide de 5 x le volume du culot cellulaire (~ 250 ul par plaque) de tampon de lyse passive(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, de la protéase comprimé inhibiteur de cocktail, 5% v / v glycérol et 1,0% de NP-40) et à transférer la suspension cellulaire à un 1,5 ml de tube de microcentrifugeuse. </li><li> vortex brièvement la suspension et nutation pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Isoler la suspension cellulaire à 10.000 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transférer les lysats solubles dans un nouveau tube de 1,5 ml et jeter les culots cellulaires. Économisez 10% du volume final du lysat soluble &quot;STREP AP entrée.&quot; Conserver à 4 ° C. </li></ol></li><li> Équilibrant les perles de STREP NOTE: perles Utilisez STREP pour la première étape AP! Complexes tiré vers le bas avec des perles de STREP récupérer beaucoup plus de protéines que celles tiré vers le bas avec des perles de FLAG. <ol><li> Sortez (n × 40 pi) + n pl de la STREP perle bouillie à 50% (n = nombre d&#39;échantillons) et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. REMARQUE: Utilisez l&#39;échelle mconseils outhed à perles de pipette. </li><li> Retirer le surnageant et ajouter 500 pi de PLB aux billes. Nutation le mélange des perles pendant 5 min à 4 ° C. Isoler à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. <ol><li> Répétez l&#39;opération pour un total de 3 lavages. Remettre en suspension les billes dans PLB à un volume final de 40 ul nx. </li></ol></li><li> Ajouter 40 ul de 50% STREP bourrelet suspension pour chaque échantillon de lysat cellulaire et nutation pendant 2 heures à 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Isoler solution à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. </li><li> Retirer le surnageant et le magasin comme «STREP AP accréditives (FT)&quot; à 4 ° C. </li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lavage STREP AP I (Tris-HCl 20 mM , pH 7,5, 250 mM de NaCl, 1,5 mM de MgCl2, 1 mM de DTT, 5% de glycerol et 0,2% de NP-40) pour les billes. Nutation le mélange des perles pendant 5 min à 4 ° C et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. <ol><li> Répétez l&#39;opération pour un total de 4 lavages. <br/&gt; NOTE: Avant le quatrième lavage, transférer la solution de perles à un nouveau tube de 1,5 ml pour réduire l&#39;arrière-plan de la protéine. Cette étape est essentielle. </li></ol></li><li> Ajouter 500 pi de tampon de lavage II (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM et EDTA 1 mM) et équilibrer les billes en inversant les tubes. Isoler à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C et jeter le surnageant. </li><li> Éluer la protéine d&#39;intérêt avec 50 pi de tampon d&#39;élution STREP (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM et 2,5 mM desthiobiotine). Vortex à 800 rpm pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Isoler les perles à 1500 g pendant 1 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant. Cette fraction correspond à l&#39;échantillon &quot;STREP AP Elution». </li><li> Enregistrer la fraction de perles à 4 ° C pendant une deuxième élution, ce qui pourrait conduire à la moitié de la quantité de protéine obtenue avec la première élution. Aliquote de 10% du PA STREP Elution pour la coloration d&#39;argent et / ou le transfert de western16. </li></ol></li><li> Équilibrant les perles FLAG <ol><li> Sortez (nx 16 pi) + n pl de solution de perles de FLAG (n = nombre d&#39;échantillons) et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. REMARQUE: Utilisez des conseils à large ouverture à des billes de pipettes. </li><li> Eliminer le surnageant et ajouter 500 pi de tampon de lavage FLAG (100 mM de Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM et 0,1% de NP-40) pour les billes. Isoler à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Répétez l&#39;opération pour un total de 3 lavages. </li><li> Resuspendre les perles dans un tampon de lavage FLAG à un volume final de 16 ul nx. </li><li> Ajouter 16 ul du FLAG bourrelet suspension pour le reste élution STREP AP et nuit nutation à 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. FLAG IP <ol><li> Isoler la suspension des perles de FLAG à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Enregistrez le surnageant et stocker le «FLAG IP accréditives&quot; (FT) à 4 ° C. </li><li> Ajouter 50081; l de lavage FLAG tampon à la solution. Nutation pendant 5 min à 4 ° C et centrifuger à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Répétez l&#39;opération pour un total de 4 lavages et retirer le surnageant après chaque lavage. NOTE: Avant le quatrième lavage, transférer la solution de protéines-billes à un nouveau tube de 1,5 ml pour réduire fond. Cette étape est essentielle. </li><li> Retirer le surnageant de l&#39;essorage final et ajouter 30 pi de tampon de lavage FLAG contenant 200 ng / ul de peptide FLAG dans les perles. Vortex à 800 rpm pendant 2 heures à 4 ° C. </li><li> Isoler la suspension à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Récolter le surnageant et conserver à 4 ° C comme le &quot;FLAG Elution IP.&quot; REMARQUE: Les échantillons d&#39;élution peut être confirmée par coloration à l&#39; argent et / ou Western Blot en utilisant des protocoles standard 16, et sont prêts pour d&#39; autres essais de protéines. Lors de la mise en place d&#39;un western blot, exécutez tous les échantillons suivants: (1) STREP AP Entrée, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutisur, (4) FLAG IP FT, et (5) FLAG IP Elution. Les volumes chargés devront être déterminées pour chaque expérience. Tous les échantillons collectés et billes peuvent être conservées à 4 ° C pour le stockage à court terme et à -80 ° C pour le stockage à long terme. Des échantillons de TAP peuvent être analysés par spectrométrie de masse pour vérifier l&#39;identité de leurs composants, afin d&#39; identifier de nouvelles modifications post-traductionnelles (PTM) et / ou pour découvrir toute nouvelle interaction de la protéine purifiée avec le complexe 2, 17. A cet effet, après l&#39;exécution d&#39;un gel ou d&#39;argent Coomassie, les bandes peuvent être excisées à partir du gel en utilisant un scalpel propre. Plusieurs excellentes critiques qui traitent des méthodes de spectrométrie de masse ont déjà été publiés 18, 19. </li></ol>

<ol><li>Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-based+prediction+of+protein+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Network-based prediction of protein function.</a> Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of HIV-human protein complexes.</a> Nature. 481, 365-370 (2012).</li>
<li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340, 245-246 (1989).</li>
<li>Luo, Y., Batalao, A., Zhou, H., Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+two-hybrid+system%3A+a+complementary+approach+to+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mammalian two-hybrid system: a complementary approach to the yeast two-hybrid system.</a> Biotechniques. 22, 350-352 (1997).</li>
<li>Lee, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coimmunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Coimmunoprecipitation assay.</a> Methods Mol Biol. 362, 401-406 (2007).</li>
<li>Puig, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Jager, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+HIV-human+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of HIV-human protein complexes.</a> Methods. 53, 13-19 (2011).</li>
<li>Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-TEFb%2C+a+cyclin-dependent+kinase+controlling+elongation+by+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">P-TEFb, a cyclin-dependent kinase controlling elongation by RNA polymerase II.</a> Mol Cell Biol. 20, 2629-2634 (2000).</li>
<li>Peterlin, B. M., Price, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+elongation+phase+of+transcription+with+P-TEFb%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlling the elongation phase of transcription with P-TEFb.</a> Mol Cell. 23, 297-305 (2006).</li>
<li>McNamara, R. P., McCann, J. L., Gudipaty, S. A., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+mediate+the+enzymatic+disassembly+of+promoter-bound+7SK+snRNP+to+locally+recruit+P-TEFb+for+transcription+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Transcription factors mediate the enzymatic disassembly of promoter-bound 7SK snRNP to locally recruit P-TEFb for transcription elongation.</a> Cell Rep. 5, 1256-1268 (2013).</li>
<li>Adelman, K., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoter-proximal+pausing+of+RNA+polymerase+II%3A+emerging+roles+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Promoter-proximal pausing of RNA polymerase II: emerging roles in metazoans.</a> Nat Rev Genet. 13, 720-731 (2012).</li>
<li>D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((7SKiing+on+chromatin%3A+move+globally%2C+act+locally%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">7SKiing on chromatin: move globally, act locally.</a> RNA Biol. 13, 545-553 (2016).</li>
<li>McNamara, R. P., Bacon, C. W., D'Orso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+Elongation+Control+by+the+7SK+snRNP+Complex%3A+Releasing+the+Pause%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Transcription Elongation Control by the 7SK snRNP Complex: Releasing the Pause.</a> Cell Cycle. 15, 2115-2123 (2016).</li>
<li>Yao, F., Svensjo, T., Winkler, T., Lu, M., Eriksson, C., Eriksson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetracycline+repressor%2C+tetR%2C+rather+than+the+tetR-mammalian+cell+transcription+factor+fusion+derivatives%2C+regulates+inducible+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells.</a> Hum Gene Ther. 9, 1939-1950 (1998).</li>
<li>McNamara, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KAP1+Recruitment+of+the+7SK+snRNP+Complex+to+Promoters+Enables+Transcription+Elongation+by+RNA+Polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">KAP1 Recruitment of the 7SK snRNP Complex to Promoters Enables Transcription Elongation by RNA Polymerase II.</a> Mol Cell. 61, 39-53 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAusubel%2C+FM+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience. New York. (1994).</li>
<li>Trudgian, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+label-free+SINQ+normalized+spectral+index+quantitation+in+the+central+proteomics+facilities+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of label-free SINQ normalized spectral index quantitation in the central proteomics facilities pipeline.</a> Proteomics. 11, 2790-2797 (2011).</li>
<li>Choudhary, C., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+signalling+networks+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 427-439 (2010).</li>
<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
<li>Rogers, S., Wells, R., Rechsteiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+sequences+common+to+rapidly+degraded+proteins%3A+the+PEST+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis.</a> Science. 234, 364-368 (1986).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici pour l&#39;expression et l&#39;isolement des complexes de protéines à partir de cellules eucaryotes ne se limite pas à la caractérisation biochimique de ces assemblages moléculaires, mais il peut également être utilisé pour l&#39;identification de nouveaux interacteurs et les modifications post-traductionnelles qui pourraient réguler leur fonctionnement. L&#39;utilisation de marqueurs d&#39;affinité ne se limite pas à ce qui est mentionné dans ce protocole; mais notre expérience montre que l&#39;...

<html> Les interactions protéine-protéine (IPP) sont essentiels pour la régulation précise des processus biologiques 1, et d&#39; autres études sur ces IPP peut indiquer leur fonction 2. Plusieurs approches ont été mises au point pour l&#39;étude et la caractérisation des IPP, ainsi que pour l&#39;identification de novo de nouveaux composants régulateurs protéiques. En 1989, les champs et les collègues Stanley a signalé la levure à deux hybrides (Y2H) dosage 3. Cette approche permet l&#39;identification impartiale et complète de interacteurs (proies) pour une protéine d&#39;intérêt définie (appât) dans Saccharomyces cerevisiae. En plus de son utilité pour la découverte remarquable PPIs, le dosage Y2H peut être utilisé pour caractériser des paires de protéines dans des cellules de levure, en définissant des domaines d&#39;interaction minimale, et l&#39;identification des mutations qui suppriment ces interactions. En modifiant le dosage de Y2H, IPP peut également être étudié dans des cellules de mammifèresclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Les variations du dosage Y2H (par exemple, le système à trois hybrides de levure) peuvent également être appliqués à l&#39; étude de protéines et d&#39; ARN interactions ligand organique à petites protéines dans les cellules. Un autre outil couramment utilisé pour étudier les IPP dans un système homologue est le co-immunoprécipitation (co-IP) dosage 5. En utilisant un anticorps à immunoprécipiter une protéine d&#39;intérêt, le test de co-IP permet aux chercheurs de surveiller IPP dans le traitement des cellules pour diverses conditions environnementales et des situations expérimentales. L&#39;utilisation de protéines de marquage épitopique (par exemple, FLAG, Myc, STREP, et HA, entre autres) dans la purification d&#39;affinité (AP) méthodes a facilité l&#39;isolement de protéines à partir de mélanges de protéines complexes pour plusieurs essais en aval, y compris western blot, tache d&#39; argent et l&#39;analyse enzymatique. Cependant, aucune de ces approches antérieures permettent l&#39;isolement de grandes quantités de complexes de protéines pour une caractérisation ultérieure in vitro , y compris unssays, découverte de sous-unités régulatrices par spectrométrie de masse, et l&#39;identification des modifications post-traductionnelles. Une version améliorée du procédé est appelé AP AP tandem (TAP), qui est une technique de purification pour l&#39; étude des IPP en créant une protéine de fusion avec deux epitopes qui est purifié par deux points d&#39; accès ultérieurs 6, 7. Dans cet article, nous présentons une variante de la méthode de TAP pour les complexes protéiques de purification dans lequel deux sous-unités sont marqués avec différents épitopes, puis purifiés par deux points d&#39;accès séquentiels (STREP AP suivi par FLAG IP). Nous fournissons d&#39; abord un aperçu de la TAP minimalistic (Figure 1), puis une description détaillée de toutes les étapes expérimentales (Figure 2), de sorte que les chercheurs puissent les appliquer à leur complexe de protéine d&#39;intérêt. Pour démontrer l&#39;applicabilité de la méthode TAP, nous avons choisi une cycline-CDK bien caractérisé complexe (appelé PTEFB kinase), qui est composé de la cycline T1 de sous - unité régulatrice (CycT1) et une kinase (CDK9), et est impliqué dans la régulation de la transcription par l&#39; ARN polymérase II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb phosphoryle le domaine C-terminal de Pol II et ses associés des facteurs d&#39;élongation négative, ce qui soulage pause de la transcription au niveau du promoteur et facilite ainsi la transcription d&#39; allongement 11, 12, 13. Avec cette interaction connue à l&#39;esprit, STREP-tagged CycT1 et CDK9 FLAG marqués étaient surexprimés dans les cellules HEK293T. Une expérience TAP réciproque a été réalisée avec CDK9 et étiquetée FLAG étiquette strep CycT1 pour valider en outre que l&#39;interaction des protéines est indépendante des épitopes utilisés. Les cellules ont été recueillies et lysées 48 heures après transfection. Le lysat soluble a été purifié par TAP (STREP AP suivie par FLAGIP). D&#39; entrée et de protéines purifiées ont été analysées par Western Blot et coloration à l&#39; argent (figure 3).

<table><tbody><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase&nbsp ;</td><td>Roche ;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d’élution STREP-tag</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm & times ; 20 mm parabole traitée pour culture cellulaire polystyrène apyrogène 20/manchon</td><td>Corning&nbsp ;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Mélangeur</td> Vortex <td>Eppendorf 022431081</td><td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific&nbsp ;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Étagère à mousse micro-tube 48 trous</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Rôtissoire à secoueur Labquake&nbsp ;</td><td>Thermo&nbsp ;</td><td>Réf. 415110</td><td></td></tr></tbody></table>

la purification d&#39;affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

La purification de la protéine-protéine active et des complexes protéine-acide nucléique est cruciale pour la caractérisation des activités enzymatiques et la détermination de novo de nouvelles sous - unités et les modifications post-traductionnelles. Les systèmes bactériens permettent l&#39;expression et la purification d&#39;une grande variété de polypeptides simples et complexes protéiques. Cependant, ce système ne permet pas la purification des sous - unités protéiques qui contiennent des modifications post-traductionnelles (par exemple, la phosphorylation et acétylation), et l&#39;identification de nouvelles sous - unités régulatrices qui sont seulement présents / exprimées dans le système eucaryote. Ici, nous fournissons une description détaillée d&#39;un roman, robuste et méthode efficace de purification par affinité en tandem (TAP) en utilisant streptomycine et des protéines FLAG-tagged qui facilite la purification de complexes protéiques avec transitoirement ou exprimé de manière stable des protéines de marquage épitopique à partir de cellules eucaryotes. Ce protocole peut être appliqué pour caractériser protein fonctionnalité complexe, pour découvrir les modifications post-traductionnelles sur des sous-unités complexes, et d&#39;identifier de nouveaux composants réglementaires complexes par spectrométrie de masse. En particulier, cette méthode TAP peut être appliquée à l&#39;étude des complexes protéiques formés par des composants ou eucaryotes pathogènes (virus et bactéries), ce qui donne ainsi un large éventail de possibilités expérimentales en aval. Nous proposons que les chercheurs travaillant avec des complexes de protéines pourraient utiliser cette approche dans de nombreuses façons différentes.

Dans cet article, nous démontrons l&#39;applicabilité de la méthode TAP pour la CycT1-CDK9 bien caractérisé complexe (également connu sous le nom P-TEFb kinase). Plasmides codant pour la cycline T1-STREP (CycT1: S) et CDK9-FLAG (CDK9: F), ou CDK9-STREP (CDK9: S) et cycline T1-FLAG (CycT1: F) (tableau 1), ont été transfectées dans des cellules HEK293T . Les contrôles négatifs inclus transfections avec un vecteu...

Nous décrivons ici une méthode de purification par affinité en tandem (TAP) nouvelle, robuste et efficace pour l’expression, l’isolement et la caractérisation de complexes protéiques à partir de cellules eucaryotes. Ce protocole pourrait être utilisé pour la caractérisation biochimique de complexes discrets ainsi que pour l’identification de nouveaux interacteurs et de modifications post-traductionnelles qui régulent leur fonction.

La purification d&#39;affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Le but global de cette méthode de purification par affinité en tandem est d'isoler des complexes protéiques exprimés à partir de cellules eucaryotes afin de caractériser biochimiquement leurs assemblages moléculaires, d'identifier de nouveaux intermédiaires et les modifications post-traductionnelles qui régulent leur fonction. Cette méthode permet la purification de complexes protéiques intacts à partir de cellules eucaryotes, dans le but d'identifier de nouveaux intermédiaires ainsi que des modifications post-traductionnelles régulatrices qui ajustent finement leur fonction. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à fournir une pureté et un rendement élevés de complexes protéiques, adaptés à des applications in vitro ultérieures pour l'étude de leur fonction et de leur activité. Les cellules sont collectées à partir d'une purification par affinité STREP 48 heures après la transfection. Éliminer le milieu et ajouter huit millilitres de PBS froid. Pippeter plusieurs fois pour détacher les cellules de la plaque.Recueillir et transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et centrifuger les cellules à 800 ×g pendant quatre minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant de PBS. Centrifuger à nouveau à 800 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius afin d'éliminer tout résidu de PBS.Pour commencer cette procédure, resuspendre chaque culot cellulaire dans un volume de tampon de lyse passive, ou PLB, égal à cinq fois le volume du culot cellulaire. Transférer la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Vortexer brièvement la suspension, puis agiter en rotation pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Faire centrifuger la suspension cellulaire à 10 000 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer le lysat soluble dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre et éliminer le culot cellulaire. Conserver 10 % du volume final du lysat soluble comme témoin d'entrée STREP-AP et le stocker à quatre degrés Celsius.Il est important d'utiliser des billes STREP pour la première étape de purification par affinité, car les complexes immunoprécipités avec des billes STREP récupèrent significativement plus de protéines que ceux obtenus avec des billes FLAG. À l'aide d'une pipette à embout large, prélevez la quantité appropriée de suspension à 50 % de billes STREP nécessaire à la purification par affinité. Centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Éliminer le surnageant et ajouter 500 microlitres de PLB sur les billes. Agiter doucement le mélange de billes pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Centrifuger à nouveau.Après le troisième lavage, éliminer le surnageant et resuspendre les billes dans du PLB jusqu'à un volume final de n fois 40 microlitres, où n correspond au nombre d'échantillons. Ajouter 40 microlitres de suspension de billes STREP à 50 % à chaque échantillon de lysat cellulaire et incuber sous agitation lente pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Pendant cette étape de production et de récupération des protéines, plusieurs plaques de cellules peuvent être utilisées, et les mêmes échantillons protéiques lysés à partir de différentes plaques peuvent être combinés avec une même portion de billes lors de la purification par affinité STREP.Après avoir incubé les mélanges de lyzat cellulaire et de suspension de billes STREP pendant deux heures, centrifuger à 1 500 × g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Conserver le surnageant comme flux STREP AP et stocker à quatre degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage STREP AP 1 sur les billes.Agiter doucement les billes dans le mélange tampon pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver à nouveau avec 500 µL de tampon de lavage STREP AP 1. Après le troisième lavage, transférer la solution de billes dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 mL afin de réduire le fond protéique.Lavez une quatrième fois avec le tampon de lavage STREP AP un. Après la centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez 500 microlitres du tampon de lavage deux. Équilibrez les billes en retournant les tubes, puis centrifugez à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant. Éluerez la protéine d'intérêt avec 50 microlitres de tampon d'élution STREP. Vortexez à 800 tr/min pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Faire centrifuger les billes à 1 500 ×g pendant une minute à quatre degrés Celsius. Récupérer le surnageant. Cette fraction correspond à l'échantillon d'élution STREP AP.Conserver la fraction de billes à quatre degrés Celsius pour une seconde élution. Aliquoter 10 % de l'élution STREP AP pour une coloration argent et/ou un immunoblotting. Pour augmenter la quantité de matériau initial destiné à l'immunoprécipitation FLAG suivante, les première et seconde élutions STREP peuvent être regroupées afin d'obtenir une récupération plus efficace de l'élution FLAG.Commencez cette procédure en utilisant une pipette à embout large pour transférer la quantité appropriée de solution de billes FLAG dans un tube de microcentrifugation. Faites centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Éliminez le surnageant et ajoutez 500 microlitres de tampon de lavage FLAG aux billes.Centrifuger à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Éliminer le surnageant et laver à nouveau avec le tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, retirer le surnageant et resuspendre les billes dans le tampon de lavage FLAG jusqu'à un volume final de n fois 16 microlitres, où n est le nombre d'échantillons.Ajouter 16 microlitres de la suspension de billes FLAG à l'élution STREP AP restante et agiter en rotation toute la nuit à quatre degrés Celsius. Après une incubation nocturne de la suspension de billes FLAG et de l'élution STREP AP, procéder à l'immunoprécipitation FLAG. Centrifuger la suspension de billes FLAG à 1 500 × g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Conserver le surnageant comme flux sortant de l'IP à la FLAG et stocker à quatre degrés Celsius. Ajouter 500 microlitres de tampon de lavage FLAG sur les billes. Agiter doucement par basculement pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius puis centrifuger à 1 500 × g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Jetez le surnageant et effectuez un nouveau lavage avec 500 microlitres de tampon de lavage FLAG. Après le troisième lavage, transférez la solution de billes protéiques dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,5 millilitre afin de réduire le fond parasite. Effectuez un quatrième lavage avec le tampon de lavage FLAG.Éliminer le surnageant après la dernière centrifugation et ajouter aux billes 30 microlitres de tampon de lavage FLAG contenant 200 nanogrammes par microlitre de peptide FLAG. Vortexer à 800 tr/min pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Après deux heures, centrifuger la suspension à 1 500 ×g pendant deux minutes à quatre degrés Celsius.Récupérez le surnageant et conservez-le à quatre degrés Celsius comme éluat de l'immunoprécipitation FLAG. Dans cette vidéo, la purification par affinité en tandem, ou méthode TAP, a été appliquée au complexe Cycline-T1 CDK9. La Cycline-T1 marquée par une étiquette STREP et le CDK9 marqué par une étiquette FLAG ont été surexprimés dans des cellules HEK293 T.Une expérience réciproque a également été réalisée avec la CDK9 marquée par une étiquette STREP et la Cycline-T1 marquée par une étiquette FLAG. L'analyse par immunotransfert montre que la CDK9 marquée par l'étiquette FLAG a été co-éluée avec la Cycline-T1 marquée par l'étiquette STREP à partir des billes STREP, mais pas dans le contrôle négatif, l'AP ne contenant pas de Cycline-T1 marquée par l'étiquette STREP. Les deux protéines ont été détectées dans l'élution FLAG, ce qui a confirmé davantage la formation du complexe.Les résultats TAP réciproques montrent que la cycline T1 marquée par FLAG co-élue avec la CDK9 marquée par STREP, confirmant davantage que l'interaction entre la cycline T1 et la CDK9 est indépendante des épitopes utilisés. Les résultats de la TAP et de la TAP réciproque ont également été analysés par coloration argent. Les astérisques indiquent les impuretés co-éluées.La protéine CDK9 marquée par le marqueur FLAG a été co-éluée avec la Cycline-T1 marquée par le marqueur STREP à partir des billes STREP, mais pas à partir de l'AP témoin. Lors de l'élution suivante avec le marqueur FLAG, la Cycline-T1 marquée STREP a été co-éluée avec le CDK9 marqué FLAG à partir des billes FLAG. De même, la Cycline-T1 marquée FLAG a été co-éluée avec le CDK9 marqué STREP à partir des billes STREP, mais pas à partir de l'AP témoin. Le complexe protéine-protéine a été efficacement récupéré après la deuxième étape d'IP avec le marqueur FLAG. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux jours, à compter du moment où les cellules sont prêtes à être collectées, à condition qu'elle soit effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de penser à augmenter en conséquence le nombre de plaques cellulaires par expérience afin de garantir une récupération et une détection suffisantes de protéines. Par exemple, pour identifier de nouvelles sous-unités régulatrices et/ou étudier les modifications post-traductionnelles des sous-unités du complexe. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs qui étudient les interactions protéine-protéine, leur permettant d'explorer de nouveaux intermédiaires et les modifications post-traductionnelles dans les cellules eucaryotes.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et caractériser des protéines à l'aide de marqueurs STREP et FLAG.

tandem-affinity-purification-protein-complexes-from-eukaryotic

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Tandem Affinity Purification est une approche robuste pour l'identification de partenaires de liaison aux protéines. Comme preuve de concept, cette méthodologie a été appliquée à la eIF4E facteur d'initiation de traduction bien caractérisé à la co-précipité les facteurs cellulaires de l'hôte impliqués dans l'initiation de la traduction. Cette méthode est facilement adaptable à n'importe quelle protéine cellulaire ou virale.

Identification des partenaires protéine interagissant Utilisation Tandem Affinity Purification

La purification par affinité des protéines marquées en combinaison avec la spectrométrie de masse (APMS) est une méthode puissante pour la cartographie systématique des réseaux d'interactions protéiques et d'enquêter sur le fondement mécaniste des processus biologiques. Ici, nous décrivons un peptide optimisé séquentielle d'affinité (SPA) procédure APMS développé pour la...

Identification des complexes protéiques dans<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En utilisant séquentielle Purification par affinité peptide en combinaison avec la spectrométrie de masse en tandem

Cette vidéo présente la purification par affinité en tandem, une technique permettant de purifier les complexes protéiques des cellules eucaryotes afin d’étudier l’interaction protéine-protéine. Le complexe contient deux protéines marquées avec des étiquettes d’épitopes différentes. Lors de la purification du complexe à l’aide de deux résines ayant une affinité pour les deux marqueurs différents de manière séquentielle, la présence des deux protéines dans l’élué confirme l’interaction entre les...

Essai de purification d’affinité en tandem pour étudier les interactions protéine-protéine

complexes de protéines catalysent les fonctions cellulaires essentielles. Caractérisation fonctionnelle et structurale détaillée de nombreux complexes essentielles nécessite la production recombinante. MultiBac est un système cellulaire baculovirus / insecte particulièrement adaptées pour l'expression de protéines eucaryotes et de leurs complexes. MultiBac a été mis en œuvre comme une plate-forme en libre accès, et les procédures d'exploitation normalisées développés afin de maximiser son...

La protéine plate-forme de production complexe MultiBac à l&#39;EMBL

Drosophile est célèbre pour sa manipulation génétique puissant, mais pas pour son aptitude d'analyse biochimique en profondeur. Ici, nous présentons une procédure basée TAP à identifier les partenaires d'interaction de toute protéine d'intérêt à partir du cerveau de la mouche. Cette procédure peut potentiellement conduire à de nouvelles pistes de recherche.

Identifier les interactions protéine-protéine dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Têtes de Tandem Affinity Purification adultes (TAP)

La méthode de purification par affinité en tandem (TAP) a été largement utilisée pour isoler des complexes natifs à partir d’extraits cellulaires, principalement eucaryotes, pour la protéomique. Ici, nous présentons un protocole de méthode TAP optimisé pour la purification de complexes natifs pour des études structurales.

Purification de Native Complexes pour l&#39;étude structurale utilisant une méthode de Tag Tandem Affinity

Nous décrivons ici les protocoles pour perturber les cellules de mammifères par fraisage à l'état solide à une température cryogénique, produire un extrait de cellule à partir de la poudre cellulaire résultante, et isoler des complexes de protéines d'intérêt par capture par affinité sur anticorps couplé micrométriques billes paramagnétiques.

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Les interactions protéine-protéine et protéine-métabolite sont indispensables pour toutes les fonctions cellulaires. Ici, les auteurs décrivent un protocole qui permet une analyse parallèle de ces interactions avec une protéine de choix. Notre protocole a été optimisé pour les cultures de cellules végétales et combine purification d’affinité avec la protéine basé sur la spectrométrie de masse et de la détection de métabolite.

2 en 1 : en une seule étape de Purification d’affinité pour l’analyse parallèle de protéine-protéine et protéine-métabolite Complexes

Nous présentons ici un protocole éprouvé et testé pour la purification des chloroplastes complexes d’importation protéiques (complexe TOC-TIC) à l’aide de la balise de robinet. Le protocole d’affinité-isolation en une seule étape peut potentiellement s’appliquer à n’importe quelle protéine et être utilisé pour identifier de nouveaux partenaires d’interaction par spectrométrie de masse.

Purification d’affinité des chloroplastes Translocon protéines Complexes à l’aide de la balise de robinet

Cet article fournit une procédure pour la purification d’affinité d’une protéine recombinante humaine, l’endonucléase de lambeau 1 (FEN1), qui a été marquée avec un marqueur 6X-histidine. Le protocole implique l’utilisation de deux colonnes d’ions métalliques immobilisées distinctes pour la purification de la protéine marquée.

Purification d’affinité d’une protéine marquée 6X-His à l’aide d’un système de chromatographie liquide à protéines rapides 

Apprenez la purification d'affinité en tandem pour isoler des complexes protéiques à partir de cellules eucaryotes. Cette méthode permet d'identifier de nouveaux interacteurs et des modifications post-traductionnelles régulatrices.

La purification d'affinité en tandem de complexes protéiques à partir des cellules eucaryotes

Explorer plus de vidéos