Un piège hydrodynamique microfluidique à base de particules uniques

L'objectif général de cette méthode est de confiner et de manipuler des particules uniques à l'échelle microscopique et nanométrique en utilisant un écoulement laminaire dans un dispositif microfluidique. Le piège hydrodynamique est constitué d'un dispositif microfluidique doté d'une géométrie de canal en croix, générant un écoulement à point d'arrêt au niveau de la jonction du microcanal. Une vanne intégrée située dans l'un des canaux de sortie permet de contrôler activement l'écoulement du fluide et de piéger les particules.

Les particules sont confinées à un point de consigne défini par l'utilisateur grâce à une commande active de la position du point d'arrêt. Un contrôleur à rétroaction est utilisé pour suivre la position des particules et réguler la vanne sur puce afin de maintenir la position des particules au point de consigne. À l'aide du piège hydrodynamique, des particules individuelles peuvent être piégées dans des solutions de particules diluées ou concentrées et être observées par microscopie à fluorescence ou en champ clair.

Une seule particule peut être confinée à moins d'un micron du centre du piège, comme le montrent la trajectoire de la particule et l'histogramme du déplacement de la particule par rapport au centre du piège. Bonjour, je suis Eric Johnson Rio du laboratoire du professeur Charles Schroer, du Département de génie chimique et biomoléculaire et du Centre de biophysique et de biologie computationnelle de l'Université de l'Illinois. Bonjour, je m'appelle Ari, chercheur postdoctoral au laboratoire Schroeder.

Bonjour, je suis Cheryl Schroeder, et aujourd'hui, nous allons vous montrer comment fabriquer et mettre en œuvre un dispositif microfluidique pour le piégeage hydrodynamique de particules individuelles. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les pièges optiques ou électrocinétiques, est que le piégeage hydrodynamique est obtenu uniquement par l'action de l'écoulement du fluide, éliminant ainsi les champs potentiellement perturbateurs pour le piégeage de nanoparticules ou de cellules. Cette technique pourrait transformer la science fondamentale et appliquée en permettant le piégeage en solution libre de particules à l'échelle microscopique et nanométrique, sans exigence particulière concernant les propriétés chimiques ou physiques des particules piégées.

Commençons. Afin de faciliter le décollage des répliques des moules en SU-8, silanisez la surface des moules en SU-8 en plaçant les tranches dans un dessiccateur sous vide pendant 10 minutes avec un plat en verre contenant quelques gouttes de trichlorosilane, en utilisant un mélange de PDMS DGEA pour les couches fluidique et de commande. Appliquez par rotation le mélange de PDMS 15:1 sur le moule de la couche fluidique pendant 30 secondes à 750 tr/min, puis placez la tranche dans une boîte de Pétri.

De la même manière, placer le moule de la couche de contrôle dans une boîte de Pétri et y verser un mélange de PDMS en rapport cinq pour un jusqu'à une épaisseur de quatre millimètres. Pour réticuler partiellement les couches de PDMS, faire cuire les wafers ou les PDMS pendant 30 minutes à 70 degrés Celsius, puis les laisser refroidir à la température ambiante. Découper la réplique de PDMS avec le scalpel et la décoller du moule SU huit.

Ensuite, à l’aide de l’aiguille de calibre 21, percer un trou dans le PDMS afin de créer un orifice d’accès au microcanal qui servira de valve membranaire intégrée. Placer la réplique en PDMS comportant la couche de commande sur la tranche recouverte de la couche fluide en PDMS obtenue par centrifugation. Aligner soigneusement et sceller la couche de commande sur la couche fluide à l’aide d’un microscope stéréo.

Veillez à éliminer toutes les poches d'air entre les couches et faites durcir à 70 degrés Celsius pendant toute une nuit afin de polymériser complètement les deux couches en une seule dalle monolithique de PDMS. Après refroidissement à température ambiante, utilisez un scalpel pour découper et décoller le duplicata de PDMS du moule SU huit, puis employez une lame de rasoir pour retirer l'excès de PDMS et séparer chaque unité de dispositif. Percez ensuite des orifices d'accès aux microcanaux de la couche fluidique à l’aide d’une aiguille de calibre 21. Nettoyez une lame couvre-objet avec de l’acétone IPA et séchez-la à l’aide d’azote.

Traitez la lame de couverture et les surfaces du duplicata en PDMS avec un plasma d'oxygène à 500 millitorrs pendant 30 secondes. Ensuite, mettez immédiatement les deux surfaces en contact pour former un scellement irréversible. Enfin, faites cuire les dispositifs toute la nuit afin d'augmenter l'adhérence entre les couches de PDMS et la lame de couverture.

Placez d'abord le dispositif microfluidique sur la platine d'un microscope inversé et fixez-le à l'aide de pinces de platine. Ensuite, pour acheminer les solutions vers le dispositif microfluidique, remplissez une seringue étanche aux gaz d'un millilitre et une seringue étanche aux gaz de 250 microlitres respectivement avec la solution tampon et la solution d'échantillon. Utilisez un raccord en T entre la seringue d'échantillon et le port d'échantillon sur le dispositif microfluidique pour contrôler l'acheminement de l'échantillon.

Établissez maintenant les connexions fluidiques entre les seringues et le dispositif microfluidique à l’aide de tubulures en perfluorooxy, d’adaptateurs à verrouillage et de tubulures métalliques de calibre 24. Ensuite, établissez les connexions fluidiques pour les canaux de sortie du dispositif microfluidique à l’aide de tubulures en PFA et de tubulures métalliques de calibre 24. Afin de maintenir une chute de pression constante entre les seringues et les canaux de sortie, les tubulures en PFA destinées aux sorties doivent être de même longueur et toutes deux immergées dans un tube de centrifugation de 1,5 millilitre rempli de solution tampon.

Remplir la vanne intégrée avec de l'huile porteuse fluorée à l'aide d'une seringue en plastique de verrouillage de trois millilitres afin d'empêcher l'air de pénétrer dans la couche fluidique pendant le fonctionnement. Pousser l'air présent dans la chambre de la vanne à travers la membrane en PDMS et dans le microcanal. Dans la couche fluidique.

Pour le fonctionnement des valves sur puce. Connecter une alimentation en gaz inerte sous pression au port de la couche de commande. Rincer les connexions fluidiques et le dispositif microfluidique avec 0,5 millilitre de solution tampon afin de s'assurer que toutes les bulles d'air sont éliminées du système, y compris des canaux de sortie.

Les débits typiques utilisés pour éliminer les bulles varient entre 2000 et 5 000 microlitres par heure après le rinçage des bulles d'air hors des canaux microfluidiques. Réduisez ensuite le débit à 50 à 100 microlitres par heure, ce qui correspond à un débit volumétrique typique pour le piégeage de particules. Passez maintenant le robinet en T afin de permettre à l'échantillon de s'écouler dans le dispositif microfluidique. Exécutez le code LabVIEW sur mesure qui automatise le piégeage des particules en mettant en œuvre un algorithme de contrôle linéaire à rétroaction.

Le code capture des images à partir d'une caméra CCD et transmet un potentiel électrique à un régulateur de pression qui module activement la position d'une vanne pneumatique sur puce. À l'aide du plateau de translation XY du microscope, positionnez la zone de piégeage au centre du champ de la caméra. Amenez la zone de piégeage au foyer de l'objectif et ajustez les paramètres de la caméra pour optimiser les conditions d'imagerie.

Choisissez une région rectangulaire d’intérêt située dans le champ de vision de la caméra de sorte que le centre de cette région corresponde à la position du piège. Initialisez maintenant la pression de décalage appliquée à la vanne intégrée. Une constriction de 100 à 200 microns de large se trouve au niveau du canal de sortie opposé.

Fournit une pression de décalage pour le fonctionnement de la vanne intégrée. Lancez le contrôleur à rétroaction et ajustez le gain proportionnel afin d'optimiser la réponse du piège. Selon le débit et la position de la vanne intégrée, il existe une valeur optimale du gain proportionnel, qui améliore la stabilité du piège et élimine les oscillations indésirables des particules.

Le code de la vue du laboratoire capturera automatiquement l'une des particules entrant dans la zone de piégeage. Dans cette vidéo, le mouvement des particules dans la direction de l'écoulement est dû au fait que le canal d'entrée de l'échantillon reste ouvert afin de maximiser la rigidité du piégeage dans la direction de l'écoulement. L'utilisateur peut fermer le canal d'échantillon pendant le piégeage, ce qui équilibre uniformément l'écoulement au niveau du jonction en croix, surveiller la particule piégée et maintenir la mise au point sur la particule dans le plan de l'image à l'aide d'une mise au point manuelle ou d'un dispositif microscopique automatisé.

Le dispositif microfluidique intégré est composé d'un foyer d'échantillon, d'une jonction en croix et d'une vanne pneumatique. Le piégeage a lieu au niveau de la jonction en croix, et la position des particules est contrôlée par un ajustement actif du champ d'écoulement au niveau de la jonction de microcanal grâce à la vanne pneumatique. Ici, une image d'une unique microbille confinée dans le piège hydrodynamique est présentée. En plus de la bille située au centre du piège, plusieurs billes non piégées sont visibles dans la zone de piégeage au niveau de la jonction en croix.

La trajectoire d'une perle fluorescente en polystyrène de 2,2 micromètres piégée est cartographiée. La particule est d'abord piégée pendant trois minutes. Elle est ensuite relâchée du piège et s'échappe le long de l'un des canaux de sortie.

Un histogramme du déplacement d'une perle piégée par rapport au centre du piège le long de la direction des canaux de sortie indique que la particule est confinée à moins d'un micron du centre du piège. Aujourd'hui, nous avons présenté le piège EM comme une méthode de piégeage en solution libre de particules à l'échelle microscopique et nanométrique, utilisant un point de stagnation créé par un écoulement au sein d'un dispositif microfluidique. Le piégeage hydrodynamique permet de confiner une particule cible unique dans des suspensions concentrées, ce qui est difficile à réaliser avec des méthodes alternatives de piégeage fondées sur des champs de force.

Après des développements supplémentaires, cette nouvelle technique permettra des explorations scientifiques dans les domaines de la biophysique, de la mécanique cellulaire, de la dynamique des fluides, de l'enzymologie et de la biologie des systèmes. Merci d'avoir regardé et nous espérons que cette technique sera utile pour vos expériences.