Plate-forme microfluidique avec multiplexée Détection électronique pour le suivi spatial des particules

L'objectif général de cette procédure est de démontrer une plateforme microfluidique qui associe la détection par variation de résistance à l'accès multiple par répartition de code afin de multiplexer la détection et le dimensionnement de particules dans plusieurs canaux microfluidiques. Cette technologie, nommée microfluidic CODES, peut contribuer à la réalisation de dispositifs de puces-laboratoires entièrement intégrés et véritablement portables, particulièrement adaptés aux tests diagnostiques au point d'intervention dans des environnements aux ressources limitées. Le principal avantage de cette technique réside dans sa capacité à suivre électroniquement la manipulation spatiale et temporelle des particules sur la puce microfluidique, éliminant ainsi le besoin d'un instrument externe tel qu'un microscope.

Notre technologie est compatible avec la lithographie douce et peut facilement être intégrée dans un dispositif microphotique où les particules sont fractionnées afin de fournir une lecture électronique directe similaire à celle d’un compteur Coulter. Pour commencer la construction du dispositif microfluidique, générez un ensemble de quatre codes d’or à sept bits. Concevez ensuite quatre agencements d’électrodes uniques basés sur les codes d’or à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) tel qu’AutoCAD.

Enfin, faites fabriquer le photomask avec l'agencement d'électrodes conçu par un fournisseur de photomasks. Ensuite, faites tremper une plaquette de verre borosilicaté de quatre pouces dans une solution piranha à un rapport de cinq pour un à 120 degrés Celsius pendant 20 minutes. Après le nettoyage, chauffez la plaquette sur une plaque chauffante à 200 degrés Celsius pendant 20 minutes afin d'évaporer l'eau résiduelle.

Placez la plaquette propre et sèche dans un coupleur centrifuge. Appliquez 2 millilitres de solution de résine photosensible négative sur la plaquette et effectuez un revêtement par rotation à 3000 tours par minute pendant 40 secondes. Séchez la plaquette revêtue par rotation sur une plaque chauffante à 150 degrés Celsius pendant une minute.

Couvrez la plaquette avec un masque au chrome présentant le motif d'électrode souhaité. Exposez la surface de la résine photosensible masquée à une lumière UV de 365 nanomètres afin d'obtenir 225 millijoules par centimètre carré. Faites ensuite cuire la résine photosensible exposée sur une plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant une minute.

Immerger la plaquette dans le révélateur de résine photosensible pendant 15 secondes, puis rincer la plaquette gravée avec un jet doux d'eau déionisée et sécher la plaquette sous un flux de gaz azote. Ensuite, placer la plaquette gravée dans un évaporateur métallique à faisceau d'électrons. Déposer une couche de chrome de 20 nanomètres d'épaisseur et une couche d'or de 80 nanomètres d'épaisseur sur la plaquette à un débit d'un angström par seconde.

Ensuite, graver le photo-résist sous-jacent en chauffant par ultrasons la plaquette métallisée dans l'acétone pendant 30 minutes à 40 kilohertz et à une amplitude de 100 %. Utiliser une scie de découpage pour couper la plaquette en morceaux plus petits selon les besoins. Pour commencer la fabrication du moule du canal microfluidique, nettoyer et sécher une plaquette de silicium de quatre pouces de la même manière que la plaquette de verre borosilicaté décrite précédemment.

Placez la plaquette de silicium dans un centrifugeur de dépôt et appliquez quatre millilitres de solution de résine photosensible négative. Effectuez le dépôt par centrifugation de la plaquette à 500 tr/min pendant 15 secondes, puis à 1 000 tr/min pendant 15 secondes, et enfin à 3 000 tr/min pendant 60 secondes. Placez la plaquette face vers le haut sur un chiffon de salle blanche imprégné d'acétone afin d'éliminer la résine photosensible résiduelle du dos et des bords de la plaquette.

Faites cuire la plaquette à 65 degrés Celsius pendant une minute, puis à 95 degrés Celsius pendant deux minutes. Placez un masque en chrome présentant le motif des canaux microfluidiques sur la plaquette sèche. Exposez la résine photosensible à une lumière UV de 365 nanomètres à 180 millijoules par centimètre carré, puis faites cuire à nouveau la plaquette à 65 et 95 degrés Celsius pendant une et deux minutes respectivement.

Placer la plaquette gravée dans un récipient contenant un révélateur de résine photosensible et agiter doucement le récipient pendant trois minutes. Rincer la plaquette révélée dans de l'isopropanol et sécher la plaquette sous un flux de gaz azote. Cuire la plaquette à 200 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis utiliser un profilomètre pour vérifier que l'épaisseur de la résine photosensible gravée est uniforme sur toute la surface de la plaquette.

Placer la plaquette dans un dessiccateur sous vide avec 200 microlitres de trichlorosilane dans une boîte de Pétri non couverte. Laisser la plaquette reposer dans le dessiccateur avec le trichlorosilane pendant huit heures afin de silaniser la surface de la plaquette. Pour commencer l'assemblage du dispositif, utiliser un ruban adhésif universel de salle blanche pour fixer le moule en plaquette de silicium dans une boîte de Pétri de 150 millimètres de diamètre.

Ajouter 50 grammes d'un mélange de prépolymère de polydiméthylsiloxane à un rapport de 10 pour 1 dans la boîte de Pétri et dégazer le mélange dans un dessiccateur sous vide pendant une heure. Durcir le mélange dégazé à 65 degrés Celsius pendant au moins quatre heures. Utiliser un scalpel pour découper la couche de PDMS durcie, puis détacher la couche durcie du moule à l’aide de pinces.

Couper le PDMS en petits morceaux. Perforer les orifices des canaux microfluidiques d'entrée et de sortie à l'aide d'un poinçon biopsique. Placer la couche de PDMS, côté motif vers le bas, sur du ruban adhésif transparent pour nettoyer la surface micromécanisée.

Rincez le substrat en verre portant l'électrode préparé précédemment avec de l'acétone, de l'isopropanol et de l'eau déionisée. Séchez le substrat sous un flux d'azote gazeux. Placez la couche de PDMS et le substrat dans un générateur de plasma RF réglé à 100 milliwatts, les côtés des micromachines orientés vers le haut.

Activer les surfaces de la micromachine dans un plasma d'oxygène pendant 30 secondes. Ensuite, utiliser un microscope optique pour aligner la couche de PDMS gravée avec les électrodes de surface. Une fois l'alignement effectué, laisser les surfaces entrer en contact physique afin de sceller la couche de PDMS sur le substrat en verre.

Il est essentiel que le motif d'électrode de revêtement sur le substrat en verre soit correctement aligné avec les canaux microfluidiques en PDMS. Une fois l'alignement correctement effectué, l'interaction des particules avec l'électrode de surface générera un signal codé souhaité pour la multiplexion. Faites cuire le dispositif assemblé à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes, côté verre vers le bas.

Enfin, soudez les fils aux plots de contact des électrodes pour terminer l'assemblage du dispositif. Pour commencer l'expérience, placez le dispositif microfluidique sur la platine d'un microscope optique. Connectez l'électrode de référence du dispositif au port de sortie du signal d'un amplificateur synchrone et appliquez une onde sinusoïdale de 400 kilohertz.

Connecter les électrodes capteurs positives et négatives à deux amplificateurs transimpédances indépendants. Relier les deux amplificateurs transimpédances aux entrées différentielles de tension de l'amplificateur synchrone, le signal du capteur positif devant être soustrait du signal du capteur négatif. Connecter la sortie du démodulateur de l'amplificateur synchrone à une unité d'acquisition de données.

Dans le logiciel d'acquisition de données, régler une fréquence d'échantillonnage de 1 mégahertz pour la sortie de l'amplificateur synchrone. Configurer une caméra haute vitesse afin d'enregistrer optiquement le fonctionnement du dispositif tel qu'observé au microscope. Aspirer une suspension cellulaire préparée dans une seringue.

Fixez la seringue contenant l'échantillon sur une pompe à seringue et reliez la seringue au canal d'entrée. Dirigez le canal de sortie vers un récipient de déchets. Utilisez la pompe à seringue pour faire circuler la suspension cellulaire à travers le dispositif à un débit constant, tout en enregistrant le signal de modulation d'impédance.

À l'issue de l'expérience, traitez les données électriques à l'aide d'un logiciel d'analyse. Comparez le signal électrique traité aux images provenant de la caméra haute vitesse afin d'élaborer une courbe d'étalonnage pour la taille des cellules. Une suspension cellulaire a été acheminée à travers un dispositif capteur microfluidique comportant quatre motifs d'électrodes uniques dérivés de codes capteurs orthogonaux.

Les quatre signaux de capteur ont été enregistrés à partir d'une seule sortie électrique. Le capteur individuel associé à chaque signal enregistré a été identifié par corrélation des signaux de capteur enregistrés avec tous les codes possibles, ce qui a produit des pics d'autocorrélation clairement distinguables. Les formes d'onde produites par les signaux interférents provenant de la détection simultanée de cellules dans les quatre canaux ont été résolues à l'aide d'un algorithme itératif.

Une onde enregistrée a été corrélée à tous les codes possibles et le pic d'autocorrélation le plus élevé a été identifié. Le signal correspondant du capteur individuel a été reconstruit et soustrait de l'onde d'entrée. Le signal résiduel a été transmis à l'itération suivante comme entrée, et le processus s'est poursuivi jusqu'à ce que le signal résiduel ne produise plus aucun pic d'autocorrélation.

Les signaux estimés ont été affinés à l'aide d'un algorithme d'optimisation cherchant le meilleur ajustement entre les formes d'onde reconstruites et celles initialement enregistrées, en utilisant l'approximation aux moindres carrés. La localisation, la taille des cellules et le temps de traversée du capteur ont ensuite été déterminés à partir du numéro de canal, de l'amplitude, de la durée et du décalage temporel relatif des signaux estimés du capteur. La procédure a été validée par comparaison des signaux électriques avec des mesures optiques provenant de la caméra haute vitesse.

Une fois maîtrisée, cette technique est très facile à mettre en œuvre, car elle est très simple du point de vue du matériel. Elle ne comporte aucun composant actif sur puce. Elle est directement compatible avec la lithographie douce et le traitement du signal repose sur un algorithme de calcul simple.

Après avoir suivi ce protocole, vous pouvez fabriquer des puces microfluidiques dotées de capteurs électriques multiplexés basés sur un code et décoder les signaux électriques pour des mesures bioanalytiques. Cette technologie de détection électronique polyvalente et évolutive peut être facilement intégrée à divers dispositifs microfluidiques afin de réaliser des dosages quantitatifs en suivant spatialement et temporellement les particules au fur et à mesure de leur traitement sur la puce. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la conception, de la fabrication et de la mise en œuvre d'une technologie microfluidique CODES.