Capturez cellule à l'aide d'un dispositif microfluidique

Les appareils, tels que nous les avons préparés, sont emballés dans des kits de 10 ou 20, et lorsqu’ils arrivent, ils sont expédiés froids dans une boîte et le kit contient tous les composants dont vous avez besoin pour fonctionner. L’expérience dans le kit est un paquet avec toutes les seringues et tampons, qui peuvent rester à température ambiante. Il y a aussi une copie du protocole que nous allons suivre dans cette expérience.

Il y a aussi une boîte réfrigérée, qui contient les appareils réels et tous les tampons de fonctionnement qui doivent être réfrigérés. En règle générale, les kits sont emballés par groupes de 10 ou 20. Lorsqu’ils ne sont pas utilisés, les kits doivent être réfrigérés.

Chaque seringue et chaque composant du kit sont soigneusement étiquetés et les étiquettes correspondent au tableau dans le protocole que nous suivons. Il n’y a donc aucune ambiguïté quant à la seringue ou au composant du kit à utiliser dans les différentes étapes. Après avoir déballé les dispositifs et les avoir placés dans une enceinte de sécurité biologique, nous effectuerons la procédure d’isolement des neutrophiles et de lyse pour des applications génomiques en aval parce que nous allons le faire, parce que la vie sauvée que nous obtiendrons sera utilisée pour isoler ou, ou nous extrairons l’ARN du lysat cellulaire.

Pour cette raison, nous voulons nous assurer que notre zone est propre, non seulement au sens stérile, mais aussi exempte de tous les ARN qui sont généralement présents dans l’environnement. Il est donc très important d’essuyer toute votre zone et vos appareils avec la solution qui détruit les ARN. En règle générale, nous essuyons tous nos outils et nos surfaces de travail avec de l’ARN SAP ou des ARN, que vous pouvez obtenir auprès d’un certain nombre de fabricants.

L’appareil est emballé dans une pochette thermosoudable. Chaque appareil est scellé et ce code-barres est codé. Vous devriez, vous devriez noter ce code-barres si vous travaillez avec des échantillons cliniques.

Ainsi, l’appareil est descellé, le couvercle est enlevé et il est placé dans le dispositif de collecteur de retenue de la pompe. L’échantillon de sang que nous utilisons est un échantillon de sang total. Nous allons le faire passer dans la seringue standard d’un mil BD, et celle-ci est étiquetée seringue un.

En règle générale, la seringue est retirée de l’emballage et le capuchon est soigneusement retiré du tube de sang. Et ce que vous faites, c’est que vous déposez 700 microlitres ou 0,7 mil de sang et injectez la moitié de cela ou 350 microlitres dans un tube de 1,5 mil. Merci. De cette façon, votre sang peut être transmis pour un traitement ultérieur.

Votre tube de sang peut être transmis et pourtant il vous reste encore plus de sang en cas de défaillance d’un appareil. Alors maintenant, ce que nous allons faire, c’est charger la seringue qui contient du sang, sur, sur cette aiguille, qui est reliée à un morceau de tube avec cet appareil. Nous voulons être très, avec, avec le dispositif d’isolation microfluidique.

Nous voulons faire très attention à ne pas introduire de bulles d’air dans l’appareil ou, sinon l’appareil ne fonctionnera pas. Donc, généralement, ce que nous faisons, c’est que nous prenons la seringue et que nous appuyons sur le piston et ajoutons le liquide sur la surface supérieure de l’appareil, en nous assurant qu’il est bien marié avant d’avoir éjecté tout le liquide. Nous nous arrêtons et nous retirons soigneusement le corps de la seringue de l’aiguille et remplissons essentiellement la pointe de l’aiguille ou, ou le, le connecteur de leurre de l’aiguille avec le tampon restant qui se trouve dans cette seringue.

Nous nous en débarrassons. Nous allons ensuite prendre notre seringue avec du sang et nous allons l’insérer dans ce centre de leurre. Faire attention à ne pas verser le sang et à ne pas introduire de bulles d’air.

Il est préférable d’utiliser un kemo tenant le corps de la seringue et le tube au cas où du sang serait versé. Une fois, une fois que la seringue est connectée au boîtier du tube ou à l’aiguille, nous lui donnons quelques coups secs pour éliminer les bulles d’air, qui peuvent se trouver au niveau du connecteur. Cette seringue est ensuite chargée sur le pousse-seringue, puis sur la vis de blocage.

Le pousse-seringue est allumé et il est déjà préréglé à nos conditions de débit. Nous allons faire circuler ce sang à travers l’appareil à 30 microlitres par minute. Une fois que le corps de la seringue est chargé dans la pompe à seringue, nous allons appuyer sur le bouton du bras du piston mobile et le faire glisser vers le bas jusqu’à ce qu’il touche le haut du piston et commence à pousser le liquide à travers l’extrémité de celui-ci.

Il s’agit d’une aiguille en acier inoxydable à pointe émoussée. Une fois que nous savons que le système est amorcé, nous allons appuyer sur exécuter. Pour commencer l’écoulement du sang, vous appuyez sur stop pour l’arrêter, puis vous prenez un tube de centrifugeuse propre de 1,5 mil ou un tube de défense et nous allons le débrancher soigneusement.

Débranchez un seul appareil, débranchez le tube d’un port de l’appareil. Une fois ce tube débranché, nous l’insérons dans le tube d’aile de 1,5 mil. Nous allons appuyer sur courir pour recommencer la circulation sanguine.

Et lorsque nous voyons une goutte de sang se former, nous arrêtons la pompe et l’insérons dans l’entrée que nous venons d’ouvrir dans l’appareil. Nous appuierons sur exécuter pour commencer l’écoulement du sang et nous réglerons une minuterie sur cinq minutes. Nous voulons nous assurer que le sang remplit uniformément toutes les chambres et qu’il n’y a pas de bulles d’air évidentes dans l’appareil.

S’il y a des bulles d’air qui bloquent l’écoulement dans l’une des chambres, vous pouvez prendre une paire de pinces à épiler et les faire passer le long des petits canaux, qui mènent aux chambres de capture ou aux petits canaux qui sortent des chambres de capture. Cet appareil se remplit bien, donc après cinq minutes, vous appuyez sur la touche d’arrêt de la pompe à seringue pour arrêter l’écoulement du sang, vous desserrez la pince de la seringue et la sortez du support de la pompe à seringue. Ensuite, nous allons utiliser la seringue numéro trois, qui est chargée avec du PBS sans nucléase Nous allons utiliser, nous allons essentiellement nous assurer que la surface de l’appareil est attachée pour éviter toute bulle d’air, nous allons tapoter la seringue pour en faire, nous assurer que toutes les bulles d’air se trouvent en haut du corps de la seringue.

Desserrez le bras de la pompe à seringue et insérez la seringue à trois moulins dans la pompe. Serrez-le, puis poussez le piston vers le bas jusqu’à ce qu’il entre en contact avec le piston de la seringue. On appuie sur run et on attend que le liquide amorce l’appareil et on attend qu’un pour voir une gouttelette à la pointe de l’aiguille en inox.

Lorsque vous voyez une goutte se former, vous arrêtez la pompe. Nous allons retirer le sang, l’embout en acier inoxydable qui a le sang. Nous allons insérer le tampon de lavage et appuyer sur exécuter.

Et nous allons laisser cela durer cinq minutes. Et vous devez prendre une lingette propre et essuyer simplement toute petite quantité de sang, qui peut se trouver à l’entrée ou à la sortie pour Après cinq minutes de passage du tampon de lavage à travers l’appareil, l’appareil doit être complètement nettoyé de tout sang et vous pouvez voir qu’en gros, il n’y aura plus de sang rouge dans l’appareil, L’appareil aura l’air clair. Donc, ce que nous allons faire, c’est qu’après les cinq minutes, nous allons arrêter le tampon de lavage de fonctionner.

Et encore une fois, nous allons retirer la seringue du pousse-seringue. Nous allons boucher le microtube de centrifugation de 1,5 mil, directement sur le tube de sortie flexible. Et nous allons soulever avec précaution le tube, le tube de micro-centrifugeuse, en retirant le tube de déchets de l’appareil.

Nous allons le jeter dans un conteneur à risque biologique. Dans le kit se trouve un nouveau tube de sortie, qui est en fait en téflon. Il a à nouveau, un embout en acier inoxydable dessus.

Nous allons remplacer l’ancien tube de sortie par ce nouveau tube de sortie. Nous allons prendre ce tube de sortie et nous allons essayer de le plier autour d’une sorte de forme en U ou en V. Et puis aussi avec le kit se trouve une colonne de broyage kaya, cela cisaille l’ADN et homogénéise essentiellement votre vie cellulaire.

Nous allons donc ouvrir le capuchon violet de la colonne de déchiqueteuse et placer le tube de sortie dans la colonne de déchiqueteuse Kay. Nous allons retirer de la seringue numéro deux du kit, qui dit, pour RLT, nous allons l’utiliser. Il s’agit d’une seringue BD standard d’un mil à seringue avec un embout émoussé de calibre 22, en acier inoxydable.

Nous allons l’utiliser pour injecter 350 microlitres de RLT standard de kyogen dans l’appareil. Parce que l’appareil a un volume mort d’environ 50 microlitres, ce que nous voulons faire, c’est injecter le RLT, mais derrière le RLT, nous voulons injecter un bouchon d’air sur, pour libérer ce volume mort de l’appareil dans la colonne de déchiquetage de chi. Donc, la façon dont nous allons le faire est de prendre notre seringue, nous tirons, aspirons 350 microlitres d’air, puis suivis de 350 microlitres ou 0,35 mils de RLT et le RLT est maintenant au fond de la seringue.

Résistez à la tentation de retourner la seringue et d’injecter l’air. L’air est là pour s’assurer que nous intégrons tous les RLT dans notre colonne de déchiqueteuse Kay. Nous allons retirer le tube du tampon de lavage.

Nous allons insérer notre seringue avec le RLT et nous allons injecter lentement le RLT dans l’appareil sur une période d’environ 30 secondes, en nous assurant que le tube de sortie éjecte ses déchets dans la colonne de déchiquetage de chi. Une fois que l’air commence à être injecté dans l’appareil, vous appuyez sur le plumer et attendez que tout le liquide soit libéré dans la colonne Kay Shredder. On ca la colonne de déchiqueteuse kay et on la fait tourner sur une fusée microcentrale avec une balance à 15 000 tr/min ou ou RPM maximum sur un fusible microcentre de paillasse pendant deux minutes.

Donc, après avoir fait tourner la colonne pendant deux minutes, nous allons en retirer l’échantillon, qui se trouve maintenant dans RLT et nous allons le placer dans l’un des flacons cryogéniques à capuchon violet fournis. Si vous travaillez avec un échantillon clinique, échantillonnez ces flacons cryogéniques, vous les étiqueterez au début de l’expérience. Voici le lysat dans le flacon cryogénique.

Ce flacon cryogénique est immédiatement placé dans un congélateur à moins 80 degrés AC C et stocké pour l’expédition ou l’extraction ultérieure de l’ARN. Il s’agit donc d’un protocole alternatif pour l’isolement des neutrophiles. Au lieu de lyser les cellules avec le tampon RLT, nous allons les colorer avec une coloration histologique standard.

Une tache. Nous sortons donc l’appareil scellé du sac et nous le déballons à nouveau, notons le numéro de lot sur l’appareil et plaçons la boîte de Pétri. Dans le support de boîte de Pétri.

Nous allons prendre la seringue d’un mil de son sac numéro un, nous allons la charger avec 700 microlitres de sang et en injecter la moitié de 350 microlitres dans un tube DPH eend. Nous allons mettre cela de côté. Prenez la seringue quatre, qui a le tube que nous utiliserons pour sélectionner, injecter le sang dans l’appareil.

Je vais tenir la base de l’aiguille à partir de la pointe du tube de manière chimique. Retirez le corps de la seringue et remplissez le leurre. L’adaptateur mettrait en mémoire tampon et éliminerait cette seringue.

Nous insérerons la seringue contenant du sang dans l’aiguille à l’aide de la lingette chimique pour recueillir tout débordement. Nous allons tapoter la seringue pour éliminer les bulles d’air à la connexion entre l’aiguille et le corps de la seringue. Nous chargerons la seringue dans le pousse-seringue, nous amorcerons le tube en appuyant sur le bras mobile du pousse-seringue.

Nous allons déconnecter le tube de l’une des sorties de l’appareil, le dispositif de capture, et le placer dans un tube einor de 1,5 mil. Ensuite, nous commencerons à faire couler le sang en appuyant sur le tire-seringue. Nous attendrons qu’une gouttelette de sang se forme au niveau de l’extrémité en acier inoxydable.

Une fois que la gouttelette se forme, vous appuyez sur stop, dab ce sang, insérez-le dans l’appareil et appuyez sur exécuter. Maintenant, nous réglons une minuterie sur cinq minutes. D’accord, après avoir traversé l’appareil pendant cinq minutes, appuyez sur stop sur le tire-seringue et relâchez la seringue.

Et nous allons remplacer cette seringue par la seringue de trois mil contenant notre tampon de lavage, qui n’est qu’un XPBS. Encore une fois, nous voulons nous assurer que le haut de l’appareil est attaché, puis nous allons retirer la pointe de l’aiguille contenant du sang ou plus couler. Commencez à amorcer l’appareil.

Nous allons former des gouttelettes, les insérons dans l’appareil et appuyons sur pour éliminer le sang à l’entrée ou à la sortie du tube et nous le laisserons couler pendant cinq minutes après l’étape de lavage. Encore une fois, nous allons arrêter le tire-seringue et retirer la seringue du porte-pompe. Pour faire du maintien GIM standard, nous allons d’abord fixer les cellules et les déshydrater en utilisant du méthanol à 100 %.

Donc, nous, nous avons une seringue, une seringue de trois mil préchargée de méthanol. Encore une fois, nous allons amorcer la seringue, nous assurer que le méthanol coule, arrêter la pompe à seringue, l’insérer dans l’appareil et appuyer sur exécuter. Nous allons les fixer dans cette solution de méthanol pendant deux à quatre minutes.

Donc, après deux à quatre minutes de fixation et de méthanol, nous arrêtons la pompe, libérons la seringue avec du méthanol, et ici nous allons charger une seringue, une seringue de trois mil contenant eem sustain standard eem sustain de Sigma dilué un à cinq dans de l’eau déminéralisée. Après avoir dilué, nous avons chargé dans la seringue et à l’extrémité de la seringue, nous fixons un filtre de 0,8 micron pour filtrer toutes les particules qui entreront, qui finiront par obstruer l’appareil. La tache pendant cinq à 10 minutes.

Et puis nous rincerons avec l’eau de Deion i. Donc, après cinq à 10 minutes de coloration, nous arrêterons la pompe à seringue et nous allons remplacer la seringue par le tampon de coloration par la seringue qui contient de l’eau déminéralisée, nous allons essentiellement laver jusqu’à ce que nous voyions le, la couleur bleue du SAI a été lavée de l’appareil. Une fois que l’excès de gim sustain a été rincé de l’appareil, nous arrêtons la solution de lavage.

Ensuite, nous allons retirer la seringue d’eau de l’entrée. Ensuite, nous allons prendre le tube de sortie de l’appareil. Nous allons saisir ce tube à la fin avec notre pince à épiler.

Il s’agit d’un tube tigon flexible et nous allons le réinsérer dans l’entrée de l’appareil. Cela scelle l’appareil et maintient les cellules hydratées et leur morphologie intacte. Maintenant, mon collègue, le Dr John Hong Chang, va montrer un protocole alternatif pour l’isolement des lymphocytes CD quatre positifs, suivi d’une coloration immunofluorescente directement dans le dispositif microfluidique.

Je m’appelle donc Shong Hong et aujourd’hui, je vais vous montrer la coloration cellulaire dans un dispositif microfluidique à ce stade, je peux déjà vous montrer comment utiliser un dispositif d’isolement d’immuno-affinité micro flic pour isoler spécifiquement les cellules sanguines du sang total sans précédent. Dans ce but, il veut époux les cellules et obtenir du contenu en protéines et en ADN de ces cellules isolées. Eh bien, aux fins de mes recherches, je m’intéresse à l’obtention des cellules, puis à l’obtention du nombre de cellules, par exemple, pour obtenir le nombre de cellules CD quatre à partir du sang total et l’utiliser comme indicateur à des fins de diagnostic.

L’appareil utilisé est donc très similaire à celui de Ken. Il est fait d’une chambre droite outta P-D-M-S-A. La géométrie est légèrement différente, de sorte que les paramètres de fonctionnement sont légèrement différents, tandis qu’en général, la procédure de fonctionnement globale est très similaire.

Je vais donc sauter toutes les étapes de capture et de rinçage des cellules et passer directement à l’étape de coloration des cellules dans les procédures de comptage des cellules. J’ai donc ici un appareil qui contient déjà des demi-cellules capturées à partir de sang total et l’appareil est déjà rincé au PBS. Ainsi, les cellules sortantes ont déjà été lavées de l’appareil et j’ai préparé à l’avance un mélange d’anticorps utilisé spécifiquement pour marquer les cellules isolées dans l’appareil.

Ainsi, la concentration d’anticorps que nous avons utilisée ici a été optimisée pour colorer les cellules avec une intensité fluorescente très élevée au microscope fluorescent. La procédure est donc assez simple. Nous chargeons la seringue remplie de la solution d’anticorps sur le pousse-seringue, puis nous nous assurons que le débit est réglé sur les bons paramètres dont nous avons besoin.

Ensuite, nous démarrerons le tire-seringue, surveillerons la fin du tube, nous nous assurerons que la solution sort déjà afin qu’il n’y ait plus de bulle dans le tube. Ensuite, nous pouvons brancher le tube dans le dispositif microfluidique dont les cellules sont capturées. Donc, maintenant, l’anticorps s’écoule dans l’appareil pour colorer les cellules que nous avons isolées dans le, dans l’appareil, le débit ici, j’utilise cinq microlitres par minute, mais selon la géométrie de l’appareil là-bas, il pourrait y avoir différents paramètres de débit que vous souhaitez utiliser à votre fin.

Et nous allons laisser le flux de solution d’anticorps pendant cinq minutes, ce qui est suffisant pour un volume suffisant pour remplacer toute la solution dans le canal micropho. Donc, après l’injection d’anticorps, nous arrêterons le flux. Donc, nous, nous flottons dans l’anticorps à cinq microlitres par minute pendant cinq minutes pour remplacer toute la solution dans le microcanal.

Ensuite, nous arrêtons le débit et laissons l’appareil incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Cela doit donc être fait dans l’obscurité afin que l’anticorps ne soit pas éteint pendant que les cellules, les anticorps fluorescents peuvent être éteints pendant que les cellules sont incubées avec un anticorps de coloration. Ainsi, après une coloration généralement de 15 à 30 minutes, il suffit de débrancher le tube de l’appareil et de remplacer la seringue d’anticorps par une seringue tampon pour éliminer les anticorps non liés de l’appareil.

Ainsi, la solution de lavage contient ici 1 % de BSA dans la solution PBS. Le BSA est utilisé pour bloquer la non-liaison de l’anticorps à la surface et nous ferons la même chose. Nous ajustons donc d’abord le débit de la pompe à seringue pour nous assurer qu’il s’agit du bon débit que nous voulions, puis nous démarrons la pompe à seringue et nous nous assurons qu’il y a réellement du liquide qui sort du tube avant de le brancher sur l’appareil.

Le but de faire cela est qu’il n’y a pas de bulle restante comme un reste dans le tube. Ainsi, lorsque nous injectons, aucune bulle ne pénètre dans notre appareil. Il suffit donc de brancher le tube dans l’appareil et de le laisser couler pendant encore cinq minutes pour remplacer tout le lavage, tous les anticorps non liés de l’appareil.

Après l’étape de lavage, nous fixerons les cellules avec 1 % de PFA. Le but de ce faire est que l’appareil puisse être stocké pendant quelques semaines jusqu’à quelques semaines si l’imagerie peut être effectuée immédiatement. La procédure est donc assez simple.

C’est similaire à ce que nous avons fait auparavant. Nous chargeons la seringue sur la pompe, ajustons le débit à celui que nous voulions, puis nous démarrons la pompe à seringue et nous branchons le tube sur notre appareil pour injecter la solution paraforme IDE, qui est le fixateur dans notre appareil pour fixer les cellules. Encore une fois, nous l’avons laissé couler pendant environ cinq minutes.

Ainsi, le PFA remplace tout le tampon dans l’appareil pour réparer toutes les cellules de l’appareil. Ainsi, après l’étape de fixation du PFA, il nous suffit de retirer la seringue PFA et l’appareil est maintenant prêt pour l’imagerie. Dans certains cas, les gens veulent avoir une coloration du noyau à montrer pour se superposer à la coloration de leur marqueur de surface cellulaire.

Donc, à cette fin, nous ferons la coloration du noyau en utilisant le DPI à la fin. Il suffit donc de charger la seringue DPI sur la pompe à seringue et d’alimenter le DPI dans notre appareil. Alors maintenant, le noyau sera coloré dans ces cellules pour montrer l’emplacement des cellules.

Et cela, l’image de coloration DPI peut ensuite être superposée avec la coloration du marqueur de surface pour montrer où se trouvent les cellules. Ainsi, à la fin de la coloration DPI, nous devons à nouveau laver la bande L DPI P avec une solution tampon. Encore une fois, nous utilisons un PBS contenant 1 % BSA pour éliminer le dpi sortant.

Et le fonctionnement est similaire à ce que nous avons fait auparavant. Il suffit de brancher la seringue tampon sur notre appareil et nous laisserons le tampon s’écouler dans l’appareil pour laver le dap non lié. C’est donc toute la procédure de coloration des cellules dans un dispositif à microfluide.

Et après toutes les procédures de coloration, les appareils sont prêts pour l’imagerie. Et comme nous avons effectué la réparation PFA, les appareils peuvent également être stockés pendant quelques semaines. Si l’imagerie d’image n’a pas pu être effectuée immédiatement.