Une plate-forme microfluidique pour le traitement de précision de petit volume échantillon et son utilisation pour Taille séparer les particules biologiques avec un Microdevice acoustique

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer des séparations automatisées de particules de petit volume à l’aide d’un dispositif photique microfluidique. Cette méthode peut permettre des procédures clés dans le domaine de l’ingénierie biomédicale, y compris le traitement robuste et la séparation d’échantillons pour des applications de biodétection et de recherche clinique. Les principaux avantages de cette technique sont la modularité, la précision, la robustesse et l’automatisation, ce qui la rend adaptable et flexible non seulement pour la séparation des rétics, mais aussi pour une grande variété de dispositifs de séparation microfluidique à écoulement.

Nous avons d’abord reconnu la nécessité de cette capacité pour effectuer régulièrement et de manière fiable des séparations sur des volumes d’échantillons biologiques submillimétriques sans dilution ou perte significative d’analyte. L’intégration du dosage des échantillons et de l’acheminement automatisé de la source aux fichiers de collecte, ainsi que les opérations standard du pousse-seringue, est essentielle pour fonctionner avec succès à cette échelle. Pour commencer, concevoir le dispositif acoustique réactif et la disposition des deux masques photo, comme décrit dans la première section du protocole de texte ci-joint.

Ensuite, disposez les orifices de fluide à l’arrière sur une plaquette de silicium 1 0 0 polie double face. À l’aide de la photolithographie à résistance positive standard, gravez cette géométrie à l’aide d’une gravure ionique réactive profonde à une profondeur de 350 à 400 micromètres. Ensuite, retournez la plaquette et tracez la géométrie du canal de fluide sur la face avant.

Encore une fois, à l’aide de la photolithographie à résistance positive standard, montez la plaquette à motifs sur une deuxième plaquette de support en silicium vierge. À l’aide de la résine photo, gravez maintenant les canaux exposés à une profondeur de 200 micromètres. À l’aide d’une gravure ionique à réaction profonde, trempez la plaquette du dispositif dans une solution de dénudage de réserve pour la décoller de la plaquette de silicium vierge.

Ensuite, nettoyez la plaquette de l’appareil et une plaquette de verre boro silicate de 0,5 millimètre d’épaisseur à l’aide d’une solution de piranha. Une fois propre, scellez les canaux de fluide en liant ioniquement le verre et la plaquette de silicium en utilisant les conditions indiquées ici. Enfin, coupez les copeaux individuels avec une lame diamantée sur une scie à découper à partir d’un kit époxy à faible viscosité à deux composants.

Pesez le rapport recommandé des deux composants et mélangez-les soigneusement. Placez ensuite le plomb, le Zirkin eight, le titanate ou la céramique piézoélectrique PCT dans un gabarit approprié et utilisez une pipette pour étaler uniformément environ 10 microlitres du mélange époxy afin de créer une couche mince et uniforme. Ensuite, placez la puce dans le gabarit et alignez le côté époxy de la céramique pizo avec la puce microfluidique.

Il peut être nécessaire d’agrafer la puce avec du ruban adhésif pour la maintenir en place pendant l’alignement. Serrez l’ensemble dans un étau en prenant soin de ne pas fissurer les composants et de durcir la température et la durée recommandées par le fabricant d’époxy. Une fois l’époxy durci, utilisez un fer à souder à pointe fine pour fixer des fils de calibre fin de chaque côté de la céramique pizo.

Si nécessaire, utilisez le flux approprié pour préparer la surface du pizo. Prenez soin d’effectuer le contact le plus bref possible avec le pizo pour éviter de le dépolariser thermiquement. Fixez la puce à une plaque d’essai fluidique à l’aide de dispositifs de serrage.

Fixez également un ventilateur de refroidissement à la planche d’essai pour réguler la température pendant les expériences acoustiques. Ensuite, vissez la puce aux connecteurs mondiaux. Montez la plaque d’essai sur la platine du microscope et joignez-vous au monde pour relier des connecteurs à des tubes supplémentaires aux entrées et aux sorties.

Utilisation de raccords filetés standard quarter 28. Pour un tube de 16e pouce, connectez la puce microfluidique à la pompe à seringue, aux vannes de sélection multivoies contrôlées par ordinateur, aux débitmètres et aux tubes interfacés par PC, comme illustré ici et décrit dans la figure quatre du protocole de texte ci-joint. Avant d’effectuer la séparation, remplissez les réservoirs de réactifs de nettoyage et amorcez leurs conduites de fluide correspondantes.

Réglez également les vannes trois et quatre à la sortie des copeaux pour qu’elles s’écoulent initialement vers les réservoirs de déchets. Ensuite, allumez le ventilateur de refroidissement. Connectez les fils pizo ceramic à l’amplificateur de puissance et réglez le générateur de fonctions sur la fréquence de résonance de la puce acoustique utilisée.

Ajustez le point de consigne de tension sur le générateur de fonctions de sorte que l’amplificateur RF émette entre 12 et 25 volts crête à crête, selon la séparation souhaitée. Connectez ensuite les flacons de collecte appropriés et le flacon d’entrée tampon au système. Utilisez le tampon d’échantillon adapté aux cellules ou aux particules à séparer ou, selon les exigences de l’analyse, à utiliser après la séparation.

Ensuite, chargez le logiciel de contrôle et utilisez-le pour contrôler les vannes, les capteurs de débit et la pompe afin d’effectuer la routine d’amorçage et de séparation entièrement automatique. Immédiatement avant de commencer la procédure de séparation, agitez brièvement le flacon d’échantillon pour remettre en suspension les particules qui auraient pu se déposer. Vous pouvez également pipeter l’échantillon de haut en bas 10 fois pour mélanger les échantillons biologiques qui sont plus susceptibles d’être endommagés ou agglomérés par vortex.

Fixez ensuite le flacon d’échantillon à la ligne d’entrée et lancez sans délai la routine d’amorçage et de séparation. Commencez par utiliser le logiciel pour amorcer l’entrée d’air des vannes un et deux afin de vous assurer que le tube ne contient pas de liquide. Amorcez simultanément le tube reliant le flacon d’entrée du tampon à la vanne deux et le flacon d’entrée de l’échantillon à la vanne un.

Demandez au pousse-seringue de prélever environ 15 microlitres des deux flacons pour remplir complètement le tube et les relier aux valves. Enfin, changez les vannes un et deux pour qu’elles soient gaspillées afin d’expulser tout excès de liquide ou d’air qui a pénétré dans la bobine de chargement. Ensuite, configurez le programme de chargement de la bobine d’échantillon en prélevant d’abord 25 microlitres d’air à 50 microlitres par minute.

Ensuite, il faut charger 250 microlitres d’échantillon à 200 microlitres par minute, suivis de 35 microlitres de tampon principal à 200 microlitres par minute, et enfin, 25 microlitres d’air à 50 microlitres par minute. Ensuite, réglez les pousse-seringues pour perfuser les bouchons de fluide chargés à 100 microlitres par minute et surveillez les débits aux petites et grandes sorties de particules à l’aide de capteurs de débit. Le rapport d’écoulement approprié peut être déterminé comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement.

Lorsque les capteurs de débit détectent un pic de débit indiquant le passage du premier entrefer : basculez la vanne de sortie correspondante du flacon de déchets à un flacon de prélèvement d’échantillons. Assurez-vous que l’écoulement est stable lorsque l’échantillon traverse la puce et est séparé en observant les lectures du capteur de débit. Lorsque l’échantillon passe à travers la puce, les fractions séparées sont collectées au niveau des vannes de sortie.

À l’extrémité du bouchon d’échantillonnage, observez le capteur de débit, détectez le deuxième entrefer À ce stade, remettez les vannes de sortie en déchets. Une fois le volume complet distribué, arrêtez la perfusion du pousse-seringue et mettez fin à la routine d’automatisation.

Une fois l’expérience de séparation terminée, débranchez les flacons de collecte d’échantillons de petites et de grandes particules et stockez-les de manière appropriée pour une analyse ultérieure. Fixez le tube de prélèvement d’échantillon dans des flacons vides pour recueillir les solutions de nettoyage en excès qui seront évacuées à travers les tubes. Démarrez ensuite la routine de nettoyage automatisé du système comme décrit dans le protocole texte ci-joint.

Au cours de ce processus, le programme contrôlera les vannes et la pompe à seringue pour charger séquentiellement la bobine de rétention avec des réactifs de nettoyage et les rincer à travers le système. Une fois le processus de nettoyage et de décontamination automatisé terminé, jetez les solutions de rinçage excédentaires et les flacons dans lesquels elles ont été recueillies en suivant les procédures appropriées de manipulation des déchets biologiques ou chimiques. Voici un balayage de fréquence représentatif d’un dispositif pizo et microfluidique bien couplé.

Lorsque le couplage entre le pizo et le dispositif microfluidique est bon, les particules se focalisent étroitement à la fréquence de résonance, ce qui entraîne un pic clair de l’intensité fluorescente et une migration vers la position de mise au point attendue. En revanche, lorsqu’il y a un mauvais couplage, les particules ne se focalisent pas bien et l’appareil n’est pas adapté lorsqu’une mise au point de haute qualité ou un débit rapide sont essentiels pour l’application requise. Chaque ligne de ce graphique représente les résultats de séparation à l’aide de différentes tailles de particules de polystyrène et de tensions de commande pizo.

En général, des tensions plus élevées sont nécessaires pour extraire des particules plus petites. Cependant, les tensions sèches ne peuvent pas être augmentées indéfiniment en raison d’une plus grande dissipation de chaleur et de l’augmentation des effets du flux acoustique. Pour démontrer l’utilité de cette plate-forme pour la séparation biologique des particules, des cellules humaines raji d’un diamètre moyen de huit à 10 micromètres ont été enrichies avec le virus de la dengue d’un diamètre approximatif de 50 nanomètres, puis séparées à l’aide du dispositif microfluidique acoustique.

Une fois qu’un tel système est assemblé et programmé, les séparations peuvent être effectuées de manière routinière en cinq minutes environ. Environ trois échantillons par heure peuvent être traités avec un nettoyage complet et une décontamination entre les échantillons. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être mises en œuvre, telles que le comptage cellulaire, le western blot ou le séquençage de nouvelle génération afin de confirmer la pureté de la séparation et d’élucider la signification biologique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la fabrication d’un dispositif de séparation microfluidique typique. Utilisez les connexions world to chip pour s’interfacer avec le matériel et exécuter une procédure de séparation automatisée de manière précise et robuste. N’oubliez pas que le travail avec des matières infectieuses peut être extrêmement dangereux et qu’il ne doit être effectué que par du personnel dûment formé qui utilise l’équipement et les procédures de sécurité biologique appropriés prescrits par l’établissement.