Une plate-forme microfluidique pour le traitement de précision de petit volume échantillon et son utilisation pour Taille séparer les particules biologiques avec un Microdevice acoustique

L'objectif général de cette procédure est d'effectuer des séparations automatisées de particules à petit volume à l'aide d'un dispositif microfluidique photique. Cette méthode peut permettre des procédures clés dans le domaine du génie biomédical, notamment un traitement et une séparation robustes des échantillons pour des applications de détection biologique et de recherche clinique. Les principaux avantages de cette technique sont sa modularité, sa précision, sa robustesse et son automatisation, ce qui la rend adaptable et souple non seulement pour la séparation de réticules, mais aussi pour une grande variété de dispositifs de séparation microfluidiques en flux continu.

Nous avons tout d'abord reconnu la nécessité de cette fonctionnalité pour effectuer de manière routinière et fiable des séparations sur des volumes d'échantillons biologiques inférieurs au millimètre sans dilution importante ni perte d'analyte. L'intégration du dosage de l'échantillon et du routage automatisé depuis les fichiers sources jusqu'aux fichiers de collecte, combinée aux opérations standards de la pompe à seringue, est essentielle pour travailler avec succès à cette échelle. Commencez par concevoir le dispositif réticulaire acoustique et la disposition des deux masques photographiques, comme décrit dans la section un du protocole textuel accompagnant.

Ensuite, dessiner les ports fluidiques du côté arrière sur une plaquette de silicium 1 0 0 polie des deux côtés. À l’aide d’une lithographie optique classique avec une résine positive, graver cette géométrie par gravure ionique réactive profonde jusqu’à une profondeur de 350 à 400 micromètres. Ensuite, retourner la plaquette et dessiner la géométrie des canaux fluidiques sur le côté avant.

Encore une fois, en utilisant la lithographie photométrique standard avec une résine positive, montez ensuite la tranche structurée sur une deuxième tranche porteuse en silicium vierge. À l’aide de la résine photosensible, gravez les canaux exposés à une profondeur de 200 micromètres. Par gravure réactive profonde, faites ensuite tremper la tranche du dispositif dans une solution de décapage de la résine afin de la détacher de la tranche en silicium vierge.

Ensuite, nettoyez la plaquette de dispositif et une plaquette de verre borosilicaté sans caractéristique, d'une épaisseur de 0,5 millimètre, à l'aide de solution de piranha. Une fois le nettoyage terminé, scellez hermétiquement les canaux fluidiques en liant ioniquement la plaquette de verre et de silicium selon les conditions indiquées ici. Enfin, découpez les puces individuelles à l’aide d’une lame en diamant sur une tronçonneuse, à partir d’un kit de résine époxy à deux composants et faible viscosité.

Prélevez le ratio recommandé des deux composants et mélangez-les soigneusement. Ensuite, placez le zirconate de plomb huit titanate ou la céramique piézoélectrique PCT dans un montage approprié et utilisez une pipette pour répartir environ 10 microlitres du mélange d'époxy uniformément dessus afin de former une fine couche homogène. Puis, placez la puce dans le montage et alignez le côté recouvert d'époxy de la céramique piézoélectrique avec la puce microfluidique.

Il peut être nécessaire de fixer la puce avec du ruban adhésif pour la maintenir en place pendant l'alignement. Serrer l'ensemble dans un étau en prenant soin de ne pas fissurer les composants, puis effectuer le durcissement à la température et pendant la durée recommandées par le fabricant de la résine époxy. Une fois la résine époxy durcie, utiliser un fer à souder à pointe fine pour connecter des fils fins à chaque extrémité du matériau piézoélectrique en céramique.

Si nécessaire, utilisez le flux approprié pour préparer la surface du pizo. Veillez à établir un contact aussi bref que possible avec le pizo afin d'éviter toute dépolarisation thermique. Fixez la puce sur une platine fluidique à l'aide de dispositifs de serrage.

Ajoutez également un ventilateur de refroidissement sur la platine afin de réguler la température pendant les expériences acoustiques. Ensuite, vissez les connecteurs entre la puce et le monde extérieur. Fixez la platine sur la platine du microscope et reliez les connecteurs entre le monde extérieur et la puce à des tubes supplémentaires aux entrées et sorties.

À l'aide de raccords filetés standard de 1/4 de pouce. Pour un tube de 1/16 de pouce, connectez la puce microfluidique à la pompe à seringue, aux vannes de sélection multiposition commandées par ordinateur, aux débitmètres reliés à un PC et aux tubes comme indiqué ici et décrit à la figure quatre du protocole accompagnant le texte. Avant d'effectuer la séparation, remplissez les réservoirs du réactif de nettoyage et purgez les conduites fluidiques correspondantes.

Régler également les vannes trois et quatre aux sorties de la puce afin que le flux soit initialement dirigé vers les réservoirs de déchets. Ensuite, allumer le ventilateur de refroidissement. Connecter les câbles du matériau piézoélectrique en céramique à l'amplificateur de puissance et régler le générateur de fonction à la fréquence de résonance de la puce acoustique utilisée.

Réglez le point de consigne de tension sur le générateur de fonctions de manière à ce que l'amplificateur RF délivre une tension comprise entre 12 et 25 volts crête à crête, selon la séparation souhaitée. Ensuite, connectez les flacons de collecte appropriés ainsi que le flacon d'entrée de tampon au système. Utilisez le tampon d'échantillon adapté aux cellules ou particules à séparer, ou tel que requis par le test d'analyse à utiliser après la séparation.

Ensuite, chargez le logiciel de contrôle et utilisez-le pour piloter les vannes, les capteurs de débit et la pompe afin d'effectuer automatiquement la purge initiale et la procédure de séparation. Juste avant de commencer la séparation, vortexez brièvement le flacon d'échantillon afin de resuspendre les particules éventuellement décantées. Alternativement, pipetez l'échantillon dix fois de haut en bas pour mélanger les échantillons biologiques plus sensibles aux dommages ou à l'agglutination provoqués par le vortexage.

Ensuite, fixez le flacon d'échantillon à la ligne d'entrée et lancez sans délai la routine d'amorçage et de séparation. Commencez par utiliser le logiciel pour amorcer l'entrée d'air des vannes une et deux afin de vous assurer que les tubes ne contiennent aucun liquide. Amorcez simultanément les tubes reliant le flacon d'entrée du tampon à la vanne deux et le flacon d'entrée de l'échantillon à la vanne une.

Faites en sorte que la pompe à seringue aspire environ 15 microlitres depuis les deux flacons afin de remplir complètement les tubes, après les avoir raccordés aux vannes. Enfin, positionnez les vannes un et deux sur le circuit de déchet pour évacuer tout excès de liquide ou d'air entré dans la bobine de chargement. Ensuite, configurez le programme pour charger la bobine d'échantillonnage en aspirant d'abord 25 microlitres d'air à raison de 50 microlitres par minute.

Ensuite, charger 250 microlitres d'échantillon à raison de 200 microlitres par minute, suivis de 35 microlitres de tampon frontal à 200 microlitres par minute, puis enfin, 25 microlitres d'air supplémentaires à 50 microlitres par minute. Régler ensuite les pompes à seringue pour infuser les bouchons de fluide chargés à 100 microlitres par minute et surveiller les débits aux sorties des particules petites et grandes à l'aide de capteurs de débit. Le rapport de débit approprié peut être déterminé comme décrit dans le protocole textuel accompagnant.

Lorsque les capteurs de débit détectent une augmentation du débit indiquant le passage du premier intervalle d'air, basculer la vanne de sortie correspondante du flacon de déchets vers un flacon de collecte d'échantillon. S'assurer que le débit est stable pendant que l'échantillon traverse la puce, en observant les mesures des capteurs de débit. Lorsque l'échantillon passe à travers la puce, les fractions séparées sont collectées aux vannes de sortie.

À la fin de la prise d’échantillon, observer le capteur d’écoulement et détecter le deuxième intervalle d’air. À ce moment-là, réorienter les vannes de sortie vers le déchet. Une fois le volume total distribué, arrêter l’infusion de la pompe à seringue et mettre fin à la procédure d’automatisation.

Une fois l'expérience de séparation terminée, déconnectez les petits et grands flacons de collecte des échantillons de particules et conservez-les de manière appropriée pour les analyses ultérieures. Fixez le tube de prélèvement dans des flacons vides afin de recueillir les solutions de nettoyage excédentaires qui seront passées à travers les tubes. Ensuite, lancez la procédure automatisée de nettoyage du système telle que décrite dans le protocole textuel accompagnant.

Au cours de ce processus, le programme commande les vannes et la pompe à seringue pour charger séquentiellement la bobine de maintien avec des réactifs de nettoyage et les faire circuler à travers le système. Une fois le processus automatisé de nettoyage et de décontamination terminé, éliminer les solutions de rinçage excédentaires ainsi que les vials dans lesquelles elles ont été collectées, en suivant les procédures appropriées de manipulation des déchets biologiques ou chimiques. Voici un exemple de balayage de fréquence provenant d’un dispositif piézoélectrique et microfluidique correctement couplé.

Lorsque le couplage entre le piézo et le dispositif microfluidique est bon, les particules se concentrent étroitement à la fréquence de résonance, ce qui donne un pic net dans l'intensité de fluorescence et une migration vers la position de focalisation attendue. En revanche, lorsque le couplage est mauvais, les particules ne se focalisent pas correctement et le dispositif n'est pas adapté lorsque la focalisation de haute qualité ou un débit rapide sont essentiels pour l'application requise. Chaque ligne sur ce graphique représente les résultats de séparation obtenus avec différentes tailles de particules de polystyrène et différentes tensions d'excitation du piézo.

En général, des tensions plus élevées sont nécessaires pour extraire des particules plus petites. Toutefois, les tensions sèches ne peuvent pas être augmentées indéfiniment en raison d'une dissipation thermique accrue et des effets croissants du courant acoustique. Afin de démontrer l'utilité de cette plateforme pour la séparation de particules biologiques, des cellules humaines Raji, dont le diamètre moyen est de huit à 10 micromètres, ont été mélangées avec le virus de la dengue, ayant un diamètre approximatif de 50 nanomètres, puis séparées à l’aide du dispositif microfluidique acoustique.

Une fois qu'un système de ce type est assemblé et programmé, les séparations peuvent être réalisées de manière routinière en environ cinq minutes. Environ trois échantillons par heure peuvent être traités, avec un nettoyage et une décontamination complets entre chaque échantillon. Après cette procédure, d'autres méthodes peuvent être effectuées, telles que le dénombrement cellulaire, le western blot ou le séquençage de nouvelle génération, afin de confirmer la pureté de la séparation et d'élucider sa signification biologique.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de fabriquer un dispositif microfluidique de séparation typique. Utilisez des connexions monde vers puce pour interfacer avec le matériel et exécuter une procédure de séparation automatisée de manière précise et robuste. N’oubliez pas que le travail avec des matériaux infectieux peut être extrêmement dangereux et doit être effectué uniquement par du personnel dûment formé, en utilisant l’équipement et les procédures prescrites par l’institution en matière de sécurité biologique.