Name: Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 19 min 2 s
Description: Apprenez à produire des vecteurs AAV3 pour une thérapie génique ciblée contre le cancer du foie humain. Cette méthode démontre une transduction efficace des cellules cancéreuses hépatiques avec expression élevée d'EGFP.

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Nous remercions les Drs. R. Jude Samulski et Xiao Xiao pour leurs dons en nature de recombinaison AAV3 et AAV-EGFP plasmides, respectivement, et le Dr Gail Tomlinson pour avoir généreusement fourni les cellules Hep293TT. Cette recherche a été financée en partie par Service de santé publique accorde bourse R01 HL-076901, R01 HL-097088, et P01 DK-058327 (Projet 1) de la National Institutes of Health (AS).

1. Emballage de virus recombinants adéno-associé de sérotype 3 (rAAV3) Vecteurs <ol><li> Allez sur le site: " <a href="http://www.geguchadze.com/calc">http://www.geguchadze.com/calc</a> "et de calculer la quantité d'ADN. </li><li> Pré-mélange plasmides pHelper (aide adénovirus), pACG2c3 (AAV helper) et pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vecteur) dans un milieu sans SVF et des antibiotiques. Le volume total devrait être 8750 uL de dix à 15 cm 2 plaques. </li><li> Ajouter directement 1250 uL de PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) dans la solution d'ADN à l'étape 1.2. Vortex la solution d'ADN-Prince-Édouard pendant quelques secondes. </li><li> Incuber l'ADN-Prince-Édouard solution pour former un complexe de 5 min à température ambiante (RT). </li><li> Ajouter 1 mL de l'ADN-Prince-Édouard solution par 15 cm 2 plaques. </li><li> Retirer moyenne après 4 heures, en remplaçant avec des produits frais 25 ml de milieu complet 10% de FBS (C-DMEM). </li><li> Soixante-douze heures après transfection, les cellules gratter et verser dans un tube de 250 ml à centrifuger conique. </li><li> Centrifuger à 3000 rpm à 4 ° C pendant 10 min. Verser le liquide surnageant. </li><li> Re-suspendre le culot cellulaire dans 5 ml de RB TMS tampon (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, pH 8,0). Transfert à un nouveau 15 ml tube conique. </li><li> Congeler dans la glace sèche-éthanol de bain pendant 10 minutes et le dégel à 37 ° C pendant 10 min. Répétez trois fois. </li><li> Ajouter 1 ul de 4,8 M MgCl 2 et 2 pi de Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664-3). Vortex et laisser incuber à 37 ° C pendant 40 min. </li><li> Isoler à 4000 rpm à 4 ° C pendant 40 minutes et recueillir le surnageant (lysat clarifié). </li><li> Dans un tube de 13 ml à centrifuger Quick-Seal (Beckman, Cat # 342413), la charge iodixanol gradient (OptiPrep, Cat # 1114542) de haut en bas: 2 mL de 15%, 2 ml de 25%, 1,5 mL de 40% et 1,5 ml de iodixanol 60%. Chargez le surnageant (étape 1.12) sur le haut de la pente iodixanol. Remplir les tubes avec RB TMS Tampon. </li><li> Centrifuger à 75000 rpm pendant 1 heure à 16 ° C en utilisant Beckman 90TI rotor. </li><li> Recueillir la fraction iodixanol 40% en insérant une seringue à la limite de 40-60%. </li><li> Transfert de la fraction iodixanol 40% en un tube conique 50 ml et porter à 40 ml avec le tampon A. (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5) </li><li> Assembler l'appareil de filtration à l'aide HiTrap Q HP colonne (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Laver la colonne avec le tampon suivant: 25 ml de tampon A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5);; 25 ml de tampon B (Tris 10 mM, NaCl 500 mM, pH 8,5), 50 ml de tampon A 40 ml d'échantillon de virus dans le tampon A, 50 ml de tampon A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5);; 20 ml de tampon C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5) </li><li> Recueillir C dans un tampon concentrateurs 20 mL d'Apollo (Orbital Biosciences). Centrifuger à 3000 rpm à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Jeter l'effluent à travers et ajouter 20 ml de PBS et centrifuger refroidi à 3.000 tpm, à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Jeter l'effluent à travers et ajouter 500 ul de PBS refroidi. Lavez les vecteurs hors de la membrane et le transfert d'traité à la silicone et de stocker des tubes Eppendorf congelés dans de petites aliquotes à -80 ° C. </li></ol> 2. Détermination de rAAV3 Les titres Vecteur <ol><li> Dégeler 10 uL de virus purifié dans un tube Eppendorf sur la glace. Ajouter 40 uL de DDH 2 O. </li><li> Ajouter 0,2 ul de Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664) et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Prenez 50 uL de standard plasmidique (0,2 ng / uL) dans un autre tube Eppendorf. </li><li> Ajouter 50 ul de 100 mM NaOH dans chaque tube et incuber à 65 ° C pendant 30 min. </li><li> Réfrigérer la glace immédiatement pendant au moins 5 min. </li><li> Couper la membrane de transfert (Millipore, Cat # INYC00010) selon Bio-Dot Papier filtre (Bio-Rad, Cat # 1620161). Rincer la membrane en 10x SSC avec trois papiers filtres pendant 20 min. </li><li> Set slot blot SF Appareillage (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Connectez-vous à une fiole à vide et ajouter 100 ul de 10x SSC aux appareils slot blot. </li><li> Ajouter 100 ul de 20x SSC et 1 pl de colorant de chargement 6x à chacun des échantillons à l'étape 2.5. </li><li> Charge 100 ul de chaque échantillon sur la membrane de l'appareil slot blot. </li><li> Ajouter un autre uL 100 de 10x SSC dans chacun des échantillons. </li><li> Répétez les étapes 2.9 et 2.10 jusqu'à ce que tous les échantillons va à travers la membrane. </li><li> Démonter l'appareil et le slot blot retirer la membrane. Mettez-le en Linker inspecteur SL-1000 Crosslinker UV. Tourner sur "l'énergie", "Optimal Crosslink" (spectacle 1200) et pousser "Démarrer". </li><li> Faire bouillir 1 ml de sperme de saumon (SS) ADN (Fisher, Cat # NC9753983) pendant 5 min. Réfrigérer la glace pendant au moins 5 min. </li><li> Préparer la solution de pré-hybridation en mélangeant 27,5 ml de DDH 2 O, 15 ml de SSC 20x, 5 ml de solution 50x Denhardt, 1,25 mL de SDS 20%, 0,25 mL de Polya et 1 ml de SS ADN de l'étape 2.13. </li><li> Suspendre la membrane dans 25 ml de solution de pré-hybridation dans un cylindre de verre bouché et incuber à 65 ° C dans une chambre d'hybridation pendant la nuit. </li><li> Diluer 50 modèles ng d'ADN dans 10 ul de DDH 2 O. Faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur la glace immédiatement pendant au moins 5 min. </li><li> Centrifuger à 3000 rpm à température ambiante pendant 1 min. Ajouter 2 ul de 10 mM dNTP 3 (manque dCTP), 2 pl de Mix hexanucléotide (Roche, Cat # 11277081001), 1 pl de Klenow (Roche, Cat # 11008404001) et 5 pi de α -32 P-dCTP. Incuber à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Centrifugeuse G-50 colonnes (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) à 3000 rpm pendant 2 min. la charge de la sonde à l'étape 2.17 dans la colonne. Centrifuger à 3000 rpm pendant 2 min et recueillir les actions accréditives. </li><li> Comptez radioactivité. Faire bouillir la sonde à 100 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur la glace immédiatement pendant au moins 5 min. </li><li> Ajouter la sonde (6x10 5 cpm / ml) dans la solution de pré-hybridation avec la membrane. </li><li> Incuber une nuit à 65 ° C dans une chambre d'hybridation. </li><li> Jeter la solution d'hybridation et rincer la membrane dans 2x SSC 0,1% SDS à température ambiante pendant 15 min. </li><li> Jeter la solution et rincer la membrane de 0,1 x SSC + 0,1% SDS à 65 ° C pendant 30 min. </li><li> Jeter la solution et rincer la membrane de 0,1 x SSC à brève RT. </li><li> Exposer le film à -80 ° C pendant 6 heures et de développer le film. Un résultat typique est montré dans la figure 1. </li></ol> 3. rAAV3 Vecteur médiée Transduction et l'expression du transgène dans les cellules humaines de cancer du foie <ol><li> Graine 1x10 4 cellules (soit Huh7 ou Hep293TT) dans chaque puits de plaque de 96 puits. Incuber dans un incubateur humidifié CO 2 pendant au moins 18 heures. </li><li> Retirer de la plaque de support de 96 puits. </li><li> Laver les cellules deux fois avec 50 ul de milieu sans SVF et des antibiotiques et à enlever. </li><li> Ajouter 50 uL de milieu sans SVF et des antibiotiques et des vecteurs rAAV à 5000 vgs / cellule. </li><li> Incuber les plaques dans l'incubateur CO 2 pendant 4 heures. </li><li> Jeter la moyenne. Laver les cellules deux fois avec 50 ul de milieu complet et à enlever. </li><li> Ajouter 150 pi de DMEM-C dans chaque puits et incuber la plaque dans incubateur à CO 2 pendant 72 heures, et de visualiser l'expression de l'EGFP en utilisant un microscope à fluorescence (DMI 4000B; Leica Microsystems). </li><li> Images à partir de trois puits de cellules infectées sont analysées quantitativement par ImageJ logiciels d'analyse (NIH, Bethesda, MD, USA). </li><li> L'expression du transgène est évalué comme surface totale de fluorescence verte (2 pixels) par le champ visuel. Un résultat typique est montré dans la figure 2. </li><li> L'expression du transgène peut également être déterminée par cytométrie en flux. </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: En suivant le protocole décrit ci-dessus, on peut générer des vecteurs AAV de sérotype efficacement. Le rendement typique est d'environ 500 uL contenant ~ 10 11 vgs / uL d'purifiée stock de vecteur. La pureté du stock de vecteur est déterminé en comparant les signaux d'hybridation sur taches quantitatives emplacement de l'ADN, avec et sans la digestion Benzonase. Purifié rAAV3 vecteurs transduire un cancer du foie humain - hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC) - lignées cellulaires de façon efficace. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig1.jpg" alt="Figure 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 1"> Figure 1. Quantitative ADN slot-blot pour déterminer les titres des rAAV3 vecteurs. Deux dilutions des stocks viraux purifiés, digérés avec Benzonase (rangée du haut) ont été analysés sur quantitatives taches slot d'ADN avec 32 P-étiquetés sonde d'ADN spécifique EGFP. Le titre du AAV3 vecteur a été déterminée par comparaison avec 1 ng (rangée du milieu) ou 10 ng (rangée du bas) de l'AAV-EGFP normes plasmide chargé sur la membrane. Les numéros correspondent aux copies d'ADN. <img src="/files/ftp_upload/2538/2538fig2.jpg" alt="Figure 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figure 2"> Figure 2. Vecteur AAV recombinant médiée par l'expression du transgène dans les cellules humaines de cancer du foie. Cellules Hep293TT, une création récente lignée humaine de cellules d'hépatoblastome 4, ont été soit (à gauche) maquette infectés, ou transduites avec 5000 vgs / cellule soit scAAV2-EGFP ou scAAV3-EGFP vecteurs à 37 ° C pendant 2 heures. L'expression du transgène a été visualisée 72 heures après la transduction utilisant un microscope à fluorescence.

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Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus non pathogène pour l&#39;homme, le virus adéno-associé (AAV) ont été développés et sont actuellement en usage dans un certain nombre d&#39;essais cliniques de thérapie génique 5. Auparavant, les 10 sérotypes les plus couramment utilisés AAV, l&#39;efficacité de la transduction des vecteurs AAV3 en général a été signalé comme étant particulièrement faible, tant in vitro et in vivo 1. Cependant, notre observation récente que AAV3 vecteurs transduire des lignées cellulaires de cancer du foie, excessivement bien, tel que déterminé quantitativement par deux cytométrie en flux, et que AAV3 utilise le récepteur hépatocytaire humaine du facteur de croissance (hHGFR) comme un co-récepteur cellulaire d&#39;entrée obligatoire et dans ces cellules 3, suggèrent fortement une approche sélective des tissus tropisme du AAV3 des cellules hépatiques humaines en général, et des cellules humaines de cancer du foie en particulier. Toutefois, depuis AAV3 vecteurs aussi transduire efficacement les hépatocytes humains normaux 2, leur utilisation potentielle dans le traitement du cancer de demande de gène in vivo seraient affectées négativement. Une stratégie possible pour contourner ce problème potentiel transcriptionnel implique le ciblage des cellules cancéreuses en identifiant un produit génique qui est sélectivement produites par la tumeur, mais pas par les hépatocytes normaux. Par exemple, des études antérieures ont montré que les concentrations sériques de α-foetoprotéine (AFP) sont utilisés comme un marqueur spécifique pour le suivi de la présence, la progression et / ou à la réapparition de certains types de cancers du foie, puisque les hépatocytes normaux produisent généralement de très petites quantités cette protéine. En effet, nous avons utilisé AAV3 vecteurs contenant le promoteur AFP pour cibler l&#39;expression du transgène dans les cellules de cancer du foie, mais pas dans les hépatocytes normaux 2, et des études sont actuellement en cours pour tester l&#39;efficacité de cette approche dans un modèle murin de xénogreffe de cancer du foie. Dans nos études supplémentaires, nous avons observé que l&#39;efficacité de transduction des différents vecteurs AAV de sérotype peut être considérablement augmentée par mutagenèse dirigée de la surface exposée résidus tyrosines dans les capsides virales 6-14. Depuis 6 sur 7 exposées à la surface tyrosines sont également conservées dans AAV3, nous avons effectué une mutagenèse dirigée de ces résidus ainsi observé que l&#39;efficacité de transduction de la tyrosine-mutant AAV3 vecteurs est significativement accrue dans les cellules humaines de cancer du foie (données non publiées). Des études sont également en cours pour évaluer l&#39;innocuité et l&#39;efficacité de la tyrosine-AAV3 mutant vecteurs dans des modèles de xénogreffe de souris pour hépatoblastome humain et le carcinome hépatocellulaire, et en cas de succès, la tyrosine-optimale mutant vecteurs sérotype AAV3 peuvent se révéler utiles pour le ciblage du foie humain cancers de la thérapie génique potentielle.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-0170CM</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>Colonne HiTrap Q HP</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1154-01</td><td></td></tr><tr><td>ADN de sperme de saumon</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9753983</td><td></td></tr><tr><td>Gradient d'iodixanol</td><td>OptiPrep</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes G-50</td><td>GE Healthcare</td><td>27-5330-01</td><td></td></tr></tbody></table>

haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 vecteurs

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors 

Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus non-pathogènes humains, le virus adéno-associé 2 (AAV2) ont été développés et sont actuellement en usage dans un certain nombre d&#39;essais cliniques de thérapie génique. Plus récemment, un certain nombre de sérotypes AAV supplémentaires ont également été isolées, qui ont été montrés à l&#39;exposition sélective des tissus tropisme dans divers modèles animaux petits et grands 1. Parmi les 10 sérotypes les plus couramment utilisés AAV, AAV3 est de loin la moins efficace dans la transduction de cellules et de tissus in vitro ainsi que in vivo. Cependant, dans nos études publiées récemment, nous avons documenté que AAV3 vecteurs transduire un cancer du foie humain - hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC) - lignées cellulaires de manière extrêmement efficace, car AAV3 utilise des récepteurs humains facteur de croissance des hépatocytes comme un co-récepteur cellulaire pour la liaison et l&#39;entrée dans ces cellules 2,3. Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour atteindre de haute efficacité de transduction des cellules humaines de cancer du foie par recombinaison AAV3 vecteurs portant un gène rapporteur. L&#39;utilisation de recombinants AAV3 vecteurs portant un gène thérapeutique peut éventuellement conduire à la thérapie génique potentiel de cancers du foie chez les humains.

Dans cet article, nous décrivons l&#39;identification du virus adéno-associé de sérotype 3 (AAV3) comme le vecteur le plus efficace pour cibler les cellules humaines de cancer du foie.

Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus humain non pathogène, le virus adéno-associé 2 (AAV2), ont été développés et sont actuellement utilisés dans un...

L'objectif général de cette procédure est de produire des vecteurs actifs de virus adéno-associé de sérotype trois capables de transduire efficacement des cellules humaines de cancer du foie. Cela est réalisé en transfectant d'abord simultanément trois plasmides différents dans des cellules 293. La deuxième étape de la procédure consiste à purifier les particules de VAA3 assemblées dans les cellules 293.La troisième étape de la procédure consiste à déterminer le titre du lot purifié du vecteur AAV trois. La dernière étape de la procédure est de transduire des cellules humaines de cancer du foie à l'aide des vecteurs AAV trois purifiés. En définitive, des résultats peuvent être obtenus montrant une protéine EGFP fortement exprimée dans les cellules humaines de cancer du foie par microscopie de fluorescence.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes réside dans l'obtention d'une forte efficacité de transfert et d'expression génique dans les cellules cancéreuses humaines du foie. Bien que cette méthode permette de mieux comprendre la production de trois vecteurs AAV, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme les vecteurs AAV2 plus couramment utilisés. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison du grand nombre d'étapes impliquées, qui peuvent s'avérer fastidieuses. La procédure sera démontrée par un scientifique biologiste de notre laboratoire.Les manipulations expérimentales décrites dans cette section du protocole sont effectuées dans une hotte de culture tissulaire 48 heures avant le début de cette procédure. Ensemencez 10 boîtes de culture tissulaire de 15 centimètres avec la lignée cellulaire de rein embryonnaire humain 2, 9 3 de manière à ce que les cellules soient confluentes à 70 à 80 % le jour de la transfection. Utilisez le site web www.ge shae. com/calc pour calculer la quantité d'ADN plasmidique à utiliser pour la transfection. Une fois les volumes corrects d'ADN plasmidique calculés, passez à la transfection : pipetez un volume approprié de milieu de culture cellulaire sans FBS ni antibiotiques dans un tube stérile de 15 millilitres.Ensuite, pipetez les volumes requis de P helper, PACG deux, C3 et PDSA AAV C-B-E-G-F-P dans le milieu. Le volume total doit être de 8 750 microlitres pour 10 plaques de 15 centimètres ; pipetez 1 250 microlitres de PEI dans le milieu contenant l'ADN plasmidique, vortexez la solution ADN-PEI pendant quelques secondes, puis incubez la solution ADN-PEI pendant cinq minutes à température ambiante pour permettre la formation des complexes ADN-PEI. Récupérez les 10 plaques de 15 centimètres de cellules HEC 293 à partir de l'incubateur de culture tissulaire.Ensuite, pipetez un microlitre de solution D-N-A-P-E-I dans chacune des plaques. Incubez les plaques dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant quatre à six heures. Après quatre à six heures, aspirez soigneusement le milieu des plaques.Ensuite, pipeter 25 millilitres de milieu complet avec 10 %FBS dans chaque plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 %dioxyde de carbone pendant environ 72 heures. Une fois les 72 heures écoulées, retirer les plaques de l’incubateur et retourner sous la hotte de culture tissulaire.Ensuite, sans aspirer le milieu de la plaque, utilisez un grattoir à cellules pour détacher la couche cellulaire du fond de la plaque dans le milieu de culture cellulaire. Versez le milieu contenant les cellules dans un tube conique de centrifugeuse de 250 millilitres. Répétez cette procédure pour chacune des plaques transfectées, en versant le contenu de chaque plaque dans le même tube conique de centrifugeuse de 250 millilitres.Faire tourner le tube contenant les cellules et le milieu dans une centrifugeuse réfrigérée. Centrifuger à 4 °C pendant 10 minutes à 3000 rotations par minute. Après la centrifugation, éliminer le surnageant, puis ajouter cinq millilitres de tampon RB TMS sur le culot à l’aide d’une pipette et resuspendre. Transférer la solution cellulaire dans un tube conique propre de 15 millilitres.Placer le tube de 15 millilitres dans un bain d'éthanol refroidi à la glace sèche pour congeler pendant 10 minutes. Une fois le temps d'incubation écoulé, retirer le tube et le placer à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour décongeler, répéter ce cycle de congélation-décongélation encore deux fois.Vortexez le tube pendant quelques secondes. Après chaque décongélation, à l’issue de la période de décongélation finale, prélevez à la pipette un microlitre de chlorure de magnésium 4,8 M et deux microlitres de benon nase à 25 unités par microlitre, puis ajoutez-les à la solution cellulaire en vortexant pour homogénéiser.Ensuite, incuber à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes après l'incubation. Placer le tube dans une centrifugeuse réfrigérée à quatre degrés Celsius et centrifuger à 4 000 tours par minute pendant 40 minutes. À la fin de la période de centrifugation, préparer le gradient IAL à utiliser pour la purification du virus. Pour ce faire, pipeter deux millilitres de 15 %, deux millilitres de 25 %, 1,5 millilitre de 40 % et 1,5 millilitre de 60 % d'IAL dans un tube de centrifugeuse scellé de 13 millilitres.Après la centrifugation, prélevez au pipetage le surnageant S du tube de centrifugation en prenant soin de ne pas perturber le culot cellulaire, déposez le surnageant sur le gradient IAL, puis ajoutez suffisamment de tampon RB TMS dans le tube pour le remplir complètement. Placez le tube dans un rotor Beckman 90 TI en veillant à bien équilibrer le rotor. Effectuez la centrifugation à 75 000 tours par minute pendant une heure à 16 degrés Celsius.Après la centrifugation, récupérez la fraction 40 % IAL en insérant une seringue de cinq millilitres équipée d'une aiguille de calibre 18 dans le gradient idal à la frontière entre 40 et 60 %. Aspirez soigneusement à l’aide de la seringue et collectez la fraction idal 40 %.Expulsez la fraction IAL à 40 % de la seringue dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, complétez le volume jusqu'à un volume final de 40 millilitres avec le tampon a. Assemblez l'appareil de filtration en utilisant une colonne High Trap Q HP selon les instructions du fabricant.Ensuite, lavez la colonne avec les solutions suivantes : 25 millilitres de tampon A, 25 millilitres de tampon B, 50 millilitres de tampon A, 40 millilitres de l'échantillon viral idal préparé dans du tampon A, 50 millilitres de tampon A, et enfin 20 millilitres de tampon C. Récupérez le tampon C dans un concentrateur Apollo de 20 millilitres. Ensuite, centrifugez l'échantillon dans une centrifugeuse refroidie réglée à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 3000 tours par minute ; après la centrifugation, jetez le flux traversant.Ensuite, ajoutez 20 millilitres de PBS froid au concentrateur Apollo et centrifugez à nouveau dans une centrifugeuse froide à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 3000 tours par minute après la centrifugation. Jetez à nouveau le flux, puis pipetez 500 microlitres de PBS froid sur la membrane afin de resuspendre le virus à partir de la membrane. Ensuite, pipetez des aliquotes de 10 microlitres du vecteur viral dans des tubes Eppendorf traités au silicone et conservez-les à moins 80 degrés Celsius jusqu'à utilisation. Décongelez une des aliquotes de 10 microlitres de virus purifié sur de la glace.Introduisez 40 microlitres d'eau doublement distillée dans le tube pour diluer le virus. Ajoutez ensuite 0,2 microlitre de Ben Nase à 25 unités par microlitre et incubez une heure à 37 degrés Celsius. Pendant ce temps, introduisez 50 microlitres d'étalon plasmidique à 0,2 nanogramme par microlitre dans un tube Eppendorf propre.Après l'incubation, ajouter 50 microlitres d'hydroxyde de sodium à 100 millimolaire dans le tube contenant le virus. Ajouter le mélange Bens aase dans le tube contenant l'étalon plasmidique. Incuber les deux tubes à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes.Une fois les 30 minutes écoulées, refroidir immédiatement les deux tubes sur de la glace pendant au moins cinq minutes. Ensuite, découper un morceau de membrane de transfert de la même taille qu'un morceau de papier filtre bio dot. Placer la membrane de transfert et trois morceaux de papier filtre bio dans un plateau peu profond.Remplissez le bac avec du SSC 10 fois et laissez tremper pendant 20 minutes, pendant que la membrane trempe. Installez l'appareil SF à bloc de fentes conformément aux instructions du fabricant. Connectez l'appareil à un flacon sous vide, puis pipetez 100 microlitres de SSC 10 fois dans chacune des fentes destinées à recevoir la dilution de l'échantillon viral et l'étalon plasmidique.Retirer les tubes de la centrifugeuse réfrigérée à glace centrifusion réglée à quatre degrés Celsius pendant une minute à 13 000 tours par minute. Ajouter ensuite 100 microlitres de SSC 20 fois et un microlitre de colorant de charge 6 fois à chaque tube. Puis pipeter 100 microlitres supplémentaires de SSC 10 fois dans chaque tube et charger 100 microlitres de chaque échantillon dans des emplacements adjacents.Répétez la procédure de dilution et de chargement jusqu'à ce que le volume total de chaque échantillon ait été chargé dans l'appareil à fentes, avec des ajouts supplémentaires de 10 fois SSC, jusqu'à un volume de 100 microlitres ou moins. Une fois que tous les échantillons ont traversé la membrane, démontez l'appareil à fentes et retirez la membrane à l’aide de pinces. Manipulez la membrane par les bords avec précaution et placez-la dans la chambre du lieur inspecteur SL 1000 pour réticulation UV.Ensuite, sélectionnez l'énergie optimale ; la réticulation doit durer environ 30 secondes. Préparez maintenant l'hybridation en portant à ébullition un millilitre d'ADN de sperme de saumon pendant cinq minutes. Après ébullition pendant cinq minutes, l'ADN de sperme de saumon doit être immédiatement refroidi sur de la glace pendant au moins cinq minutes.Préparez ensuite la solution de pré-hybridation conformément au protocole écrit. Pipetez 25 millilitres de la solution de pré-hybridation contenant de l'ADN de sperme de saumon dans un tube d'hybridation. Transférez délicatement la membrane réticulée dans le tube d'hybridation, puis placez le bouchon sur le tube, en veillant à ce que la solution de pré-hybridation recouvre complètement la membrane.En position horizontale, incuber toute la nuit dans une chambre d'hybridation à 65 degrés Celsius. Le lendemain, commencer la préparation de la sonde en pipetant 50 nanogrammes de matrice d'ADN dans un tube einor et en ajoutant 10 microlitres d'eau doublement distillée pour diluer, faire bouillir l'ADN dilué pendant cinq minutes, puis refroidir immédiatement sur de la glace pendant au moins cinq minutes après le refroidissement. Centrifuger la matrice d'ADN diluée à 13 000 tours par minute pendant une minute à température ambiante.Ensuite, procéder conformément aux directives de sécurité relatives aux rayonnements de l'institution. Préparer la sonde radioactive en ajoutant deux microlitres de DNTP à 10 millimolaire sans dCTP et deux microlitres d'hexanucléotide. Mélanger un microlitre d'AU et cinq microlitres de 32P-dCTP, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure après l'incubation.Préparez les colonnes G 50 par centrifusion à 3000 tours par minute pendant deux minutes. Ensuite, chargez la sonde sur la colonne et centrifugez votre éluat à 3000 tours par minute pendant deux minutes, puis récupérez l'écoulement. À ce stade, l'activité radioactive de l'écoulement est mesurée selon des procédures standard afin de déterminer les impulsions par minute par millilitre de la sonde.Ensuite, faites bouillir la sonde pendant cinq minutes. Après cela, refroidissez immédiatement la sonde sur de la glace pendant cinq minutes. La sonde est alors prête à être utilisée pour l'hybridation sans retirer la membrane.Prélèver le sonde à une concentration de six fois le centre des cinq comptes par minute par millilitre directement dans la solution de pré-hybridation contenue dans le tube d'hybridation. Incuber la chambre d'hybridation toute la nuit à 65 degrés Celsius le jour suivant. Jeter la solution d'hybridation conformément aux protocoles institutionnels de gestion des radioactivités et prélever 25 millilitres de SSC deux fois plus 0,1 % de SDS dans le tube, puis laver la membrane pendant 15 minutes à température ambiante.Jetez la solution et pipetez 25 millilitres de SSC 0,1 fois plus 0,1 % de SDS dans le tube. Lavez la membrane à 65 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après ce lavage, jetez la solution et rincez brièvement la membrane avec 25 millilitres de SSC 0,1 fois à température ambiante.Enveloppez la membrane dans du film transparent et placez-la dans une cassette de pose en travaillant à l'obscurité. Déposez une feuille de film sur la membrane et fermez la cassette pour la protéger de la lumière. Placez la cassette de pose dans l'enceinte congelée à moins 80 degrés Celsius pendant six heures.Après six heures, révélez le film et déterminez le titre des stocks viraux en comparant la densité des bandes virales aux bandes provenant des standards de plasmide. Une fois le titre déterminé, le virus peut être utilisé pour transduire les cellules ; commencez par semer un fois dix puissance quatre cellules Hep 293 TT.Dans chaque puits d'une plaque de 96 puits, incuber les cellules pendant au moins 18 heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, aspirer le milieu de chaque puits et pipeter soigneusement 50 microlitres de milieu sans antibiotiques ni FBS dans chacun. Aspirer ce milieu, puis répéter la procédure afin de laver les cellules. Diluez les vecteurs recombinants a a v dans du milieu sans FBS ni antibiotiques jusqu'à une concentration finale de 5 000 VGS par cellule. Ajoutez 50 microlitres de cette solution ou 50 microlitres de milieu sans FBS en tant que témoin négatif dans les puits de la plaque 96 puits, puis incubez pendant deux heures dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, retirez le milieu contenant le virus et lavez les cellules deux fois comme précédemment, en utilisant 50 microlitres de milieu complet par puits. Après avoir éliminé le dernier lavage, ajouter 150 microlitres de milieu complet dans chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 72 heures. Enfin, visualiser l'expression de l'EGFP par microscopie à fluorescence. L'intensité de fluorescence peut être quantifiée à l'aide du logiciel Image J, l'expression du transgène étant évaluée par la surface totale de fluorescence verte par champ observé.Un exemple de bloc quantitatif à fentes pour l'ADN permettant de déterminer les titres de vecteurs RAV3 est présenté ici. Cette membrane a été hybridée avec une sonde d'ADN spécifique marquée au P32 contre EGFP. La rangée supérieure du bloc comprend des dilutions au double de stocks viraux purifiés digérés par la Ben Nase.Les rangées du milieu et du bas sont composées d'étalons A-A-V-E-G-F-P dilués à partir d'un nanogramme ou de dix nanogrammes de plasmide, respectivement. Le titre des stocks viraux est déterminé par comparaison avec les étalons de plasmide. Les nombres indiqués sur le blot correspondent au nombre de copies d'ADN plasmidique.Il s'agit d'un exemple d'expression de transgène médiée par un vecteur de type AAV recombinant. Dans une lignée cellulaire d'hépatoblastome humain, les cellules ont été visualisées 72 heures après la transduction à l'aide d'un microscope à fluorescence. La première image illustre les résultats d'une infection témoin.La deuxième image montre des cellules HEP 2 93 TT transduites avec 5&nbsp;000 VGS par cellule de tous les vecteurs AAV deux EGFP à 37 degrés Celsius pendant deux heures. L'image finale montre la transduction avec 5&nbsp;000 VGS par cellule de R AAV trois EEG FP dans les mêmes conditions. On observe que RAAV trois est nettement plus efficace pour transduire ce type cellulaire par rapport à R AAV deux.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la thérapie génique, comme la façon de cibler les cellules cancéreuses du foie humain. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du cancer du foie humain, car un V trois possède la capacité d'exprimer un gène thérapeutique spécifiquement dans le cancer du foie humain à un niveau élevé.

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