Détection biomoléculaire employant le capteur interférométrique Réflectance Imaging (IRIS)

L'objectif général de l'expérience suivante est de quantifier la liaison d'anticorps à des antigènes immobilisés en surface à l'aide d'une plateforme de détection sensible et sans marquage appelée Iris. Cela est réalisé en préparant d'abord un réseau de sondes de test et de sondes témoins sur une surface uniforme de dioxyde de silicium chimiquement fonctionnalisée afin de capturer des protéines ciblées en solution. Les sondes immobilisées peuvent être des anticorps ou des antigènes, de l'ADN ou de l'ARN, ou tout autre type de macromolécule compatible avec les chimies de surface fonctionnalisées, polymériques ou saines.

La puces préparée est ensuite incubée avec un échantillon contenant les protéines d'intérêt, ce qui permet la liaison dans des conditions spécifiées par le chercheur. Ensuite, l'ensemble de la matrice de capteurs est imagée à différentes longueurs d'onde de lumière. Avec le système IRIS, les intensités réfléchies de chaque pixel sont traitées à l'aide d'algorithmes codés sur mesure.

Afin de quantifier la quantité de biomatériau liée à chaque condition test ou contrôle, des résultats post-incubation sont obtenus, montrant une détection efficace et une quantification absolue d'anticorps dans un mélange complexe, basée sur les mesures interférométriques sans étiquette de ce système. S'appuyant sur plus d'une décennie de recherche et de développement concernant les dispositifs optiques par interférence et les cavités en résine, nous développons cette nouvelle méthode qui pourrait surmonter de nombreux problèmes perturbateurs rencontrés avec nos précédents systèmes de biosenseurs sans étiquette. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de collecte des données exigent que les procédures correctes de normalisation et de contrôle qualité soient suivies. Pour garantir une acquisition de données précise et reproductible.

Pour recouvrir simultanément ses substrats de dioxyde de silicium avec des copolymères auto-absorbés de NAS DMMA, préparez d'abord la solution polymère en ajoutant 100 milligrammes de polymère à cinq millilitres d'eau déionisée. Ajoutez ensuite cinq millilitres de sulfate d'ammonium saturé à 40 %, afin d'obtenir une concentration finale de sulfate d'ammonium de 0,92 molaire. Plongez les puces dans la solution polymère pendant 30 minutes sur un agitateur rotatif après l'incubation.

Rincez soigneusement les puces avec de l'eau déionisée, séchez-les à l'aide d'un gaz argon ou azote, puis faites-les cuire à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes. Conservez les puces de substrat revêtues de polymère dans un environnement sec, tel qu'un dessiccateur sous vide, pendant deux à trois mois maximum, jusqu'à l'étape de dépôt des sondes permettant de diluer chaque sonde. Déterminez d'abord le volume correct de la solution mère de sonde et du tampon afin d'obtenir la concentration finale souhaitée.

Une expérience typique utilise un antigène ou une IgG à une concentration de 0,5 milligramme par millilitre dans du tampon phosphate salin, en ajoutant la quantité calculée de chaque solution mère de sonde à de petits tubes Eppendorf contenant la quantité souhaitée de tampon PBS, puis en mélangeant les solutions. Ensuite, prélevez à l’aide d’une pipette les solutions de sonde dans une plaque 96 puits à faible fixation des protéines, qui servira de plaque source pour le distributeur. Définissez ensuite les paramètres de dépôt pour le réseau imprimé en déterminant le nombre de réplicats de chaque condition par grille.

La disposition en grille définit le nombre de grilles répliquées et l'emplacement de dépôt souhaité sur la puce. Placez le substrat et la plaque source dans le distributeur, puis vérifiez les bouteilles de déchets et d'approvisionnement. Lancez l'opération d'impression.

Une fois le dépôt terminé, placer le substrat dans un environnement à forte humidité pendant la nuit afin de permettre l'immobilisation et la déactivation après incubation. Laver les substrats avec agitation en plaçant d'abord la puce dans du PBS contenant 0,1 % de Tween pendant trois minutes, et ce, trois fois de manière séparée. Procéder ensuite à trois incubations de trois minutes dans du PBS, puis dans de l'eau déionisée.

Si l'on effectue une mesure à sec, sécher soigneusement la puce à l'aide de gaz argon. Désactiver les groupes NHS restants à la surface du copolymère en plongeant les puces dans une solution de 50 millimolaire d'éthanolamine, dont le pH a été ajusté à 7,4, pendant 30 minutes sur une plaque agitatrice. Rincer soigneusement l'éthanolamine à l'aide de PBS, puis d'eau déionisée, avant de commencer la procédure d'incubation.

Préparez une solution de la concentration appropriée de la protéine cible dans du PBS pour cette démonstration. Une concentration de 500 nanogrammes par millilitre d'albumine sérique humaine est utilisée, en incluant un volume équivalent de tampon sans protéine cible pour l'incubation du témoin négatif. Le système d'iris est composé de quelques éléments de base, tels qu'une source d'illumination, des composants optiques permettant d'éclairer correctement le réseau de sondes capteurs, une caméra pour enregistrer les intensités de lumière réfléchie, et une platine sur laquelle l'échantillon est placé pour les mesures.

Commencez par une analyse miroir en silicium d'une puce de silicium propre et nue afin de normaliser toutes les données recueillies ultérieurement avant d'effectuer l'analyse. Préparez le système d'iris en ajustant les paramètres de l'expérience. Cela inclut la mesure de l'histogramme des intensités lumineuses enregistrées par la caméra, ainsi que le réglage du temps d'exposition pour des intensités optimales.

Après le balayage de normalisation, charger la matrice de sondes préparée dans le système iris et effectuer la configuration comme précédemment, régler la mise au point afin d'obtenir une image correcte de la surface du substrat. S'assurer que la platine d'échantillonnage est bien de niveau en examinant les histogrammes enregistrés des intensités de lumière réfléchie. Enfin, choisir un nom de fichier pour enregistrer les données.

Initialisez le logiciel pour numériser la matrice, ce qui illumine la surface à différentes longueurs d'onde plusieurs fois et moyenne les images recueillies. Le point initial de référence optique élevé est déterminé, permettant une analyse correcte des changements de masse à la surface après l'incubation suivant la numérisation initiale. Plongez la puce dans la solution d'incubation préparée pendant une heure sur une plaque agitée. La durée d'incubation peut varier considérablement selon le niveau de végétation, la concentration de l'élément cible à détecter et les affinités du couple sonde-cible.

Après l'incubation, répétez la procédure de lavage comme effectuée précédemment. Analysez le même réseau de protéines à l'aide du système iris afin d'obtenir des images post-incubation pour comparaison avec celles pré-incubation. Ce processus peut être répété pour différentes étapes d'incubation si nécessaire.

Par exemple, dans un format de dosage sandwich utilisant un anticorps secondaire, ajustez les images recueillies pour chaque analyse d'iris à l'aide d'un logiciel développé commercialement afin de produire une image du proby contenant la formation d'épaisseur optique. Une analyse qualitative rapide des interactions peut être réalisée en soustrayant les images post-incubation des images pré-incubation. La liaison apparaîtra comme un changement d'intensité aux endroits où des variations de masse ont été observées.

Pour l'analyse quantitative, déterminez les densités massiques de chaque tache par rapport au fond en faisant la moyenne des informations d'épaisseur optique pour chaque pixel à l'intérieur d'une tache et pour une annule située à l'extérieur de la tache. Effectuez ensuite une comparaison directe de ces deux zones illustrées ici. À titre d'exemple, schéma du substrat en silicium stratifié, avec un iris en dioxyde de silicium, sur lequel est déposée une matrice d'anticorps représentative.

Chaque ensemble d'anticorps est déposé en réplicat avec une spécificité pour un épitope différent, ciblant une protéine distincte. Deux virus entiers différents et une protéine virale sont représentés à titre d'exemple de cibles. Les anticorps témoins négatifs dépendent du test et peuvent être non spécifiques ou spécifiques au virus.

Voici un exemple de résultats qualitatifs concernant la liaison d'anticorps spécifiques de l'albumine sérique humaine à un réseau de points d'albumine sérique humaine (HSA) et de points témoins d'IgG de lapin, comme indiqué ici. Après ajustement et détermination de l'épaisseur optique des images avant et après incubation, une image de différence pour le réseau de liaison peut être créée afin d'évaluer rapidement la liaison. Une analyse quantitative plus poussée révèle un changement moyen de hauteur optique de 2,05 et 0,13 nanomètre respectivement pour les points HSA et IgG de lapin, avec une concentration d'incubation d'anti-HSA de 500 nanogrammes par millilitre.

Ce graphique en barres représente un exemple de données quantitatives que peuvent fournir les mesures d'iris. Dans cet exemple, on présente la dépendance de la liaison des protéines de fourrure à la concentration en protéine et à la longueur de tous les ligaments double brin. Ce graphique en barres montre les mesures absolues de hauteur optique pour les hauteurs initiales des propylènes de ligament immobilisés et après incubation pour la liaison.

Des concentrations croissantes de la protéine Fur, à 5, 100 et 200 nanomolaires, ont entraîné une augmentation de la liaison aux sondes d'ADN. Ici, la liaison du dimère de la protéine Fur par ligament d'ADN double brin est indiquée. La liaison dimérique a augmenté de manière significative à une concentration de 200 nanomolaires de la protéine Fur, suggérant un niveau élevé d'interactions non spécifiques avec tous les ligaments ou un mécanisme différent de liaison de la protéine Fur, tel que l'agrégation de plusieurs dimères.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de commencer avec des substrats propres et uniformes possédant une épaisseur d'oxyde appropriée, et de maintenir la propreté des échantillons en les manipulant soigneusement à l’aide de pinces. Il est également essentiel d’utiliser des réactifs correctement stockés et dont l’activité est confirmée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mesurer des interactions biomoléculaires en format sans marquage, grâce à la préparation de puces à sondes fonctionnelles sur une surface de dioxyde de silicium, ainsi que de l’acquisition et de l’analyse des données à l’aide du capteur d’imagerie par réflectance interférométrique, ou iris.