Visualisation de MG53 médiation réparation de la membrane cellulaire utilisant In vivo Et In vitro Systèmes

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la capacité de réparation membranaire tant chez l'animal que dans les cellules isolées. Des fibres musculaires squelettiques isolées sont recueillies et entourées d'un milieu contenant le colorant FM 1-43. Un laser UV est ensuite utilisé pour irradier et endommager une partie de la membrane cellulaire, permettant ainsi l'entrée du colorant dans la cellule.

Les cellules isolées sont transfectées avec de l'ADN plasmidique exprimant la protéine GFP MG 53, qui se localisera à la membrane plasmique et dans le cytosol de la cellule. La pointe d'une microélectrode est ensuite insérée dans la membrane C deux C 12 afin d'induire un dommage. En fin de compte, des résultats peuvent être obtenus montrant la translocation de la GFP MG 53 vers le site de lésion.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle implique des pratiques nécessaires pour maîtriser les techniques de pénétration par microélectrode et d'isolement des fibres musculaires. La procédure sera démontrée par le Dr Lin, notre responsable de laboratoire, le Dr Wazu, chercheur postdoctoral, Matt Orange, étudiant diplômé, et le Dr Shaza, professeur adjoint de recherche dans notre département. Pour commencer, placez un plateau ou un tapis de laboratoire bleu sous le tapis roulant afin de recueillir les déchets provenant des animaux durant l'expérience.

Ensuite, réglez l'angle de la surface du tapis roulant. Certains tapis roulants possèdent un dispositif intégré permettant d'ajuster la pente, tandis que d'autres nécessitent d'être surélevés par d'autres moyens. On utilise généralement une surface plane ou un angle compris entre sept et 15 degrés en montée ou en descente.

Acclimatez les souris en les plaçant sur le tapis roulant avec la grille électrique éteinte et le moteur d'entraînement du tapis allumé, mais à l'arrêt, pendant 15 minutes. À l'issue de la période d'acclimatation, allumez la grille électrique de motivation. Démarrez le tapis roulant à une vitesse initiale d'environ cinq mètres par minute. Augmentez la vitesse d'un à deux mètres par minute chaque minute, en accordant à l'animal une période d'échauffement de cinq minutes.

Répétez cette période d'échauffement chaque jour pendant trois à dix jours afin d'augmenter l'observance pendant les tests. Pour effectuer un exercice aigu d'épuisement, augmentez progressivement la vitesse du tapis roulant jusqu'à atteindre une vitesse maximale, et surveillez les signes d'épuisement.

Un animal est considéré comme épuisé lorsqu'il passe plus de la moitié du temps hors du tapis roulant ou cinq secondes consécutives sur la grille. Retirer la souris épuisée et noter le temps total de course. Entraînement d'endurance.

Les protocoles de course commencent par la même procédure d'échauffement. Toutefois, la vitesse maximale est généralement plus faible et les durées de course peuvent être assez longues. Remettez les souris dans leur cage d'origine après le test et nettoyez le tapis roulant avec de l'éthanol à 70 %.

Isolez la couche superficielle du muscle fléchisseur court des orteils du pied pour une analyse ultérieure. Commencez par inciser la peau de la plante du pied le long de la ligne médiane, en prenant soin de ne pas endommager le muscle sous-jacent. Ensuite, effectuez des incisions horizontales et retirez la peau.

Identifier le tendon plat et blanc du muscle FDB attaché à l'os du calcanéum. Utiliser une pince pour séparer puis sectionner le tendon près du site d'insertion. Tirer doucement sur le tendon tout en coupant les tissus conjonctifs environnants.

Localisez l'endroit où les tendons distaux se divisent en branches vers les doigts individuels. Coupez les tendons au niveau de leur insertion dans la couche musculaire profonde et retirez le muscle FDB. Placez le faisceau musculaire FDB dans un millilitre de solution de collagénase préalablement réchauffée à 37 degrés Celsius.

Fixer horizontalement le tube sur un agitateur orbital à 37 degrés Celsius et agiter à 200 tr/min pendant 65 minutes. Une digestion suffisante se manifeste par une apparence friable et une couleur pâle. Couper l'extrémité d'une pipette d'un millilitre pour permettre au faisceau digéré de passer à travers.

Transférez facilement le faisceau dans un tube d'ultracentrifugeuse contenant environ 600 microlitres de Tyro au calcium 2,5. Retournez doucement le tube pour faire tomber les fibres libres du faisceau.

Ensuite, coupez l'extrémité d'une pipette de 30 microlitres de manière à ce que le diamètre soit légèrement inférieur à celui du faisceau musculaire. Utilisez cette pipette pour aspirer le faisceau à l'intérieur et repoussez-le ensuite dans la solution. Répétez ce processus jusqu'à ce que la majorité des fibres soient dissociées du faisceau.

Mélangez les fibres dissociées en retournant doucement le tube. Prélevez la quantité souhaitée et déposez-la sur une boîte Delta T avec fond en verre. Conservez les fibres restantes à quatre degrés Celsius pendant environ six heures pour une utilisation ultérieure et des études supplémentaires.

Laisser le plat en place sans le déranger pendant cinq minutes. Cela permet aux fibres d'adhérer au fond en verre du plat. Placer le plat à fond en verre sur un microscope confocal équipé d'un laser UV.

Observer les fibres en microscopie de phase à un grossissement supérieur à 100 x afin de vérifier la présence d'un motif de striation normal et d'une forme allongée droite semblable à une tige. Ajouter le FM 1-43 ou le FM 4-64 styryl au périnée à une concentration finale de 2,5 micromolaire. Orienter la fibre selon un angle de 45 degrés, du haut à gauche du champ de vision vers le bas à droite, pour induire des lésions.

Irradiez une zone de cinq par cinq pixels de la membrane plasmique. À l’aide d’un laser UV réglé à puissance maximale pendant cinq secondes, la région irradiée doit traverser la membrane plasmique de manière à ce que la moitié de la zone de cinq par cinq se trouve à l’intérieur de la fibre, tandis que le reste se situe à l’extérieur. Capturez des images de l’entrée du colorant dans la fibre à intervalles de cinq secondes chacun, pendant un maximum de cinq minutes. Seules trois fibres peuvent être irradiées par boîte, car le colorant fluorescent sera finalement endocytosé par la fibre, ce qui compliquerait toute analyse des données.

Après utilisation de trois fibres, une nouvelle boîte doit être préparée. À l’aide d’un logiciel d’analyse, calculez la variation de l’intensité de fluorescence dans une zone d’environ 200 micromètres carrés afin de permettre la comparaison entre les fibres. Le calcul suivant doit être effectué pour chaque image : delta F divisé par F zéro, où F zéro correspond à la fluorescence moyenne de la région d’intérêt dans la première image capturée et delta F représente la variation de fluorescence dans chaque image suivante.

Utilisez des méthodes standard pour transfecter les cellules avec de l'ADN plasmidique exprimant la protéine GFP MG 53. Préparez ensuite les micropipettes. Placez une capillaire en Pyrex sur une micropipette.

Tirer selon le programme prédéfini. Fixer la micropipette à un manipulateur microscopique à trois axes. Le milieu est retiré de la boîte Delta T et remplacé par un tampon Tyro au calcium à 2,5 millimolaire.

Placer la boîte contenant les cellules transfectées sur un microscope confocal à balayage laser équipé d'un objectif à immersion huile 40 x 1,3 NA. Induire un dommage aigu des cellules vivantes en insérant la micropipette dans la membrane cellulaire, puis en retirant rapidement la micropipette de la cellule. Acquérir des images consécutives de cellules vivantes à intervalles de 1,54 seconde par image pour la perturbation membranaire induite par la troponine.

Perfuser de la troponine à 0,005 % PERFU à un débit d'environ un millilitre par minute directement au-dessus de la cellule en cours d'observation. Le tapis roulant peut être utilisé pour mesurer une réduction de la capacité à courir. Les souris knock-out pour MG 53 présentées ici ont une capacité de course réduite en raison de lésions du muscle squelettique.

L'ampleur des dommages causés par le laser UV dépend de la capacité de réparation membranaire de la fibre observée. Voici une fibre avant la lésion chez une souris normale. Cette image a été capturée 200 secondes plus tard et montre une légère lésion.

Une fibre musculaire provenant de souris dont le gène MG 53 a été inactivé et dont la capacité de réparation membranaire est altérée présentera une entrée de colorant plus importante après une lésion. Voici un exemple d'un myotube C2C12 non endommagé, transfecté avec GFP-MG 53. La flèche sur cette image indique des vésicules contenant GFP-MG 53 qui se déplacent vers les sites de lésion.

Dans cet exemple, la saponine a été utilisée pour endommager la membrane plasmique. Observez la translocation de la GFP MG 53 du cytosol vers la membrane cellulaire après la lésion. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'isoler de bonnes fibres musculaires présentant des membranes sarcolemmiques lisses et des motifs de striation bien visibles.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment évaluer la capacité de réparation membranaire du muscle et de la culture, les cellules.