Tridimensionnelle optique résolution microscopie photoacoustique

L’objectif global de cette procédure est de démontrer une microscopie photoacoustique à résolution optique in vivo ou, ou Pam de microcirculation qui est non invasive et sans marquage. Pour ce faire, l’animal de laboratoire est d’abord anesthésié. La deuxième étape de la procédure consiste à positionner la région d’intérêt en traduisant la tête d’imagerie de la résolution optique, en définissant les paramètres de balayage du microscope photoacoustique et en lançant l’acquisition de l’image.

En fin de compte, les distributions de la concentration totale d’oxygène et de la saturation en oxygène de l’hémoglobine sont obtenues par le calcul des données expérimentales multi-longueurs d’onde. La microscopie photoacoustique à résolution optique est basée sur l’excitation laser et la détection par ultrasons. Un faisceau laser court est focalisé dans le tissu biologique.

L’absorption de la lumière génère un échauffement transitoire et une émission ultrasonique ultérieure, qui est reçue pour former une image. L’avantage unique de Pam, c’est sa détection sans sol et sa sensibilité exquise à l’absorption optique. En revanche, les technologies de microscopie optique existantes sont principalement sensibles à la diffusion optique ou à la fluorescence. Capable de fournir une imagerie haute résolution in vavo sans marquage de l’absorption optique ou RPM, il a trouvé de vastes applications biomédicales en neurologie, en ophtalmologie, en biologie vasculaire et en dermatologie.

La microscopie photoacoustique à résolution optique ou pamm se compose à la fois de composants optiques et ultrasonores. La source d’irradiation optique est un laser à colorant pompé par un laser à impulsions à semi-conducteurs. Le faisceau laser de sortie est atténué par un filtre à densité neutre et couplé à une fibre optique monomode pour la diffusion de la lumière afin de permettre le balayage mécanique de la tête d’imagerie du microscope plutôt que de l’objet vivant pour coupler efficacement le faisceau laser multimode en une fibre optique monomode.

Il est d’abord filtré par un sténopé de 50 micromètres de diamètre. Le sténopé est positionné légèrement à l’écart de la focale de la lentille du condenseur pour correspondre à son diamètre avec le diamètre du faisceau du mode fondamental. Pour créer une mise au point optique limitée en diffraction quasi limitée, la sortie de la fibre monomode est assemblée et remplit l’ouverture arrière d’un microscope. Objectif.

La détection par ultrasons implique un combinateur de faisceau optique acoustique fait maison connecté à un transducteur à ultrasons. Le combinateur aligne l’irradiation optique et la détection acoustique de manière coaxiale. Une cavité sphérique est broyée dans le fond du combinateur pour produire une lentille acoustique avec une ouverture numérique de 0,5 dans l’eau, qui fournit un diamètre focal acoustique de 43 micromètres à la fréquence centrale de 50 mégahertz.

Pour le premier alignement, il est utile d’utiliser des ultrasons d’écho pulsé pour déterminer la position du plan focal acoustique. La tête d’imagerie est réglée verticalement jusqu’à ce que le signal ultrasonore maximal de l’écho d’impulsion soit observé. Pour maximiser la sensibilité de détection, les foyers optiques et acoustiques sont alignés. Confocal.

Une cible optiquement absorbante, telle qu’un morceau de ruban électrique noir, est placée dans le plan focal acoustique. Ensuite, la position focale optique est ajustée pour maximiser le signal photoacoustique. Le système ou PAM comprend également des amplificateurs électroniques et un convertisseur numérique analogique, un scanner mécanique et un contrôleur de scanner.

Le signal numérisé est transféré à un ordinateur pour la formation de l’image. Le logiciel convertit les données brutes en une séquence d’images bcan en coupe transversale. Au fur et à mesure que la trame de la tête du microscope scanne l’objet, les images enregistrées peuvent ensuite être affichées sous forme d’images en coupe transversale individuelles, d’images de projection d’amplitude maximale 2D ou de rendus 3D.

Un réservoir d’eau est utilisé pour loger la tête d’imagerie du microscope. Une fenêtre d’imagerie est découpée dans une boîte de Pétri et scellée avec une membrane en polyéthylène transparente aux ultrasons et optiquement. L’onde photoacoustique générée par l’objet est couplée acoustiquement au détecteur à ultrasons, d’abord par un gel à ultrasons entre l’objet et la membrane en polyéthylène, puis par de l’eau désionisée dans la boîte de Pétri.

Ces inventions et applications de l’optique, des lasers et du transducteur à ultrasons disponibles constituent le système ou pam. Dans le segment suivant, nous allons imager la microvascularisation d’une souris vivante avec ce système. Si l’animal imagé n’est pas une souris nue, 24 heures avant l’expérience, il est idéal de le faire.

Ainsi, l’irritation du système vasculaire cutané est récupérée. Anesthésie la souris avec 3 % de fluor ISO vaporisé dans de l’oxygène de qualité médicale. Le débit typique est compris entre un et 1,5 litre par minute.

En fonction du poids corporel de l’animal. Maintenez l’anesthésie avec 1 % de fluor ISO Tout au long de l’expérience, effectuez un pincement des orteils pour vous assurer que la souris est complètement anesthésiée. Transférez la souris sur un stade stéréotaxique avec un coussin chauffant pour maintenir sa température corporelle à 37 degrés Celsius.

Aplatissez maintenant l’oreille sur la plaque en plastique. Appliquez ensuite une couche de gel à ultrasons sur le dessus de l’oreille. Évitez de piéger des bulles d’air à l’intérieur du gel.

Appliquez également une pommade ophtalmique sur les yeux pour éviter le dessèchement ou les dommages accidentels causés par le laser. Évitez de toucher l’œil directement avec l’applicateur. Placez ensuite l’oreille sous la fenêtre d’imagerie et élevez lentement le stade animal jusqu’à ce que le gel à ultrasons entre en contact avec le bas de la membrane.

Un contact doux est nécessaire car une pression de l’oreille contre la membrane peut affecter la circulation sanguine dans l’oreille. Ensuite, prenez quelques précautions avec l’animal pour surveiller son état physiologique. Fixez un oxymètre de pouls à la souris, à la patte ou à la queue.

Abaissez maintenant la tête d’imagerie jusqu’à ce que la lentille acoustique soit immergée dans de l’eau désionisée et éliminez les bulles piégées sous la lentille acoustique. Réglez le laser sur le mode de déclenchement externe et lancez la numérisation d’essai. Ajustez la position Z de la tête d’imagerie jusqu’à ce que les foyers doubles optiques et acoustiques soient placés au milieu de l’oreille.

Définissez maintenant les paramètres de balayage et lancez l’acquisition formelle de l’image. Pour mesurer la concentration totale d’hémoglobine. Réglez la longueur d’onde sur un point spastique ISO où l’oxyhémoglobine et la désoxyhémoglobine ont des coefficients d’extinction molaires égaux.

Pour mesurer la saturation en oxygène de l’hémoglobine, réglez la deuxième longueur d’onde à l’endroit où les coefficients d’extinction molaire de l’oxyhémoglobine et de la désoxyhémoglobine ont une différence prononcée. Lorsque vous avez terminé, nettoyez l’oreille de la souris et placez-la dans un incubateur. Avec la température ambiante réglée à 37 degrés Celsius, lorsqu’elle se réveille, ramène naturellement la souris à l’animalerie.

Cette image de projection d’amplitude maximale montre l’anatomie vasculaire d’une oreille de souris nue vivante imagée à l’aide de Pam à 570 nanomètres. Cette image de projection montre la saturation en oxygène de l’hémoglobine dans la même oreille. Il est calculé à partir des images acquises à une longueur d’onde spastique ISO de 570 nanomètres et une longueur d’onde dominante d’absorption de désoxyhémoglobine de 561 nanomètres.

Un examen plus approfondi de la région encadrée montre la résolution d’oramm. Un lit capillaire densément tassé est clairement résolu. Dans cette vidéo, nous avons démontré le protocole expérimental typique de l’ORPM, y compris la configuration du système, la procédure expérimentale in vivo d’alignement du système et le schéma d’imagerie fonctionnelle.

L’un des aspects les plus importants de la conception et du fonctionnement de l’instrument est l’alignement confocal acoustique optique, qui est crucial pour la sensibilité de l’imagerie, la microscopie photoacoustique à résolution optique combinée à la microscopie photoacoustique à résolution acoustique pénétrante profonde et à la tomographie assistée par ordinateur photoacoustique promet in vivo, l’imagerie fonctionnelle et moléculaire et plusieurs échelles finales, ongles d’organes, cellules, tissus, et jusqu’aux organes peuvent être imagés avec le même contraste. L’origine, comme l’évolutivité de l’imagerie, a le potentiel de révolutionner la recherche sur les systèmes multi-échelles, la biologie et la traduction. Des découvertes microscopiques en laboratoire à la pratique clinique macroscopique.