Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

L’objectif global de cette procédure est de préparer un microscope standard à deux photons pour l’imagerie intra-vitale à haute résolution. Pour ce faire, il faut d’abord aligner le microscope, ce qui comprend le réglage des lasers. Ensuite, le multiplexeur de faisceau est aligné pour obtenir une forme de faisceau et une disposition parfaites de la lumière du faisceau.

Dans le cas d’un balayage multifaisceaux, les images brutes sont acquises en balayant l’échantillon avec le motif d’éclairage rayé. Enfin, un algorithme est appliqué pour calculer l’image finale à haute résolution. En fin de compte, la microscopie à éclairage rayé est utilisée pour montrer des détails sur le comportement du système immunitaire dans les centres germinaux des ganglions lymphatiques de souris, auparavant inaccessibles à la microscopie intra-vitale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’éclairage structuré ou la microscopie de localisation, est qu’elle peut être appliquée à de grandes profondeurs tissulaires dans des échantillons vivants. Il ne nécessite aucune modification de la forme du faisceau laser, ce qui permet de garder la méthode très simple et facile à mettre en œuvre pour n’importe quel microscope multiphotonique. La configuration utilisée pour la microscopie à éclairage multifaisceaux à deux photons est illustrée ici pour obtenir une résolution et une qualité de contraste optimales avec le niveau de blanchiment le plus bas et l’acquisition la plus rapide.

Envisagez d’apporter des ajustements à la configuration comme indiqué dans le protocole texte. Après avoir effectué les réglages, vérifiez que le faisceau revient au miroir qui se trouve directement au-dessus du miroir d’entrée à l’extrémité du compresseur d’impulsions à prisme. Une fois que le chemin de la lumière est défini à partir d’ici, le faisceau est réfléchi dans le multiplexeur de faisceau.

Si vous effectuez un éclairage à bandes multifaisceaux, effectuez une microscopie multiphotonique avec le scanner éteint. Alignez les miroirs dans le multiplexeur de faisceau en plaçant un échantillon fluorescent homogène sur la platine et focalisez le faisceau laser à l’intérieur de l’échantillon, mais près de la surface supérieure. Proche de la lentille frontale des objectifs.

Réglez le microscope sur le mode multifaisceaux et choisissez le nombre de faisceaux et la polarisation. Par exemple, P pour trouver le faisceau laser en imageant la lame fluorescente, réglez l’obturateur P ouvert et faites fonctionner la caméra CCD en continu tout en focalisant le faisceau, en vous assurant qu’il est en position centrale. Lors de l’alignement du faisceau P, passez en mode 64 faisceaux et ouvrez l’obturateur correspondant.

Vérifiez la position de la poutre. Réglage des miroirs multiplexeurs du premier au cinquième faisceau, en veillant à ce que les lumières du faisceau soient à égale distance. Étant donné que les algorithmes d’éclairage rayé sont basés sur cette hypothèse, remplacez l’échantillon uniformément fluorescent par un échantillon à structure hétérogène.

Par exemple, prélevez un échantillon de racine de zone Conval et balayez une image multifaisceaux. Vérifiez que l’image est nette, uniforme et droite. Remplacez l’échantillon hétérogène par l’échantillon homogène.

Démarrez le scanner XY pour contrôler le processus de numérisation. Générer le motif d’excitation de l’image rayée pour le balayage multifaisceaux. Déplacez le miroir du scanner Y perpendiculairement à la ligne éclairée par le faisceau.

Répétez le motif généré ici, indiqué par le nombre de blocs, en déplaçant le miroir du scanner X, ici appelé décalage de bloc, pour générer une image rayée rectangulaire. Replacez l’échantillon hétérogène et utilisez le scanner comme déclencheur principal. Synchronisez l’appareil photo avec le scanner pour acquérir et enregistrer automatiquement une image agrégée afin d’acquérir des images agrégées à plusieurs reprises.

Déplacez le miroir du scanner X dans différentes positions en choisissant ici suffisamment de pas de répétition, le nombre de décalages et la longueur de pas appropriée. Décalez le pas entre deux images entrelacées successives pour couvrir la distance entre deux largeurs de faisceau consécutives. Réglez le décalage X sur une valeur inférieure à la limite de résolution latérale à la longueur d’onde d’excitation donnée.

Par exemple, l’utilisation de 10 pas du miroir du scanner X par équipe et de 12 ou 13 équipes permet d’obtenir la meilleure résolution spatiale. Résultats avec la lame de racine de l’aire de conval pour optimiser ces deux valeurs jusqu’à ce que l’image de l’aire de conval devienne la plus nette. Utilisez l’outil de profil linéaire sur les images CCD conventionnelles et les images d’éclairage rayé calculées.

Comparez la largeur des profils de lignes, qui dans cet exemple est le signal fluorescent des parois cellulaires convales. Acquérez chaque image rayée brute synchronisée avec le mouvement du scanner et enregistrez-la séparément, par exemple, dans des fichiers TIFF ou binaires. Pour générer une matrice bidimensionnelle de l’image d’éclairage rayé haute résolution, ouvrez un ensemble complet d’images rayées brutes sous forme de matrices dans la routine d’évaluation.

Utilisez soit l’algorithme minimum maximum, soit un algorithme basé sur la transformée de Fourier, comme décrit précédemment en détail, pour effectuer une microscopie à éclairage rayé, multifaisceaux et multiphotons dans les tissus profonds. Dans les organismes vivants, acquérez des images rayées à différentes profondeurs de tissus au fil du temps et évaluez-les comme décrit précédemment, pour générer un film 3D haute résolution de l’interaction dynamique entre le centre germinal, les cellules B et les cellules dendritiques folliculaires. Les dimensions de la fonction d’étalement effectif du point correspondent à la résolution spatiale d’un microscope.

Nous avons mesuré cette fonction tridimensionnelle en acquérant soit le signal de génération de secondes harmoniques des fibres de collagène, soit le signal fluorescent de billes de polystyrène de 100 nanomètres émettant à 515 nanomètres dans les ganglions lymphatiques mioniques. En utilisant notre éclairage à bandes multifaisceaux T-P-L-S-M par rapport aux techniques de microscopie à balayage laser à deux photons établies, telles que la détection de terrain T-P-L-S-M au moyen de caméras CCD et la détection ponctuelle T-P-L-S-M. À partir de ces mesures, il devient évident qu’à la surface de l’échantillon, les résolutions latérales et axiales correspondent aux valeurs attendues prédites par la théorie de la diffraction.

Cependant, avec l’augmentation de la profondeur d’imagerie, et donc avec l’augmentation du chemin optique des rayonnements d’excitation et d’émission à travers des milieux aux indices de réfraction très variables, la résolution spatiale se détériore considérablement indépendamment de la configuration utilisée. En utilisant M-B-S-I-T-P-L-S-M indépendamment de la profondeur d’imagerie, nous avons atteint une résolution latérale supérieure d’environ 20 % et une résolution axiale supérieure de 220 %. Par rapport aux approches standard T-P-L-S-M.

La sélection clonale des lymphocytes B au cours de la réponse immunitaire au sein des organes lymphoïdes secondaires de souris adultes est la première étape de leur différenciation en lymphocytes B à mémoire ou plasmocytes. Dans ce processus, on pense que l’interaction hautement dynamique entre les cellules dendritiques folliculaires et les cellules B au niveau des structures du complexe immunitaire au sein des centres germinaux joue un rôle central. Ce n’est qu’en utilisant une technologie de microscopie intra-vitale à haute résolution qu’il est possible de disséquer cette communication cellulaire et ses implications pour la réponse immunitaire observée ici telle qu’elle est marquée par l’anti CD 2135 FAB ATO cinq 90 sur les cellules dendritiques folliculaires.

M-B-S-I-T-P-L-S-M offre pour la première fois la possibilité de visualiser et de quantifier de manière intervitale les dimensions des amas de dépôts de complexes immunitaires jusqu’à une profondeur de 120 microns dans les centres germinaux des ganglions lymphatiques popals. Ces images montrent la comparaison directe entre les images de fluorescence 3D des dépôts de complexes immunitaires dans un centre germinal tels qu’acquis par les PMT conventionnelles basées sur le PMT et M-B-S-I-T-P-L-S-M. De plus, les interactions des dépôts du complexe immunitaire avec les lymphocytes B du centre germinatif ont pu être hautement résolues et peuvent maintenant être étudiées en combinaison avec des sondes fonctionnelles intra-vitales pour la prolifération, la différenciation ou l’apoptose.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de garder à l’esprit qu’avec une technique basée sur la détection de caméra, la vitesse d’acquisition est environ huit fois plus élevée, tandis que la profondeur d’imagerie maximale est environ 25 % inférieure à celles obtenues avec un microscope multiphotonique standard basé sur un photomultiplicateur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer votre microscope à plis multiples pour qu’il fonctionne avec la méthode d’éclairage rayé, y compris le réglage de la trajectoire de la lumière du microscope, l’alignement des latitudes du faisceau, le calcul des paramètres de balayage et les méthodes de calcul de l’image finale haute résolution. Pour les expériences intravitales des tissus profonds.