Très Résolu microscopie intravitale Striped-éclairage de centres germinaux

L'objectif général de cette procédure est de préparer un microscope à deux photons standard pour l'imagerie intravitale à haute résolution. Cela est réalisé en premier lieu par l'alignement du microscope, qui comprend le réglage des lasers. Ensuite, le multiplexeur de faisceau est aligné afin d'obtenir une forme de faisceau et une disposition du faisceau éclairé parfaites.

Dans le cas d'un balayage multiface, les images brutes sont acquises en scannant l'échantillon avec un motif d'illumination rayé. Enfin, un algorithme est appliqué pour calculer l'image finale à haute résolution. En définitive, la microscopie à illumination rayée est utilisée pour révéler des détails du comportement du système immunitaire au sein des centres germinatifs des ganglions lymphatiques de souris, auparavant inaccessibles à la microscopie intravitale.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l'illumination structurée ou la microscopie de localisation réside dans sa capacité à être appliquée à de grandes profondeurs tissulaires dans des échantillons vivants. Elle ne nécessite aucune modification de la forme du faisceau laser, ce qui rend la méthode très simple et facile à intégrer à tout microscope à deux photons. Le dispositif utilisé pour la microscopie à illumination rayée à deux photons multipuits est présenté ici afin d'obtenir une résolution et une qualité de contraste optimales avec un niveau minimal de photoblanchiment et un temps d'acquisition rapide.

Envisagez d'effectuer des réglages sur le dispositif conformément aux instructions du protocole écrit. Après avoir effectué ces réglages, vérifiez que le faisceau revient vers le miroir situé directement au-dessus du miroir d'entrée, à l'extrémité du compresseur d'impulsions à base de prisme. Une fois le trajet de la lumière établi à partir de ce point, le faisceau est réfléchi vers le multiplexeur de faisceau.

Si vous effectuez une illumination rayée à faisceaux multiples, utilisez la microscopie à plusieurs photons avec le scanner désactivé. Alignez les miroirs du multiplexeur de faisceau en plaçant un échantillon uniformément fluorescent sur la platine et en focalisant le faisceau laser à l'intérieur de l'échantillon, mais près de la surface supérieure, proche de la lentille frontale de l'objectif.

Réglez le microscope en mode multi-faisceaux et choisissez le nombre de faisceaux et la polarisation. Par exemple, utilisez P pour localiser le faisceau laser en imagerie à partir de la lame fluorescente, ouvrez l'obturateur P et faites fonctionner la caméra CCD en continu tout en focalisant le faisceau, en vous assurant qu'il est bien positionné au centre. Lors de l'alignement du faisceau P, passez en mode 64 faisceaux et ouvrez l'obturateur correspondant.

Vérifiez la position du faisceau. Ajustez les miroirs du premier au cinquième multiplexeur de faisceau, en veillant à ce que les taches lumineuses soient équidistantes. Étant donné que les algorithmes d'éclairage rayé reposent sur cette hypothèse, remplacez l'échantillon uniformément fluorescent par un échantillon à structure hétérogène.

Par exemple, placez un échantillon de racine de la zone Conval et numérisez une image multi-faisceaux. Vérifiez que l'image apparaît nette, uniforme et droite. Remplacez l'échantillon hétérogène par un échantillon homogène.

Démarrez le scanner XY pour contrôler le processus de balayage. Pour générer le motif d'excitation en image rayée pour le balayage multi-faisceau. Déplacez le miroir du scanner Y perpendiculairement à la ligne éclairée par le faisceau.

Répétez le motif généré ici indiqué par le nombre de blocs en déplaçant le miroir du scanner X, appelé ici décalage de bloc, afin de produire une image rayée rectangulaire. Replacez l'échantillon hétérogène et utilisez le scanner comme déclencheur maître. Synchronisez la caméra avec le scanner pour acquérir et enregistrer automatiquement une image rayée, et ainsi obtenir de façon répétée des images rayées.

Déplacez le miroir du scanner X vers différentes positions en choisissant ici un nombre suffisant d'étapes de répétition, le nombre de décalages et la longueur de pas appropriée. Réglez le pas de décalage entre deux images rayées successives afin de couvrir la distance entre deux largeurs de faisceau consécutives. Réglez le décalage en X à une valeur inférieure à la limite de résolution latérale à la longueur d'onde d'excitation donnée.

Par exemple, l'utilisation de 10 étapes du miroir du scanneur X par décalage et de 12 ou 13 décalages permet d'obtenir la meilleure résolution spatiale. Ajustez ces deux valeurs en utilisant la zone racine conval jusqu'à ce que l'image de la zone conval devienne la plus nette possible. Utilisez l'outil de profil de ligne sur les images CCD conventionnelles et sur les images calculées d'éclairage rayé.

Comparez la largeur des profils de ligne, qui dans cet exemple correspond au signal fluorescent des parois cellulaires. Acquérez chaque image brute rayée synchronisée avec le mouvement du scanner et enregistrez-la séparément, par exemple dans des fichiers TIFF ou binaires. Pour générer une matrice bidimensionnelle de l'image d'illumination rayée à haute résolution, ouvrez un ensemble complet d'images rayées brutes sous forme de matrices dans la routine d'évaluation.

Utilisez soit l'algorithme du maximum minimal, soit un algorithme basé sur la transformation de Fourier, comme décrit précédemment en détail, afin d'effectuer une illumination en bandes, une microscopie multifaisceaux et multiphoton dans les tissus profonds. Chez des organismes vivants, acquérez des images en bandes à différentes profondeurs tissulaires au cours du temps et évaluez-les comme décrit précédemment, afin de générer un film 3D haute résolution des interactions dynamiques entre le centre germinatif, les lymphocytes B et les cellules dendritiques folliculaires. Les dimensions de la fonction d'étalement du point effectif correspondent à la résolution spatiale du microscope.

Nous avons mesuré cette fonction tridimensionnelle en enregistrant soit le signal de génération du deuxième harmonique des fibres de collagène, soit le signal fluorescent de billes de polystyrène de 100 nanomètres émettant à 515 nanomètres dans des ganglions lymphatiques mion. À l’aide de notre microscope à illumination rayée multiphais T-P-L-S-M, nous avons comparé ces mesures à des techniques établies de microscopie à balayage laser à deux photons, telles que la détection de champ T-P-L-S-M au moyen de caméras CCD et la détection ponctuelle T-P-L-S-M. À partir de ces mesures, il devient évident qu’à la surface de l’échantillon, les résolutions latérale et axiale correspondent aux valeurs attendues prédites par la théorie de la diffraction.

Cependant, avec une profondeur d'imagerie croissante, et donc avec un trajet optique croissant aussi bien pour le rayonnement d'excitation que pour celui d'émission à travers un milieu présentant des indices de réfraction fortement variables, la résolution spatiale se dégrade considérablement, indépendamment du dispositif utilisé. En utilisant la M-B-S-I-T-P-L-S-M indépendamment de la profondeur d'imagerie, nous avons obtenu environ 20 % de meilleure résolution latérale et 220 % de meilleure résolution axiale par rapport aux approches classiques de T-P-L-S-M.

La sélection clonale des lymphocytes B au cours de la réponse immunitaire dans les organes lymphoïdes secondaires de souris adultes constitue la première étape de leur différenciation en lymphocytes B mémoires ou en plasmocytes. Dans ce processus, on pense que l'interaction hautement dynamique entre les cellules dendritiques folliculaires et les lymphocytes B, au niveau des structures de complexes immuns dans les centres germinatifs, joue un rôle central. Ce n'est qu'en utilisant une technologie de microscopie intra-vitale à très haute résolution qu'il est possible d'analyser cette communication cellulaire et ses implications pour la réponse immunitaire, visualisée ici grâce à l'anticorps anti-CD21/35 FAB ATO 590 marquant les cellules dendritiques folliculaires.

M-B-S-I-T-P-L-S-M offre pour la première fois la possibilité de visualiser et de quantifier in vivo les dimensions des agrégats de dépôts de complexes immuns jusqu'à une profondeur de 120 microns dans les centres germinatifs des ganglions lymphatiques poplités. Ces images montrent la comparaison directe entre les images de fluorescence 3D des dépôts de complexes immuns dans un centre germinatif, obtenues par détection conventionnelle à base de PMT et par M-B-S-I-T-P-L-S-M. En outre, les interactions entre les dépôts de complexes immuns et les lymphocytes B des centres germinatifs peuvent désormais être résolues avec une très haute précision et étudiées en combinaison avec des sondes fonctionnelles intravitales pour la prolifération, la différenciation ou l'apoptose.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder à l'esprit qu'avec une technique basée sur la détection par caméra, la vitesse d'acquisition est environ huit fois plus élevée, tandis que la profondeur maximale d'imagerie est d'environ 25 % inférieure à celle obtenue avec un microscope multiphoton classique équipé d'un photomultiplicateur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment configurer votre microscope multifonctionnel pour travailler avec la méthode d'éclairage en bandes, y compris le réglage du trajet lumineux du microscope, l'alignement des réseaux de faisceaux, le calcul des paramètres de balayage, ainsi que les méthodes permettant de reconstruire l'image finale à haute résolution. Pour des expériences sur tissus profonds in vivo.