Name: Amplifier et quantifier lARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Découvrez comment amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 dans les échantillons à faible charge virale par PCR en temps réel et séquençage de génomes uniques. Cette méthode détecte jusqu'à 0,3 copies/ml pour étudier la dynamique virale.

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Les auteurs tiennent à remercier les patients qui ont participé dans les nombreuses études sur le VIH-1. JMC a été professeur de recherche de l&#39;American Cancer Society avec le soutien de la Fondation FM Kirby.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

VIH-1 des individus infectés sur le traitement antirétroviral (TARV) ou qui, naturellement, le contrôle de l&#39;infection ont une très faible charge virale, généralement autour de 1 exemplaire par ml de plasma 4, 11, 12, 17, 18. Charge virale chez les patients avec un contrôle naturel, fluctuent souvent autour d&#39;un jeu individuel, point 1, 2, 17. La sensibilité des tests décrite ici est très dépendante sur le volume d&#39;entrée du plasma. Généralement, nous avons travaillé avec 7 ml de plasma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Hexamères aléatoires (500 ug / ml) </td><td> Promega </td><td> C118A </td><td></td></tr><tr><td> Taqman tampon A </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4304441 </td><td></td></tr><tr><td> RNAsine (40 U / UL) </td><td> Promega </td><td> N211B </td><td></td></tr><tr><td> RT enzyme (200 U / UL) </td><td> Strategene </td><td> 600107-51 </td><td></td></tr><tr><td> Polymérase ADN Amplitaq Or </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> 6-pack </td></tr><tr><td> Amplitaq 10XGold tampon PCR II </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> Magnesiumcloride 25 mM </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> 1M tampon Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM </td><td> Invitrogen </td><td> AM9855G </td><td></td></tr><tr><td> Exposant III de la transcriptase inverse enzyme, 200 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-044 </td><td></td></tr><tr><td> Exposant III de tampon 10X </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> TNT 100 mM </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> Platinum Taq ADN polymérase haute fidélité 5 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td></td></tr><tr><td> 10X High Fidelity PCR Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> Protéinase K à 20 mg / ml </td><td> Ambion </td><td> 2546 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de thiocyanate de guanidinium 6M </td><td> FlukaBiochemica </td><td> 50983 </td><td></td></tr><tr><td> Le glycogène 20 mg / ml </td><td> Roche </td><td> 10901393001 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19516 </td><td></td></tr><tr><td> 70% d&#39;éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E702-3 </td><td></td></tr><tr><td> Moléculaire de l&#39;eau de qualité </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP (25 mmol chaque) </td><td> Bioline </td><td> BIO-39025 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nom de Euipment </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Facile Tubes à centrifuger Seal (16x73mm) </td><td> Seaton scientifique </td><td> 6041 </td><td></td></tr><tr><td> Blanc Delrin couronnes </td><td> Seaton scientifique </td><td> 4020 </td><td> Caps pour les tubes Sceau Facile </td></tr><tr><td> Portoir pour Optiseal Bell-Haut tubes, 8,9 ml </td><td> Beckman </td><td> 361642 </td><td></td></tr><tr><td> Pilote Hex ½ ouverture inc </td><td> Seaton scientifique </td><td> 4013 </td><td></td></tr><tr><td> tupe retrait bouchon </td><td> Seaton scientifique </td><td> 4014 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Pipettes sérologiques </td><td> Costar </td><td> 4051 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetboy </td><td> toute </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 pipettes de transfert ml </td><td> ISC Bioexpress </td><td> P-5005-7 </td><td></td></tr><tr><td> 5,8 ml Pipettes de transfert de Dispossable, pointe fine </td><td> VWR </td><td> 14670-329 </td><td></td></tr><tr><td> 15 tubes à centrifuger ml </td><td> Falcon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml tubes à centrifuger </td><td> toute </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon Tris comprimés Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5030-100TAB </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuger et le rotor </td><td> Sorval </td><td> 90SE et T-1270 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 96 puits PCR </td><td> Biorad </td><td> HSS-9601 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml de réactif du réservoir </td><td> Costar </td><td> 4870 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp optiques plaque de 96 puits de réaction </td><td> Applied Biosystems </td><td> N801-0560 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque optique couvre </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4333183 </td><td></td></tr><tr><td> Pad MicroAmp compression optique </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4312639 </td><td></td></tr><tr><td> MicrosealUn film </td><td> Biorad </td><td> MSA-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 tubes à centrifuger ml </td><td> Toute </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1% des gels d&#39;agarose (E-gel, Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> G-7008-01 </td><td></td></tr><tr><td> E-base (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> EB-M03 </td><td></td></tr></tbody></table> EDTA tubes de prélèvement n&#39;importe quelle marque

amplifier et quantifier l&#39;arn vih-1 chez les individus infectés par le vih ayant une charge virale sous le seuil de détection par standard tests cliniques

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifier les gènes viraux et de quantifier l&#39;ARN VIH-1 du VIH-1 des individus infectés par une charge virale inférieure à la limite de détection par les tests standards (ci-dessous de 50 à 75 copies / ml) est nécessaire pour mieux comprendre la dynamique virale et les interactions hôte-virus chez les patients qui contrôler naturellement l&#39;infection et ceux qui sont sur le traitement antirétroviral (TARV). Nous décrivons ici comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome seule (le protocole SGS) 13, 19 et comment quantifier avec précision ARN VIH-1 chez les patients avec une faible charge virale (la seule copie-dosage (SCA) du protocole) 12, 20. Le dosage de copie unique est un test PCR en temps réel avec une sensibilité en fonction du volume de plasma étant dosé. Si une seule génome du virus est détecté dans 7 ml de plasma, puis le nombre de copies d&#39;ARN est rapporté à 0,3 copies / ml. Le test a une tests de contrôle interne pour l&#39;efficacité de l&#39;extraction d&#39;ARN, et des contrôles pour l&#39;amplification de l&#39;ADN possibles ou de contamination. Les échantillons de patients sont mesurés en trois exemplaires. Le seul test de séquençage du génome (SGS), aujourd&#39;hui largement utilisées et considérées comme non-travail 3 intensive, 7, 12, 14, 15, est un test de dilution limite, dans laquelle critère diluée produit d&#39;ADNc est étalée sur une de 96 puits assiette. Selon une distribution de Poisson, alors que moins de 1 / 3 des puits donner un produit, il ya 80% de chances de la résultante produit PCR d&#39;amplification étant d&#39;une seule molécule d&#39;ADNc. SGS a l&#39;avantage sur le clonage de ne pas être soumis à ré-échantillonnage et de ne pas être biaisé par PCR introduit recombinaison 19. Cependant, le succès d&#39;amplification de la SCA et SGS dépendra de conception d&#39;amorce. Les deux tests ont été développés pour le VIH-1 sous-type B, mais peut être adapté pour d&#39;autres sous-régions et d&#39;autres du génome par des amorces changer, sondes, et des normes.

La quantification des niveaux d&#39;ARN VIH-1 dans le plasma et le séquençage seule VIH-1 génomes d&#39;individus ayant une charge virale en dessous de la limite de détection (50-75 copies / ml) est difficile. Nous décrivons ici comment extraire et de quantifier les ARN viral plasmatique à l&#39;aide en temps réel PCR que les mesures de manière fiable ARN VIH-1 à 0,3 copies / ml et comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome unique, à partir d&#39;échantillons à très faible charge virale.

Amplifier et quantifier l&#39;ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

Amplification de gènes viraux et quantification de l'ARN du VIH-1 chez des individus infectés par le VIH-1 présentant des charges virales inférieures à la limite de détection des tests standards (inférieures à ...

Dans cette vidéo, des méthodes sont présentées pour quantifier et séquencer des génomes individuels du VIH provenant de personnes ayant une charge virale inférieure à 50 copies par millilitre de plasma. Premièrement, un tube contenant sept millilitres de plasma est centrifugé pour former un culot. L'ARN viral est ensuite extrait afin de quantifier le niveau de VIH-1.Un dosage par copie unique est réalisé, au cours duquel l'ARN est rétrotranscrit, chargé sur une plaque de 96 puits contenant des étalons et des contrôles, puis soumis à une PCR quantitative en temps réel. Le taux de virémie est ensuite calculé en fonction du volume d'entrée de plasma. Jusqu'à 0,3 copie par millilitre peut être détectée afin de caractériser la population virale.Un seul test de séquençage génomique est réalisé, au cours duquel l'ADNc transcrit à partir d'ARN viral est réparti dans une plaque de 96 puits afin d'atteindre une dilution limite. Ensuite, une PCR imbriquée est effectuée pour amplifier les génomes viraux. Si 30 % ou moins des réactions de PCR sont positives pour un échantillon donné, cela indique l'amplification d'une seule copie d'ADNc.Ces échantillons sont ensuite séquencés afin de révéler la

amplifying-quantifying-hiv-1-rna-hiv-infected-individuals-with-viral

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Source : Claiborne, D. T. et al. Une méthode de clonage basée sur les enzymes de restriction pour évaluer la capacité de réplication in vitro des virus chimériques de sous-type C du VIH-1 Gag-MJ4. J. Vis. Exp. (2014)Ce vidéo montre l'évaluation de la capacité de réplication virale à l'aide d'un dosage de la transcriptase inverse radiomarquée. Des surnageants de culture contenant des virions progéniteurs sont ajoutés à un mélange de transcription inverse contenant un nucléotide radiomarqué. Le...

Évaluation de la capacité de réplication virale à l'aide d'un essai de transcriptase inverse radiomarquée

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

Des méthodes d’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des molécules d’ARN ciblant les étapes post-intégration du cycle de réplication du VIH-1 sont décrites. Ces méthodes sont utiles pour cribler de nouvelles molécules et optimiser le format des molécules existantes.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV+ T cellules isolées de macaques rhésus.

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Pleine longueur séquençage proviral individuel (FLIPS) fournit une méthode efficace et haut débit pour l’amplification et le séquençage d’unique, près de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux) et permettant la détermination de leur potentiel réplication-compétences. FLIPS surmonte les limites des tests précédents conçus pour séquencer le réservoir latent de VIH-1.

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

Analyse de réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel combinée avec la transcription inverse (RT-qPCR) a été largement utilisée pour mesurer le niveau des infections à virus à ARN. Nous présentons ici un dosage direct de la RT-qPCR, ne nécessitant pas une étape de purification du RNA, mis au point pour la quantification de plusieurs virus à ARN, y compris le virus de la dengue.

ARN du Virus Dengue dans le surnageant de Culture de cellules infectées par PCR Quantitative en temps réel de la mesure

Nous présentons une approche de séquençage en profondeur qui fournit une détermination impartiale du naissant 3'-termini ainsi que des profils de mutations des molécules d’ADN simple brin. L’application principale est la caractérisation de naissants DNAs rétrovirales complémentaires (ADNc), les intermédiaires générés lors du processus de transcription inverse rétrovirale.

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe

Découvrez comment amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 dans les échantillons à faible charge virale par PCR en temps réel et séquençage de génomes uniques. Cette méthode détecte jusqu'à 0,3 copies/ml pour étudier la dynamique virale.

Amplifier et quantifier lARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques (Vidéo) | JoVE Journal

Amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

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