Name: Amplifier et quantifier lARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Découvrez comment amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 dans les échantillons à faible charge virale par PCR en temps réel et séquençage de génomes uniques. Cette méthode détecte jusqu'à 0,3 copies/ml pour étudier la dynamique virale.

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Les auteurs tiennent à remercier les patients qui ont participé dans les nombreuses études sur le VIH-1. JMC a été professeur de recherche de l&#39;American Cancer Society avec le soutien de la Fondation FM Kirby.

<ol><li>Amara, R. R., Villinger, F., Altman, J. D., Lydy, S. L., O'Neil, S. P., Staprans, S. I., Montefiori, D. C., Xu, Y., Herndon, J. G., Wyatt, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+mucosal+challenge+and+prevention+of+AIDS+by+a+multiprotein+DNA%2FMVA+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Control of a mucosal challenge and prevention of AIDS by a multiprotein DNA/MVA vaccine.</a> Vaccine. 20, 1949-1955 (2002).</li>
<li>Dinoso, J., Kim, S., Blankson, J., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Dynamics+of+Elite+Suppressors+in+HIV-1+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Conference+on+Retroviruses+and+Opportunistic+Infections%22%5BJournal%5D)">Viral Dynamics of Elite Suppressors in HIV-1 Infection.</a> Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections. , (2008).</li>
<li>Dinoso, J. B., Kim, S. Y., Wiegand, A. M., Palmer, S. E., Gange, S. J., Cranmer, L., O'Shea, A., Callender, M., Spivak, A., Brennan, T., Kearney, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+intensification+does+not+reduce+residual+HIV-1+viremia+in+patients+on+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Treatment intensification does not reduce residual HIV-1 viremia in patients on highly active antiretroviral therapy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 9403-9408 (2009).</li>
<li>Doria-Rose, N. A., Klein, R. M., Manion, M. M., O'Dell, S., Phogat, A., Chakrabarti, B., Hallahan, C. W., Migueles, S. A., Wrammert, J., Ahmed, R., Nason, M., Wyatt, R. T., Mascola, J. R., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+phenotype+of+human+immunodeficiency+virus+envelope-specific+B+cells+from+patients+with+broadly+cross-neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Frequency and phenotype of human immunodeficiency virus envelope-specific B cells from patients with broadly cross-neutralizing antibodies.</a> J. Virol. 83, 188-199 (2009).</li>
<li>Dornadula, G., Zhang, H., Uitert, B. V. an, Stern, J., Livornese, L., Ingerman, M. J., Witek, J., Kedanis, R. J., Natkin, J., DeSimone, J., Pomerantz, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+HIV-1+RNA+in+blood+plasma+of+patients+taking+suppressive+highly+active+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Residual HIV-1 RNA in blood plasma of patients taking suppressive highly active antiretroviral therapy.</a> JAMA. 282, 1627-1632 (1999).</li>
<li>Gandhi, R. T., Zheng, L., Bosch, R. J., Chan, E. S., Margolis, D. M., Read, S., Kallungal, B., Palmer, S., Medvik, K., Lederman, M. M., Alatrakchi, N., Jacobson, J. M., Wiegand, A., Kearney, M., Coffin, J. M., Mellors, J. W., Eron, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+raltegravir+intensification+on+low-level+residual+viremia+in+HIV-infected+patients+on+antiretroviral+therapy%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+medicine%22%5BJournal%5D)">The effect of raltegravir intensification on low-level residual viremia in HIV-infected patients on antiretroviral therapy: a randomized controlled trial.</a> PLoS medicine. 7, (2010).</li>
<li>Gay, C., Dibben, O., Anderson, J. A., Stacey, A., Mayo, A. J., Norris, P. J., Kuruc, J. D., Salazar-Gonzalez, J. F., Li, H., Keele, B. F., Hicks, C., Margolis, D., Ferrari, G., Haynes, B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-sectional+detection+of+acute+HIV+infection%3A+timing+of+transmission%2C+inflammation+and+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cross-sectional detection of acute HIV infection: timing of transmission, inflammation and antiretroviral therapy.</a> PLoS One. 6, 19617-19617 (2011).</li>
<li>Hatano, H., Delwart, E. L., Norris, P. J., Lee, T. H., Dunn-Williams, J., Hunt, P. W., Hoh, R., Stramer, S. L., Linnen, J. M., McCune, J. M., Martin, J. N., Busch, M. P., Deeks, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+persistent+low-level+viremia+in+individuals+who+control+human+immunodeficiency+virus+in+the+absence+of+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Evidence for persistent low-level viremia in individuals who control human immunodeficiency virus in the absence of antiretroviral therapy.</a> J. Virol. 83, 329-335 (2009).</li>
<li>Havlir, D. V., Bassett, R., Levitan, D., Gilbert, P., Tebas, P., Collier, A. C., Hirsch, M. S., Ignacio, C., Condra, J., Gunthard, H. F., Richman, D. D., Wong, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictive+value+of+intermittent+viremia+with+combination+hiv+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictive value of intermittent viremia with combination hiv therapy.</a> JAMA. 286, 171-179 (2001).</li>
<li>Jordan, M. R., Kearney, M., Palmer, S., Shao, W., Maldarelli, F., Coakley, E. P., Chappey, C., Wanke, C., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+standard+PCR%2Fcloning+to+single+genome+sequencing+for+analysis+of+HIV-1+populations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of standard PCR/cloning to single genome sequencing for analysis of HIV-1 populations.</a> J Virol Methods. 168, 114-120 (2010).</li>
<li>Kaufmann, D. E., Kavanagh, D. G., Pereyra, F., Zaunders, J. J., Mackey, E. W., Miura, T., Palmer, S., Brockman, M., Rathod, A., Piechocka-Trocha, A., Baker, B., Zhu, B., Gall, S. L. e, Waring, M. T., Ahern, R., Moss, K., Kelleher, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upregulation+of+CTLA-4+by+HIV-specific+CD4%2B+T+cells+correlates+with+disease+progression+and+defines+a+reversible+immune+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upregulation of CTLA-4 by HIV-specific CD4+ T cells correlates with disease progression and defines a reversible immune dysfunction.</a> Nat Immunol. 8, 1246-1254 (2007).</li>
<li>Kearney, M., Maldarelli, F., Shao, W., Margolick, J. B., Daar, E. S., Mellors, J. W., Rao, V., Coffin, J. M., Palmer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Population+Genetics+and+Adaptation+in+Newly+Infected+Individuals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Population Genetics and Adaptation in Newly Infected Individuals.</a> J. Virol. 83, 2715-2727 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Palmer, S., Maldarelli, F., Shao, W., Polis, M. A., Mican, J., Rock-Kress, D., Margolick, J. B., Coffin, J. M., Mellors, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequent+polymorphism+at+drug+resistance+sites+in+HIV-1+protease+and+reverse+transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Frequent polymorphism at drug resistance sites in HIV-1 protease and reverse transcriptase.</a> AIDS. 22, 497-501 (2008).</li>
<li>Kearney, M., Spindler, J., Shao, W., Maldarelli, F., Palmer, S., Hu, S. L., Lifson, J. D., Kewal Ramani, V. N., Mellors, J. W., Coffin, J. M., Ambrose, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+diversity+of+simian+immunodeficiency+virus+encoding+HIV-1+reverse+transcriptase+persists+in+macaques+despite+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genetic diversity of simian immunodeficiency virus encoding HIV-1 reverse transcriptase persists in macaques despite antiretroviral therapy.</a> Journal of Virology. 85, 1067-1076 (2011).</li>
<li>Keele, B. F., Giorgi, E. E., Salazar-Gonzalez, J. F., Decker, J. M., Pham, K. T., Salazar, M. G., Sun, C., Grayson, T., Wang, S., Li, H., Wei, X., Jiang, C., Kirchherr, J. L., Gao, F., Anderson, J. A., Ping, L. H., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , 105-7552 (2008).</li>
<li>Liu, S. L., Rodrigo, A. G., Shankarappa, R. G., Learn, H., Hsu, L., Davidov, O., Zhao, L. P., Mullins, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+quasispecies+and+resampling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HIV quasispecies and resampling.</a> Science. 273, 415-416 (1996).</li>
<li>Mahalanabis, M., Jayaraman, P., Miura, T., Pereyra, F., Chester, E. M., Richardson, B., Walker, B., Haigwood, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+viral+escape+and+selection+by+autologous+neutralizing+antibodies+in+drug-naive+human+immunodeficiency+virus+controllers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Continuous viral escape and selection by autologous neutralizing antibodies in drug-naive human immunodeficiency virus controllers.</a> J. Virol. 83, 662-672 (2009).</li>
<li>Migueles, S. A., Connors, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+CD4%28%2B%29+and+CD8%28%2B%29+T+Cells+in+Controlling+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Infect.+Dis.+Rep%22%5BJournal%5D)">The Role of CD4(+) and CD8(+) T Cells in Controlling HIV Infection.</a> Curr. Infect. Dis. Rep. 4, 461-467 (2002).</li>
<li>Palmer, S., Kearney, M., Maldarelli, F., Halvas, E. K., Bixby, C. J., Bazmi, H., Rock, D., Falloon, J., Davey, R. T., Dewar, R. L., Metcalf, J. A., Hammer, S., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple%2C+linked+human+immunodeficiency+virus+type+1+drug+resistance+mutations+in+treatment-experienced+patients+are+missed+by+standard+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 406-413 (2005).</li>
<li>Palmer, S., Wiegand, A. P., Maldarelli, F., Bazmi, H., Mican, J. M., Polis, M., Dewar, R. L., Planta, A., Liu, S., Metcalf, J. A., Mellors, J. W., Coffin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+real-time+reverse+transcriptase-initiated+PCR+assay+with+single-copy+sensitivity+for+human+immunodeficiency+virus+type+1+RNA+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">New real-time reverse transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma.</a> J. Clin. Microbiol. 41, 4531-4536 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

VIH-1 des individus infectés sur le traitement antirétroviral (TARV) ou qui, naturellement, le contrôle de l&#39;infection ont une très faible charge virale, généralement autour de 1 exemplaire par ml de plasma 4, 11, 12, 17, 18. Charge virale chez les patients avec un contrôle naturel, fluctuent souvent autour d&#39;un jeu individuel, point 1, 2, 17. La sensibilité des tests décrite ici est très dépendante sur le volume d&#39;entrée du plasma. Généralement, nous avons travaillé avec 7 ml de plasma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Hexamères aléatoires (500 ug / ml) </td><td> Promega </td><td> C118A </td><td></td></tr><tr><td> Taqman tampon A </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4304441 </td><td></td></tr><tr><td> RNAsine (40 U / UL) </td><td> Promega </td><td> N211B </td><td></td></tr><tr><td> RT enzyme (200 U / UL) </td><td> Strategene </td><td> 600107-51 </td><td></td></tr><tr><td> Polymérase ADN Amplitaq Or </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> 6-pack </td></tr><tr><td> Amplitaq 10XGold tampon PCR II </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> Magnesiumcloride 25 mM </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4311814 </td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> 1M tampon Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM </td><td> Invitrogen </td><td> AM9855G </td><td></td></tr><tr><td> Exposant III de la transcriptase inverse enzyme, 200 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 18080-044 </td><td></td></tr><tr><td> Exposant III de tampon 10X </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> TNT 100 mM </td><td> Invitrogen </td><td></td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> Platinum Taq ADN polymérase haute fidélité 5 U / ul </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td></td></tr><tr><td> 10X High Fidelity PCR Buffer </td><td> Invitrogen </td><td> 11304-102 </td><td> livré avec l&#39;enzyme </td></tr><tr><td> Protéinase K à 20 mg / ml </td><td> Ambion </td><td> 2546 </td><td></td></tr><tr><td> Solution de thiocyanate de guanidinium 6M </td><td> FlukaBiochemica </td><td> 50983 </td><td></td></tr><tr><td> Le glycogène 20 mg / ml </td><td> Roche </td><td> 10901393001 </td><td></td></tr><tr><td> Isopropanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 19516 </td><td></td></tr><tr><td> 70% d&#39;éthanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E702-3 </td><td></td></tr><tr><td> Moléculaire de l&#39;eau de qualité </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP (25 mmol chaque) </td><td> Bioline </td><td> BIO-39025 </td><td></td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Nom de Euipment </td><td> Société </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Facile Tubes à centrifuger Seal (16x73mm) </td><td> Seaton scientifique </td><td> 6041 </td><td></td></tr><tr><td> Blanc Delrin couronnes </td><td> Seaton scientifique </td><td> 4020 </td><td> Caps pour les tubes Sceau Facile </td></tr><tr><td> Portoir pour Optiseal Bell-Haut tubes, 8,9 ml </td><td> Beckman </td><td> 361642 </td><td></td></tr><tr><td> Pilote Hex ½ ouverture inc </td><td> Seaton scientifique </td><td> 4013 </td><td></td></tr><tr><td> tupe retrait bouchon </td><td> Seaton scientifique </td><td> 4014 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml Pipettes sérologiques </td><td> Costar </td><td> 4051 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetboy </td><td> toute </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 15 pipettes de transfert ml </td><td> ISC Bioexpress </td><td> P-5005-7 </td><td></td></tr><tr><td> 5,8 ml Pipettes de transfert de Dispossable, pointe fine </td><td> VWR </td><td> 14670-329 </td><td></td></tr><tr><td> 15 tubes à centrifuger ml </td><td> Falcon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 ml tubes à centrifuger </td><td> toute </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Tampon Tris comprimés Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T5030-100TAB </td><td></td></tr><tr><td> Ultracentrifuger et le rotor </td><td> Sorval </td><td> 90SE et T-1270 </td><td></td></tr><tr><td> Plaques de 96 puits PCR </td><td> Biorad </td><td> HSS-9601 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml de réactif du réservoir </td><td> Costar </td><td> 4870 </td><td></td></tr><tr><td> MicroAmp optiques plaque de 96 puits de réaction </td><td> Applied Biosystems </td><td> N801-0560 </td><td></td></tr><tr><td> Plaque optique couvre </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4333183 </td><td></td></tr><tr><td> Pad MicroAmp compression optique </td><td> Applied Biosystems </td><td> 4312639 </td><td></td></tr><tr><td> MicrosealUn film </td><td> Biorad </td><td> MSA-5001 </td><td></td></tr><tr><td> 2 tubes à centrifuger ml </td><td> Toute </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1% des gels d&#39;agarose (E-gel, Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> G-7008-01 </td><td></td></tr><tr><td> E-base (Invitrogen) </td><td> Invitrogen </td><td> EB-M03 </td><td></td></tr></tbody></table> EDTA tubes de prélèvement n&#39;importe quelle marque

amplifier et quantifier l&#39;arn vih-1 chez les individus infectés par le vih ayant une charge virale sous le seuil de détection par standard tests cliniques

Amplifying and Quantifying HIV-1 RNA in HIV Infected Individuals with Viral Loads Below the Limit of Detection by Standard Clinical Assays

Amplifier les gènes viraux et de quantifier l&#39;ARN VIH-1 du VIH-1 des individus infectés par une charge virale inférieure à la limite de détection par les tests standards (ci-dessous de 50 à 75 copies / ml) est nécessaire pour mieux comprendre la dynamique virale et les interactions hôte-virus chez les patients qui contrôler naturellement l&#39;infection et ceux qui sont sur le traitement antirétroviral (TARV). Nous décrivons ici comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome seule (le protocole SGS) 13, 19 et comment quantifier avec précision ARN VIH-1 chez les patients avec une faible charge virale (la seule copie-dosage (SCA) du protocole) 12, 20. Le dosage de copie unique est un test PCR en temps réel avec une sensibilité en fonction du volume de plasma étant dosé. Si une seule génome du virus est détecté dans 7 ml de plasma, puis le nombre de copies d&#39;ARN est rapporté à 0,3 copies / ml. Le test a une tests de contrôle interne pour l&#39;efficacité de l&#39;extraction d&#39;ARN, et des contrôles pour l&#39;amplification de l&#39;ADN possibles ou de contamination. Les échantillons de patients sont mesurés en trois exemplaires. Le seul test de séquençage du génome (SGS), aujourd&#39;hui largement utilisées et considérées comme non-travail 3 intensive, 7, 12, 14, 15, est un test de dilution limite, dans laquelle critère diluée produit d&#39;ADNc est étalée sur une de 96 puits assiette. Selon une distribution de Poisson, alors que moins de 1 / 3 des puits donner un produit, il ya 80% de chances de la résultante produit PCR d&#39;amplification étant d&#39;une seule molécule d&#39;ADNc. SGS a l&#39;avantage sur le clonage de ne pas être soumis à ré-échantillonnage et de ne pas être biaisé par PCR introduit recombinaison 19. Cependant, le succès d&#39;amplification de la SCA et SGS dépendra de conception d&#39;amorce. Les deux tests ont été développés pour le VIH-1 sous-type B, mais peut être adapté pour d&#39;autres sous-régions et d&#39;autres du génome par des amorces changer, sondes, et des normes.

La quantification des niveaux d&#39;ARN VIH-1 dans le plasma et le séquençage seule VIH-1 génomes d&#39;individus ayant une charge virale en dessous de la limite de détection (50-75 copies / ml) est difficile. Nous décrivons ici comment extraire et de quantifier les ARN viral plasmatique à l&#39;aide en temps réel PCR que les mesures de manière fiable ARN VIH-1 à 0,3 copies / ml et comment amplifier les génomes viraux par séquençage du génome unique, à partir d&#39;échantillons à très faible charge virale.

Amplifier et quantifier l&#39;ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

Amplification de gènes viraux et quantification de l'ARN du VIH-1 chez des individus infectés par le VIH-1 présentant des charges virales inférieures à la limite de détection des tests standards (inférieures à ...

Dans cette vidéo, des méthodes sont présentées pour quantifier et séquencer des génomes individuels du VIH provenant de personnes ayant une charge virale inférieure à 50 copies par millilitre de plasma. Premièrement, un tube contenant sept millilitres de plasma est centrifugé pour former un culot. L'ARN viral est ensuite extrait afin de quantifier le niveau de VIH-1.Un dosage par copie unique est réalisé, au cours duquel l'ARN est rétrotranscrit, chargé sur une plaque de 96 puits contenant des étalons et des contrôles, puis soumis à une PCR quantitative en temps réel. Le taux de virémie est ensuite calculé en fonction du volume d'entrée de plasma. Jusqu'à 0,3 copie par millilitre peut être détectée afin de caractériser la population virale.Un seul test de séquençage génomique est réalisé, au cours duquel l'ADNc transcrit à partir d'ARN viral est réparti dans une plaque de 96 puits afin d'atteindre une dilution limite. Ensuite, une PCR imbriquée est effectuée pour amplifier les génomes viraux. Si 30 % ou moins des réactions de PCR sont positives pour un échantillon donné, cela indique l'amplification d'une seule copie d'ADNc.Ces échantillons sont ensuite séquencés afin de révéler la séquence nucléotidique des génomes viraux individuels. La grande sensibilité de ces techniques nous permet de surveiller le taux de virus chez des patients ayant un VIH-1 indétectable par les tests standards et de comprendre les mécanismes de contrôle naturel. Bien que nous utilisions ces méthodes pour étudier le VIH avec différents amorces et un étalon interne d'ions, la même méthode peut également être employée pour l'étude d'autres virus.En général, cette méthode est difficile car il est compliqué d'isoler le virus à partir de grands volumes de plasma, et elle nécessite un environnement exempt d'ADN afin d'éviter les faux positifs. Commencez cette procédure en extrayant l'ARN à partir d'échantillons de plasma de patients. Transférez sept millilitres de plasma dans un tube propre de 15 millilitres.Si l'ARN doit être extrait pour le dosage de copie unique, 200 microlitres du contrôle interne des virions contenant 30 000 copies quantifiables de virus RCAs sont ajoutés à ce stade. Ensuite, afin d'éviter les lipides et les débris cellulaires qui peuvent interférer avec la quantification de l'ARN, faire une courte centrifugation du plasma à 2 600 ×g pendant 15 minutes. Après cette courte centrifugation, marquer un côté d'un tube à centrifuger avec scellage facile à l'aide d'un marqueur résistant à l'eau, en évitant tout débris cellulaire et/ou lipides. Utiliser une pipette pour transférer le plasma vers le tube à centrifuger marqué.Ensuite, enregistrez le volume d'entrée de plasma. Remplissez les tubes avec du tampon salin au tris jusqu'au bas du col fileté. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle.Fermez les tubes. Placez les échantillons avec le repère tourné vers l'extérieur dans un rotor d'ultracentrifugeuse prérefroidi. Effectuez une centrifugation à 170&nbsp;000 ×g à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Après la centrifugation, le culot ne sera pas visible. Éliminez le surnageant, puis ajoutez 90 microlitres d'eau de qualité moléculaire et 10 microlitres de protéine ACE K au culot viral. Ensuite, veillez à ce que le tube soit incliné de manière à ce que le culot soit immergé dans le mélange d'eau et de protéine ACE K.Placer le tube dans un bain-marie à 55 degrés Celsius et l'incuber pendant 30 minutes. Après l'incubation, faire une courte centrifugation du tube afin de ramener l'échantillon au fond du tube. Ensuite, après l'ajout de 10 microlitres de glycogène à 20 milligrammes par millilitre et de 315 microlitres de solution de thiocyanate de guanidinium à six molaire, effectuer un vortex.Transférez délicatement le contenu du tube dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre contenant 495 microlitres d'isopropanol de qualité moléculaire, puis vortexez pendant 10 secondes. Ensuite, centrifugez à 21 000 ×g pendant 30 minutes à température ambiante, jetez le surnageant et ajoutez 500 microlitres d'éthanol à 70 % dans le tube, vortexez pendant 10 secondes, puis centrifugez à 21 000 ×g pendant 15 minutes. À température ambiante, à l’aide d’une pipette de transfert de grande taille, retirez l’éthanol, centrifugez à nouveau et éliminez tout éthanol résiduel, puis laissez sécher le culot à l’air pendant 10 minutes.Si un dosage de copie unique doit être réalisé, dissoudre le culot dans 55 microlitres de tampon à ARN et placer le tube sur de la glace. Si un séquençage de génome unique doit être effectué, dissoudre l'ARN dans 40 microlitres de tris chlorhydrate à pH 8,0 et placer les tubes à température ambiante pour réaliser un dosage de copie unique.Les courbes standards du VIH-1 et des ARc sont préparées en réalisant une dilution sérielle demi-logarithmique des ARN du VIH-1 et des ARc dans un tampon à ARN. Après avoir étiqueté les tubes de 1,5 millilitre, ajouter 54 microlitres de tampon à ARN dans chacun des tubes. Ensuite, diluer jusqu'à 0,3 copie d'ARN pour 10 microlitres de VIH-1 et 100 copies d'ARN pour 10 microlitres d'ARc.Mélanger par vortex entre chaque dilution. Après avoir ajouté 54 microlitres de tampon à ARN dans chaque tube, commencer par ajouter 25 microlitres du transcrit au premier tube, effectuer un bref vortex, centrifuger et transférer consécutivement dans le tube suivant, en continuant jusqu'au dernier tube étiqueté.Une fois les dilutions préparées, mélangez le cocktail de transcriptase inverse ou RT pour la synthèse de l'ADNc. Préparez suffisamment pour 96 réactions de RT-PCR, incluant huit réactions témoins sans transcriptase inverse ou NRT, afin de contrôler l'amplification provenant de l'ADN. Ensuite, préparez une plaque optique de 96 puits, qui contiendra huit échantillons de patients, incluant les étalons et les témoins.Ajouter 20 microlitres du mélange de réaction NRT dans les huit puits désignés NRT et ajouter 20 microlitres du mélange de réaction RT dans les 88 puits restants. Après avoir ajouté les mélanges RT et NRT dans la plaque, ajouter 10 microlitres d'eau dans les puits étiquetés comme étant les témoins négatifs. Puis ajouter 10 microlitres de transcrits d'HIV dans les puits étiquetés HIV aux concentrations indiquées sur le protocole écrit joint, ainsi que dans deux puits étiquetés RCAs.Ajouter 10 microlitres des transcrits d'ACR aux concentrations souhaitées dans les huit séries de trois puits adjacents intitulés échantillon sur la plaque, ajouter 10 microlitres de l'échantillon mentionné. Ajouter également 10 microlitres de cet échantillon dans les huit puits intitulés NRT, puis dans les puits intitulés contrôle interne. Ajouter cinq microlitres d'échantillon et cinq microlitres d'eau une fois terminé.La plaque 96 puits est préparée comme indiqué sur cette figure. Scellez la plaque et exécutez-la sur un thermocycleur selon le programme suivant : 25 degrés Celsius pendant 15 minutes, 42 degrés Celsius pendant 40 minutes, 85 degrés Celsius pendant 10 minutes, 25 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis maintien à 5 degrés Celsius.Préparez les mélanges PCR maîtres pour le VIH et les RCA pendant que les ADNc sont en cours de synthèse. Une fois la synthèse d'ADNc terminée, transportez la plaque vers un espace situé à l'extérieur de la salle propre, désigné pour la manipulation des ADNc.Ajouter 20 microlitres du mélange maître H-I-V-P-C-R pour QPCR dans chacun des puits indiqués en vert sur cette figure. Puis ajouter 20 microlitres du mélange maître RCAS PCR dans le puit indiqué en gris sur cette figure. Faire tourner la plaque à 2 600 ×g après la centrifugation.Placer la plaque dans un appareil de PCR en temps réel et effectuer la PCR quantitative (QPCR) selon les conditions suivantes : 95 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis 45 cycles de 95 degrés Celsius pendant 15 secondes et de 60 degrés Celsius pendant une minute. Une fois les résultats obtenus, une analyse séparée des RCA et du VIH est nécessaire afin de réaliser un séquençage de génome unique.Commencez par synthétiser l'ADNc en utilisant de l'ARN suspendu dans du chlorure de tris à pH 8,0 comme matrice. Tout d'abord, dans une plaque PCR de 96 puits, mélangez cinq microlitres de dNTPs à 10 millimolaires, cinq microlitres de l'amorce spécifique du gène à 2 millimolaire, soit pole soit en, et 40 microlitres d'ARN extrait. Scellez la plaque avec un film micros eal de BioRad.Incubez ensuite la réaction pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius pour dénaturer le mélange d'ARN. Préparez le mélange de réaction de transcription inverse pendant que l'ARN est en cours de dénaturation.Remarquez que ce mélange de réaction de RT est différent de celui utilisé pour le dosage de copie unique. Après l'étape de dénaturation, placez la plaque PCR sur de la GLACE pour maintenir l'ARN sous forme dénaturée. Ajoutez ensuite 50 microlitres du mélange de réaction de RT fraîchement préparé à chaque échantillon et exécutez la plaque PCR dans le thermocycleur avec les paramètres suivants : 45 degrés Celsius pendant 50 minutes, 85 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis maintien à 4 degrés Celsius.Au cours de cette étape, l'ARN est rétrotranscrit en ADNc tandis que l'ADNc est en cours de synthèse. Préparez le mélange de réaction PCR en utilisant soit les amorces P six through RT, soit les amorces enveloppes PCR. Notez qu'il s'agit d'un mélange de réaction PCR différent de celui utilisé pour le dosage de copie unique : ajoutez 8,0 µL du mélange de réaction PCR, préparé fraîchement, dans chacun des 73 puits d'une nouvelle plaque PCR de 96 puits, comprenant 70 échantillons et trois contrôles négatifs.Lorsque la synthèse de l'ADNc est terminée, transférez la plaque vers un espace situé à l'extérieur de la salle propre et désigné pour la manipulation de l'ADNc. Ensuite, ajoutez 40 microlitres de tris chlorure d'hydrogène à pH 8,0 à l'échantillon d'ADNc afin d'obtenir un volume final de 140 microlitres. Puis ajoutez 2,0 microlitres d'échantillon dans chacun des 70 puits et 2,0 microlitres d'eau dans chacun des témoins négatifs. Scellez une plaque PCR et effectuez la PCR en utilisant le programme indiqué ici.Ensuite, réalisez une PCR imbriquée conformément aux instructions fournies dans le texte écrit joint. Après l'amplification par PCR, séparez les échantillons sur un gel d'agarose à 1 %. Analysez les résultats.Si au plus 30 % des puits sont positifs, la majorité des produits de PCR sont le résultat d'une seule molécule d'ADNc. Un dosage de copie unique a été réalisé comme décrit dans cette vidéo. Cette figure montre les résultats de PCR quantitative provenant de certains contrôleurs exceptionnels.Comme on peut le voir ici, les courbes d'amplification des échantillons et de l'étalon dilué de VIH semblent correctes. La récupération de l'étalon interne de virion a été supérieure à 1500 copies pour la plupart des échantillons, sauf pour l'échantillon sept entouré. Pour garantir une extraction efficace de l'ARN, les résultats de l'échantillon trois sont mis en évidence en rouge.Le nombre de copies dans les trois puits était de zéro, une et zéro copies. Le témoin NRT mis en évidence en orange et le témoin négatif mis en évidence en jaune étaient tous deux négatifs, confirmant que l'amplification n'était pas biaisée par une contamination provenant d'autres échantillons ou de l'ADN. Étant donné que les témoins positif et négatif ont été validés, le nombre de copies peut désormais être calculé. Le nombre moyen de copies de 0,3 doit être multiplié par un facteur de 5,5 pour obtenir le nombre total de copies dans l'élution d'ARN : 0,3 fois 5,5 égale 1,65, puis divisé par le volume total de plasma analysé, qui était de 7,3 millilitres, ce qui donne une charge d'ARN d'HIV-1 de 0,2 copies par ml.Le test de séquençage de génome unique a été réalisé comme décrit dans la vidéo. Cette figure montre un gel AROS provenant d'un des patients non contrôleurs du VIH dans l'étude. Les témoins négatifs des puits H1 et H2 sont tous deux négatifs.Moins d'un tiers des puits ont subi une amplification, garantissant qu'il s'agit d'une dilution en point final, et la majorité de ces amplifications proviennent d'une seule copie d'ADNc. Un alignement des séquences provenant du SGS est affiché ici. L'absence de sites d'ambiguïté confirme que l'amplification provient d'une seule copie d'ADNc lors de tentatives d'extraction d'ARN à partir de grands volumes de plasma.Il est important de se rappeler d'effectuer la pré-centrifugation afin d'éviter la présence de cellules et de lipides pouvant interférer avec l'efficacité du test après son développement. Cette technique a été utilisée pour étudier la dynamique virale chez une grande variété de groupes de patients présentant des charges virales inférieures à la limite de détection des tests standards.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

Fournit un protocole pour développer un test d’amplification de la polymérase recombinase en temps réel afin de quantifier la concentration initiale d’échantillons d’ADN à l’aide d’un thermocycleur ou d’un microscope et d’un réchauffeur de platine. Le développement d’un contrôle positif interne est également décrit. Des scripts sont fournis pour le traitement des données brutes de fluorescence en temps réel.

Développement d&#39;un Quantitative recombinase polymérase L&#39;amplification Assay avec un contrôle positif interne

Nous décrivons ici un procédé d'extraction d'ADN simple et rapide à base de papier d'ADN proviral du VIH dans le sang total détecté par PCR quantitative. Ce protocole peut être étendu pour une utilisation dans la détection d'autres marqueurs génétiques ou en utilisant des méthodes d'amplification alternatives.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

Des méthodes d’évaluation de l’efficacité et de la toxicité des molécules d’ARN ciblant les étapes post-intégration du cycle de réplication du VIH-1 sont décrites. Ces méthodes sont utiles pour cribler de nouvelles molécules et optimiser le format des molécules existantes.

Évaluation de l&#39;efficacité et la toxicité des ARNs Ciblage VIH-1 Production pour utilisation en thérapie génique ou des médicaments

Décrit est une méthodologie pour quantifier l’expression des 96 gènes et 18 protéines de surface de cellules uniques ex vivo, permettant d’identifier de façon différentielle exprimée des gènes et des protéines dans les cellules infectées par le virus par rapport aux cellules non infectées. Nous appliquons la démarche d’étude CD4 infectés par le SIV+ T cellules isolées de macaques rhésus.

Unicellulaire quantification des ARNm et Expression de protéines de Surface CD4 infectées par le Virus d’immunodéficience simien+ T les cellules isolées de macaques rhésus

Pleine longueur séquençage proviral individuel (FLIPS) fournit une méthode efficace et haut débit pour l’amplification et le séquençage d’unique, près de provirus pleine longueur de VIH-1 (intactes ou défectueux) et permettant la détermination de leur potentiel réplication-compétences. FLIPS surmonte les limites des tests précédents conçus pour séquencer le réservoir latent de VIH-1.

Amplification de près de provirus pleine longueur de VIH-1 pour l’ordonnancement de prochaine génération

Analyse de réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel combinée avec la transcription inverse (RT-qPCR) a été largement utilisée pour mesurer le niveau des infections à virus à ARN. Nous présentons ici un dosage direct de la RT-qPCR, ne nécessitant pas une étape de purification du RNA, mis au point pour la quantification de plusieurs virus à ARN, y compris le virus de la dengue.

ARN du Virus Dengue dans le surnageant de Culture de cellules infectées par PCR Quantitative en temps réel de la mesure

Nous présentons une approche de séquençage en profondeur qui fournit une détermination impartiale du naissant 3'-termini ainsi que des profils de mutations des molécules d’ADN simple brin. L’application principale est la caractérisation de naissants DNAs rétrovirales complémentaires (ADNc), les intermédiaires générés lors du processus de transcription inverse rétrovirale.

Déterminant des séquences de molécules monocaténaires naissant de l’ADN Viral au cours du VIH-1 et 3'-Termini Reverse Transcription dans les cellules infectées

Les épingles à cheveux et les boucles d'ARN peuvent fonctionner comme amorces pour la transcription inverse (RT) en l'absence des amorces séquence-spécifiques, interférant avec l'étude des transcriptions antisense de chevauchement. Nous avons mis au point une technique capable d'identifier l'ARN spécifique aux brins, et nous l'avons utilisée pour étudier la protéine antisens HIV-1 ASP.

Détection des transcriptions de l'ARN de type 1 (VIH-1) de protéine antisens (ASP) de détection du virus de l'immunodéficience humaine

Présenté ici est un protocole pour une approche d’imagerie par fluorescence, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA , and protein (MICDDRP), une méthode capable de visualiser simultanément par fluorescence unicellulaire de protéines virales et d’acides nucléiques de différents types et brins. Cette approche peut être appliquée à un large éventail de systèmes.

Imagerie par fluorescence multiplexée unicellulaire pour visualiser les acides nucléiques et les protéines virales et surveiller l’infection par le VIH, le VHB, le VHB, le VHC, le virus Zika et la grippe

Découvrez comment amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 dans les échantillons à faible charge virale par PCR en temps réel et séquençage de génomes uniques. Cette méthode détecte jusqu'à 0,3 copies/ml pour étudier la dynamique virale.

Amplifier et quantifier lARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques (Vidéo) | JoVE Journal

Amplifier et quantifier l'ARN VIH-1 chez les individus infectés par le VIH ayant une charge virale sous le seuil de détection par Standard tests cliniques

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