Name: Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes dARN total (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Apprenez à préparer des bibliothèques d'ARNm-Seq Illumina à partir de seulement 10 nanogrammes d'ARN total. Cette méthode utilise l'amplification linéaire T7 pour l'analyse d'expression génique.

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Ce travail a été soutenu par un financement de l&#39;Institut de recherche et d&#39;Morgridge l&#39;Université du Wisconsin Foundation. Nous tenons à remercier Krista Eastman pour son assistance éditoriale.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Les auteurs révéler que JAT est un fondateur, stockowner, consultant et membre du conseil de la dynamique cellulaire international (CDI). Il est aussi conseiller scientifique et a des intérêts financiers dans Ventures II Tactiques de cellules souches.

Les protocoles actuels pour rendre les bibliothèques fin jumelé nécessitent entre 1 ug de 9 à 2,5 mg 10 montant de départ de l&#39;ARN total. Ici, nous présentons nos amplification linéaire basée T7 (T7LA) méthode pour préparer à la fois simple lecture et les bibliothèques jumelé Illumina fin de séquençage et montrent que cette méthode permet la génération de bibliothèques d&#39;aussi peu que 10 ng d&#39;ARN total, la production de données qui est comparable à celle de minimalement amplifiées (MinAmp) fabriqués à partir de 1000 bibliothèques du matériel fois plus de départ (10 ug d&#39;ARN totaux). Les 10 bibliothèques ng non seulement identifier similaires du nombre total de gènes, mais aussi de produire des signatures d&#39;expression génique qui sont similaires (figures 3a et b). Par ailleurs, à la fois la seule fin de lecture et des bibliothèques jumelé produites par la méthode T7LA sont très semblables les uns aux autres (figure 3C), qui permet aux chercheurs de comparer les données générées par les bibliothèques à partir de deux protocoles. Depuis ces bibliothèques ont été préparés à partir d&#39;embryons humains ARN des cellules souches, nous avons cherchépour les 30 gènes de cellules souches spécifiques entre les bibliothèques et constatent que la quasi-totalité de ces gènes (93-100%) sont identifiés par les bibliothèques fabriqués à partir d&#39;au moins 10 ng d&#39;ARN total de départ (figure 4), validant ainsi notre protocole. Nous croyons que notre protocole serait très utile pour les chercheurs, en particulier dans des circonstances telles que des cellules d&#39;écoulement triés ou laser micro-disséqués tissus où le matériel de départ est limitant. Dans de telles circonstances, notre protocole permettrait la génération de données d&#39;expression génique comparables aux bibliothèques fabriqués à partir de beaucoup plus grande quantité de départ, car notre protocole produit des profils d&#39;expression comparables à travers au moins 3 ordres de grandeur de l&#39;ARN de départ.

<table border="1"><tbody><tr><td> Société </td><td> Kit / Réactif </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaires spéciales </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> La fragmentation de réactifs </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> L&#39;acrylamide Liner </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> Megascript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC non traités eau sans nucléase </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP jeu </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP méthylés </td><td> R0431 </td><td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Génération kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 cycles </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Seq Sample Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule. Peut être remplacé par l&#39;ONE échantillon d&#39;ADN de préparation Mix Master Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Génération kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Pour de préparation fin échantillon apparié ne </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Jumelés échantillon Fin Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Pour de préparation fin échantillon apparié ne </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb, plus l&#39;échelle </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli RNase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Buffer brin deuxième 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Polymérase ADN de E. coli </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> SYBR E-gel sûre 2% </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Exposant que jeII (avec 5X FS tampon et DTT 0,1 M) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ARN test quibit kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ADNdb HS qubit test kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli ADN ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> ADN polymérase T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra pur Dnase Rnase l&#39;eau </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Superscript II double brin kit de synthèse d&#39;ADNc </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Amorce aléatoire (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Pour de préparation fin échantillon apparié ne </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer amorce B </td><td> N / A </td><td> Pour lire Simple Samexemple de préparation ne </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> ONE </td><td> Not 1 kit de digestion </td><td> R0189S </td><td> Pour préparation d&#39;échantillon simple lecture seule </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNeasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Kit de purification de gel </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Dnase jeu </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo recherche </td><td> L&#39;ADN propre et concentrateur (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

simple lire et jumelés bibliothèques fin illumina arnm-seq de 10 nanogrammes d&#39;arn total

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Séquençage du transcriptome entier par l&#39;ARNm-Seq est maintenant largement utilisée pour effectuer l&#39;expression génique globale, la mutation, l&#39;allèle spécifique d&#39;expression et d&#39;autres analyses du génome entier. ARNm-Seq ouvre même la porte pour l&#39;analyse de l&#39;expression du gène de la non-séquencé les génomes. ARNm-Seq offre une sensibilité élevée, une large gamme dynamique et permet de mesurer le nombre de copies transcription dans un échantillon. Analyseur d&#39;Illumina génome effectue le séquençage d&#39;un grand nombre (&gt; 10 7) de la séquence relativement courte lit (&lt;150 pb). La «fin jumelé&quot; approche, dans laquelle une seule lecture longue est séquencé à ses deux extrémités, permet de suivre les jonctions d&#39;épissage alternatif , insertions et suppressions, et est utile pour l&#39;assemblage de novo du transcriptome. L&#39;un des défis majeurs auxquels sont confrontés les chercheurs est une quantité limitée de matériau de départ. Par exemple, dans des expériences où les cellules sont récoltées par laser de micro-dissection, disponible à partir d&#39;ARN totaux may mesure en nanogrammes. Préparation de l&#39;ARNm-Seq bibliothèques à partir de ces échantillons ont été décrites 1, 2, mais implique une quantité importante d&#39;amplification PCR qui peuvent introduire des biais. Autres ARN-Seq procédures de construction de bibliothèque avec un minimum d&#39;amplification PCR ont été publiés 3, 4, mais exigent des quantités microgramme de l&#39;ARN total de départ. Nous décrivons ici un protocole pour la plateforme Illumina Genome Analyzer II pour l&#39;ARNm-Seq séquençage pour la préparation de la bibliothèque qui évite significative l&#39;amplification par PCR et ne requiert que 10 nanogrammes d&#39;ARN total. Bien que ce protocole a été décrit précédemment et validés pour une seule fin de séquençage 5, où il a été montré pour produire des bibliothèques sans introduire de biais directionnel amplification significative, il est ici de valider encore pour être utilisé comme un protocole de fin appariées. Nous amplifier sélectivement les ARN messagers polyadénylé de commencer ARN total en utilisant la T7 basée Eberwine méthode d&#39;amplification linéaire, inventé &quot;T7LA &quot;(T7 linéaires d&#39;amplification). Le amplifié ARNm poly-A sont fragmentés, une transcription inverse et l&#39;adaptateur ligaturés pour produire la bibliothèque séquençage final. Pour les deux courses seule fin de lecture et appariés, les séquences sont mappés à l&#39;homme du transcriptome 6 et normalisée de sorte que les données de plusieurs exécutions peuvent être comparés. Nous rapportons la mesure d&#39;expression génique dans des unités de transcriptions par million (TPM), qui est une mesure supérieure à RPKM lorsque l&#39;on compare les échantillons 7.

Nous décrivons ici une méthode pour la préparation des deux simples de lecture et jumelé fin Illumina ARNm-Seq bibliothèques de séquençage de l&#39;analyse d&#39;expression génique basée sur l&#39;ARN T7 linéaires d&#39;amplification. Ce protocole ne nécessite que 10 nanogrammes d&#39;ARN total de départ et génère des bibliothèques très cohérente représentant transcriptions ensemble.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d&#39;ARN total

Le séquençage de l'ensemble du transcriptome par mRNA-Seq est désormais largement utilisé pour réaliser l'analyse globale de l'expression génique, des mutations, de l'expression spécifique d'un allèle et d'autres...

L'objectif général de cette procédure est de générer des bibliothèques de séquences d'ARNm Illumina à partir de faibles quantités de matériel initial. La première étape de la procédure consiste à transcrire en sens inverse l'ARN total à l'aide de sept amorces DTT afin de produire de l'ADNc. L'ADNc est ensuite utilisé pour l'amplification de l'ARN par transcription in vitro. Par la suite, l'ARN amplifié est soumis à une fragmentation aléatoire.La transcription inverse de l'ARN fragmenté produit de l'ADNc, qui subit une ligature d'adaptateurs, une sélection par taille et une amplification par PCR. En fin de compte, ce protocole révèle le profil d'expression génique de l'échantillon par la mesure du nombre de copies des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle nécessite seulement 10 nanogrammes d'ARN total au départ.Cela représente des ordres de grandeur inférieurs aux quantités requises par les autres protocoles existants. De plus, il permet de générer des bibliothèques appariées à partir de quantités aussi faibles d'ARN initial. Cette méthode permettra aux scientifiques d'explorer de nouvelles questions en biologie, en rendant possible la détermination de profils d'expression génique à partir de populations cellulaires difficiles à obtenir, telles que celles issues de la capture laser, de la microdissection ou de la cytométrie en flux.Nous avons eu pour la première fois l'idée de développer cette méthode lorsque nous avons dû analyser l'expression génique à partir d'un nombre très restreint de cellules différenciées de cellules souches amniotiques humaines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de manipulation de l'ARN sont difficiles à apprendre en raison de la très faible quantité d'ARN, facilement dégradable. La procédure sera démontrée par Angela Elwell, Jennifer Bolen et Baal Kimm Wynn de mon laboratoire.La méthode de préparation simultanée de bibliothèques de séquençage en simple lecture et en lecture pairée est une procédure en plusieurs étapes, illustrée dans ce diagramme de flux. Tout d'abord, l'ARN total est isolé à partir des cellules ou tissus d'intérêt et utilisé pour préparer l'ADNc double brin. Les ARN messagers polyadénylés sont ensuite amplifiés de manière sélective à partir de l'ADNc en utilisant la méthode d'amplification linéaire T7 basée sur Eberwine. Ensuite, les polyA amplifiés sont fragmentés de manière aléatoire.Après nettoyage de l'ARN fragmenté, celui-ci est rétrotranscrit en ADNc. L'ADNc est ensuite réparé aux extrémités et des bases A sont ajoutées à l'extrémité 3' des fragments d'ADN. Ensuite, des adaptateurs sont ligaturés à l'ADN et une digestion n'est pas effectuée. Dans le cas de la bibliothèque à simple lecture, la bibliothèque d'ADN est alors isolée par purification sur gel et amplifiée par PCR afin de ligaturer les adaptateurs Illumina.Enfin, une fois la bibliothèque d'ADN quantifiée, elle est prête à être séquencée. Aux fins de cette vidéo, seules certaines étapes de ce protocole seront démontrées. La transcription inverse des ARNm polyA fragmentés en ADNc implique la synthèse du premier brin et du deuxième brin.Pour la synthèse du premier brin de la bibliothèque en simple lecture, ajouter les réactifs suivants dans un tube PCR : 10 microlitres d'ARNm polyA fragmenté et un microlitre d'amorce nonamer aléatoire non un. La séquence de l'amorce nonamer non un est indiquée ici. La séquence proximale en 5' indiquée en vert correspond au site de restriction non un.Bien que la séquence indiquée en bleu soit le complément inverse de la séquence d'adaptateur B d'Illumina provenant du kit de séquençage sur puce, incubez le mélange à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes dans le thermocycleur, puis refroidissez rapidement sur de la glace. En maintenant le mélange sur la glace, ajoutez les réactifs suivants du kit Superscript trois : quatre microlitres de tampon 5 x pour la première chaîne, deux microlitres de DTT et 1,5 microlitre de mélange de dNTP. Dans le mélange de dNTP, utilisez du 5-méthyl-dCTP au lieu du dCTP. Placez le tube dans le thermocycleur à 42 degrés Celsius pendant deux minutes, puis ajoutez un microlitre de la transcriptase inverse Superscript trois et incubez à 42 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, préparez la réaction de synthèse du premier brin pour la bibliothèque para end. Ajoutez les réactifs suivants dans un tube PCR : 10 microlitres de poly NNA fragmenté et un microlitre d'amorce hexamère aléatoire. Incubez à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes dans le thermocycleur, puis refroidissez rapidement sur de la glace.En gardant le tube sur de la glace, ajoutez les réactifs suivants du kit Superscript Three : quatre microlitres de tampon de première chaîne 5 x, deux microlitres de DTT et 1,5 microlitre de dNTPs. Incubez dans le thermocycleur à 45 °C pendant une minute. Ajoutez ensuite un microlitre de Superscript Three, transcriptase inverse, et incubez à 45 °C pendant une heure après une heure.Les deux réactions sont prêtes pour la synthèse du brin complémentaire. Ajouter à chacun des mélanges placés sur glace les réactifs suivants du kit Superscript Two : 91 microlitres d'eau libre de nucléases, 30 microlitres de tampon 5 x pour la synthèse du brin complémentaire, 3 microlitres de dNTPs, 1 microlitre de ligase ADN d'*E. coli*, 4 microlitres de polymérase ADN d'*E. coli* et 1 microlitre de RNase H d'*E. coli*. Mélanger chaque tube par retournement, puis centrifuger brièvement et incuber à 16 degrés Celsius pendant deux heures.Pour la réparation des extrémités de l'ADNc destiné à la bibliothèque en simple lecture, ajouter à 40 microlitres d'ADNc purifié les réactifs suivants : cinq microlitres de tampon T4 ADN ligase contenant 10 millimolaire de ATP, deux microlitres de mélange de dNTP, un microlitre de polymérase T4 ADN, un microlitre d'enzyme klino et un microlitre de T4 PNK pour la réparation des extrémités de l'ADNc. Pour la bibliothèque en lecture double, ajouter à 30 microlitres d'ADNc purifié ces réactifs : 45 microlitres d'eau RNase/DNase sans nucléases.10 microlitres de tampon T4 DNA ligase contenant 10 millimolaire de ATP, 4 microlitres de mélange de dNTP à 10 millimolaire, 5 microlitres de T4 DNA polymérase, 1 microlitre d'enzyme Klenow et 5 microlitres de T4 PNK. Incuber les deux tubes dans le thermocycleur à 20 degrés Celsius pendant 30 minutes après la réparation des extrémités.L'étape suivante de ce protocole consiste à ajouter des bases d'adénine à l'extrémité trois prime des fragments d'ADN pour la bibliothèque en simple lecture. Préparez le mélange réactionnel suivant : 34 microlitres d'échantillon d'ADN, 5 microlitres de tampon klino, 10 microlitres de DATP et 1 microlitre de klino exo. Pour la bibliothèque en lecture appariée, préparez le mélange réactionnel suivant : 32 microlitres d'échantillon d'ADN, 5 microlitres de tampon clin out.10 microlitres de DATP et trois microlitres de clin out exo ; incuber les deux mélanges réactionnels à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avant de préparer les réactions de ligation des adaptateurs. Décongeler les adaptateurs sur de la glace et les diluer au 1/20 pour la bibliothèque en lecture simple. Utiliser le kit de préparation d'échantillons de séquence pour puce Illumina afin de préparer le mélange réactionnel suivant : 10 microlitres d'échantillon d'ADN, un microlitre de mélange d'oligonucléotides adaptateurs, 15 microlitres de tampon de ligase 2X et quatre microlitres de ligase d'ADN ; incuber pendant 15 minutes.À température ambiante pour la bibliothèque en lecture double, utilisez le kit de préparation d'échantillons en lecture double d'Illumina pour préparer la réaction suivante. Mélangez 10 microlitres d'échantillon d'ADN, 10 microlitres de mélange d'oligonucléotides d'adaptateur PE, 25 microlitres de tampon de ligase deux X et 5 microlitres de ligase d'ADN ; incubez pendant 15 minutes à 20 degrés Celsius à la fin des incubations respectives. Purifiez les deux réactions de ligature à l'aide de colonnes XMO.Éluer, la bibliothèque en lecture simple et 44 microlitres d'eau pour éluer la bibliothèque en lecture pair avec six microlitres de tampon d'élution, suivi d'une autre élution dans cinq microlitres de tampon EB. Réaliser une digestion non pas une, uniquement pour la bibliothèque en lecture simple. Incuber de deux heures à toute la nuit à 37 degrés Celsius après avoir purifié la réaction à l'aide d'une colonne ZY IMO.Éluer la bibliothèque à lecture unique avec six microlitres de tampon EB, suivis d'une seconde dilution avec cinq microlitres de EB. L'ADN avec adaptateurs ligaturés, pour les deux bibliothèques, est désormais prêt à subir la sélection de taille. La procédure de sélection de taille de l'ADN avec adaptateurs ligaturés est réalisée à l'aide d'un gel à 2 % de Cyber Safe EE d'In Vitrogen ; pour commencer cette procédure, exécuter le programme zéro en pré-course pendant deux minutes.Après la pré-course, charger 10 microlitres de l'échelle d'un KB plus et des échantillons d'ADN 2D. Remplir les puits vides avec 10 microlitres d'eau. Exécuter le programme. Un egel 2 % pendant 28 minutes.Lorsque la course est terminée, sélectionnez les fragments de gel de 200 à 300 paires de bases à l’aide d’une lame de rasoir neuve. Le nombre de gènes identifiés par les différentes banques a été évalué, et ce tableau présente des informations sur les nombres d’agrégats. Taux d’erreur d’identification des gènes et pourcentage d’alignement des banques à lecture simple et à lectures appariées, pour les deux types de banques.Les biblioth&egrave;ques T seven LA de 10 nanogrammes ont identifi&eacute; presque le m&ecirc;me nombre de g&egrave;nes que les biblioth&egrave;ques amplifi&eacute;es UN de 10 microgrammes avec un TPM de 10 ou plus. Dans le cas des biblioth&egrave;ques &agrave; lecture unique, la biblioth&egrave;que T seven LA de 10 nanogrammes a identifi&eacute; 100 % des 8&nbsp;500 g&egrave;nes d&eacute;tect&eacute;s par la biblioth&egrave;que amplifi&eacute;e UN de 10 microgrammes pour les biblioth&egrave;ques de r&eacute;f&eacute;rence. La biblioth&egrave;que T seven LA de 10 nanogrammes a identifi&eacute; 86 % des g&egrave;nes d&eacute;tect&eacute;s par la biblioth&egrave;que UN de 10 microgrammes.Les biblioth&egrave;ques r&eacute;alis&eacute;es &agrave; partir de moins de 10 nanogrammes n'ont pas permis d'identifier autant de g&egrave;nes. Par exemple, dans le protocole &agrave; lecture unique, la biblioth&egrave;que T seven LA d'un nanogramme a identifi&eacute; seulement environ 50 % des g&egrave;nes d&eacute;tect&eacute;s par la biblioth&egrave;que min amp de 10 microgrammes. Par cons&eacute;quent, la quantit&eacute; minimale d'ARN total &agrave; utiliser avec le protocole T seven LA doit &ecirc;tre limit&eacute;e &agrave; 10 nanogrammes pour le cartographage d'un g&egrave;ne d'entretien.GA DH montre que toutes les bibliothèques T seven LA réalisées avec au moins 10 nanogrammes d'ARN initial ont identifié tous les exons, y compris l'exon extrême en cinq prime. La barre d'échelle à gauche pour les bibliothèques à lecture unique indique un total de 350 lectures. La barre d'échelle au centre pour les bibliothèques DEN indique un total de 5 000 lectures.Une comparaison des bibliothèques à lecture simple et en paires de 10 nanogrammes T seven LA avec les bibliothèques min amp révèle un haut degré de similitude. Un coefficient de corrélation de Spearman de 0,90 a été obtenu entre la bibliothèque T seven LA de 10 nanogrammes à lecture simple et la bibliothèque min amp de 10 microgrammes, et un coefficient de corrélation de 0,95 a été obtenu entre la bibliothèque T seven LA PEREN de 10 nanogrammes et la bibliothèque min amp de 10 microgrammes. En outre, une comparaison entre les deux bibliothèques à lecture simple et PEREN réalisées à partir de 10 nanogrammes d'ARN total a été effectuée, et le coefficient de corrélation très élevé démontre que les deux types de bibliothèques préparées selon le protocole T seven LA produisent une signature d'expression génique très similaire.Enfin, puisque ces bibliothèques ont été préparées à partir d'ARN de cellules souches embryonnaires humaines, des gènes spécifiques ont été recherchés parmi les bibliothèques. Presque tous ces gènes ont été identifiés par les bibliothèques réalisées à partir d'au moins 10 nanogrammes d'ARN total initial, validant ainsi ce protocole. Lors de l'exécution de ce protocole, il est important de manipuler les échantillons d'ARN de petite taille avec une extrême précaution afin d'éviter leur dégradation.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une très bonne compréhension de la manière de préparer des bibliothèques Illumina, Mr.Aeq en lecture simple et Paradigm à partir de très faibles quantités de matériel initial.

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Analyse en temps réel du facteur de Transcription Binding, Transcription, traduction et chiffre d’affaires pour afficher des événements mondiaux au cours de l’Activation cellulaire

Ce protocole montre comment purifier les microARN extracellulaires de milieux de culture cellulaire pour petite construction de bibliothèque de RNA et de séquençage de la génération suivant. Différents points de contrôle de contrôle de la qualité sont décrites pour permettre aux lecteurs de comprendre à quoi vous attendre lorsque vous travaillez avec des échantillons d’entrée faibles comme exRNAs.

Isoler, séquençage et l’analyse des microARN extracellulaires de cellules souches mésenchymateuses humaines

Le séquençage nanopore est une nouvelle technologie qui permet un séquençage rentable dans les emplacements distants et les paramètres pauvres en ressources. Ici, nous présentons un protocole pour le séquençage des mRNA de sang entier qui est compatible avec de telles conditions.

Séquençage de l’ARNm de sang total à l’aide du séquençage NANOPORE

Nous présentons un protocole détaillé de réparation de petite bibliothèque d'ARN avec moins de biais que les méthodes standard et une sensibilité accrue pour les ARN 2'-O-méthyle. Ce protocole peut être suivi à l'aide de réactifs faits maison pour économiser des coûts ou en utilisant des kits pour plus de commodité.

Améliorer l'ARN-seq : moins de biais et une meilleure détection des ARN 2'-O-Methyl

Nous décrivons une technique de profilage des microARN chez les premiers embryons de souris. Ce protocole surmonte le défi de l’entrée de cellules faibles et de l’enrichissement de l’ARN. Ce test peut être utilisé pour analyser les changements dans l’expression miRNA au fil du temps dans différentes lignées cellulaires de l’embryon de souris précoce.

Préparation de petites bibliothèques d’ARN pour le séquençage à partir d’embryons de souris précoces

Nous décrivons ici les étapes de la collecte d’échantillons et de la préparation pour RIBO-seq chez les bactéries. Le séquençage des bibliothèques préparées conformément à ces lignes directrices donne suffisamment de données pour une analyse bioinformatique complète. Le protocole que nous présentons est simple, utilise un équipement de laboratoire standard et prend sept jours de la lyse à l’obtention des bibliothèques.

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

Grands écrans des banques métagénomiques

Extraction d&#39;ARN à partir de cellules Neuroprecursor Utiliser le Bio-Rad ARN total Kit

Apprenez à préparer des bibliothèques d'ARNm-Seq Illumina à partir de seulement 10 nanogrammes d'ARN total. Cette méthode utilise l'amplification linéaire T7 pour l'analyse d'expression génique.

Simple Lire et jumelés bibliothèques Fin Illumina ARNm-Seq de 10 nanogrammes d'ARN total

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