Name: Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de lexpression génique par Reporters Bioluminescence luciférase (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez la surveillance des rythmes circadiens cellulaires par bioluminescence luciférase. Cette méthode utilise des vecteurs lentiviraux pour créer des lignées rapporteuses stables et non invasives.

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Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation (IOS-0920417) (ACL).

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

1. Modifications au Protocole actuel 1,1 appareils d&#39;enregistrement et de considérations débit En raison de sa disponibilité commerciale, la LumiCycle (Actimetrics) est devenu l&#39;appareil le plus couramment utilisé luminomètre automatisé pour enregistrement en temps réel 4,5,9,19,29-31. Le LumiCycle emploie des tubes photomultiplicateurs (PMT) en tant que détecteurs de lumière, qui offrent une extrême sensibilité et faible bruit 14, et est...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> HyClone </td><td> SH30243FS </td><td> Pour la croissance cellulaire régulier </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td> Pour luminométrie </td></tr><tr><td> FBS </td><td> HyClone </td><td> SH3091003 </td><td></td></tr><tr><td> Pen / Strep / Gln (100x) </td><td> HyClone </td><td> SV3008201 </td><td></td></tr><tr><td> B-27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciférine </td><td> Biosynth </td><td> L-8220 </td><td></td></tr><tr><td> La poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrène </td><td> Millipore </td><td&gt; TR-1003-G </td><td></td></tr><tr><td> La forskoline </td><td> Sigma </td><td> F6886 </td><td></td></tr><tr><td> Tous les autres produits chimiques </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td></td><td></td><td> 5% de CO2 à 37 ° C </td></tr><tr><td> Hotte de culture de tissus </td><td></td><td></td><td> BSL-2 certifié </td></tr><tr><td> Lumière fluorescente et microscope </td><td></td><td></td><td> Contraste de phase optionnelle </td></tr><tr><td> LumiCycle </td><td> Actimetrics </td><td></td><td></td></tr></table>

surveillance de cellules autonomes rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par reporters bioluminescence luciférase

Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters

Chez les mammifères, de nombreux aspects du comportement et de la physiologie comme cycles veille-sommeil et le métabolisme du foie sont régis par horloges circadiennes endogènes (revu 1,2). Le rythme circadien garde-temps est un système hiérarchique multi-oscillateur réseau, avec l&#39;horloge centrale située dans le noyau suprachiasmatique (NSC) la synchronisation et la coordination des horloges extra-SCN et périphérique ailleurs 1,2. Les cellules individuelles sont des unités fonctionnelles pour la production et l&#39;entretien des rythmes circadiens 3,4, et ces oscillateurs de différents types de tissus de la part d&#39;un organisme remarquablement semblable mécanisme biochimique rétroaction négative. Toutefois, en raison des interactions au niveau du réseau neuronal dans le SCN et à travers rythmiques, les indices systémiques au niveau organismique, les rythmes circadiens au niveau organismique ne sont pas nécessairement cell-autonomous 5-7. Par rapport aux études traditionnelles de l&#39;activité locomotrice in vivo et ex vivo d&#39;explants SCN, cell-fondé des tests in vitro permettent la découverte de cellules autonomes défauts circadiens 5,8. Stratégiquement, à base de cellules modèles sont plus dociles expérimentalement pour la caractérisation phénotypique et la découverte rapide des mécanismes d&#39;horloge de base 5,8-13. Parce que les rythmes circadiens sont dynamiques, les mesures longitudinales avec une haute résolution temporelle sont nécessaires pour évaluer la fonction horloge. Ces dernières années, l&#39;enregistrement bioluminescence en temps réel en utilisant la luciférase de luciole en tant que journaliste est devenu une technique courante pour étudier les rythmes circadiens chez les mammifères 14,15, car elle permet l&#39;examen de la persistance et de la dynamique moléculaire des rythmes. Pour surveiller des cellules autonomes rythmes circadiens de l&#39;expression des gènes, les journalistes luciférase peut être introduit dans les cellules par transfection transitoire 13,16,17 ou transduction stable 5,10,18,19. Nous décrivons ici un protocole de transduction stable à l&#39;aide de gènes médié par lentivirus. Te système de vecteur lentiviral est supérieur aux méthodes traditionnelles telles que la transfection transitoire et la transmission germinale en raison de son efficacité et la polyvalence: il permet l&#39;exécution efficace et une intégration stable dans le génome de l&#39;hôte à la fois la division et non les cellules en division 20. Une fois une lignée cellulaire journaliste est établie, la dynamique de la fonction d&#39;horloge peut être examiné à travers l&#39;enregistrement de bioluminescence. Nous décrivons d&#39;abord la génération de P (Per2)-d lignes journaliste Luc, puis présentent les données de cette étude et d&#39;autres journalistes circadiens. Dans ces essais, les fibroblastes de souris 3T3 et U2OS cellules d&#39;ostéosarcome humains sont utilisés comme modèles cellulaires. Nous discutons également de multiples façons d&#39;utiliser ces modèles dans les études d&#39;horloge circadienne. Les méthodes décrites ici peuvent être appliqués à une grande variété de types de cellules pour étudier les bases cellulaires et moléculaires des horloges circadiennes, et peut s&#39;avérer utile dans la résolution des problèmes dans d&#39;autres systèmes biologiques.

Horloges circadiennes fonctionner dans des cellules individuelles, c&#39;est à dire qu&#39;ils sont des cellules autonomes. Ici, nous décrivons les méthodes pour générer des modèles d&#39;horloge cellules autonomes utilisant des méthodes non-invasives, la luciférase technologie basée sur la bioluminescence en temps réel. Cellules Reporter fournir traitables, des systèmes de modèles fonctionnels pour l&#39;étude de la biologie circadienne.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l&#39;expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Chez les mammifères, de nombreux aspects du comportement et de la physiologie, tels que les cycles veille-sommeil et le métabolisme hépatique, sont régulés par des horloges circadiennes endogènes...

Ce protocole décrit la génération de lignées cellulaires rapporteuses exprimant la luciférase et la surveillance subséquente des rythmes circadiens autonomes au niveau cellulaire par détection de l'expression de bioluminescence. Commencez par construire des rapporteurs viraux lentiviraux exprimant la luciférase, puis produisez des particules lentivirales afin d'infecter les cellules d'intérêt et d'amplifier les cultures sélectionnées. Ensuite, surveillez l'expression de bioluminescence dans les cellules rapporteuses synchronisées à l'aide d'un dispositif d'enregistrement approprié.En fin de compte, l'enregistrement de la bioluminescence est utilisé pour démontrer les rythmes circadiens cellulaires autonomes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la transfection transitoire et la protection de la lignée germinale, est que l'intégration est médiée par un virus. Le gène assure une intégration stable dans le génome des cellules, ainsi qu'une efficacité et une polyvalence accrues.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l'horloge circadienne. Par exemple, existe-t-il des horloges circa

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L'horloge circadienne régule environ un tiers du transcriptome Arabidopsis, mais le pourcentage de gènes qui se nourrissent de nouveau dans timekeeping reste inconnue. Ici, nous visualisons une méthode pour évaluer rapidement les phénotypes circadiens dans toute lignée mutante d'Arabidopsis en utilisant l'imagerie luminescente d'un journaliste circadien transitoirement exprimé en protoplastes.

Analyse rapide des phénotypes circadiens dans Arabidopsis protoplastes transfectées avec un Luminescent Clock Reporter

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Un test de bioluminescence in vitro afin de déterminer des rythme circadien cellulaire dans les cellules épithéliales mammaires est présenté. Cette méthode utilise des plasmides de journaliste de cellules de mammifères exprimant déstabilisé luciférase sous le contrôle du promoteur du gène de la période 2 . Il peut être adapté à d’autres types de cellules pour évaluer les effets spécifiques sur le rythme circadien.

In Vitro Test de bioluminescence pour caractériser le rythme circadien dans les cellules épithéliales mammaires

Luciférase génétiquement encodé est un journaliste populaire non invasif de l’expression génique. Utilisation d’une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR) permet l’enregistrement longitudinal des cellules bioluminescentes sous un large éventail de conditions. Ici, nous montrons comment ALLIGATOR peut être utilisé dans le cadre de la recherche de rythmes circadiens.

Mesure souples de Reporters bioluminescents utilisant une luciférase longitudinale automatisé d’imagerie enregistreur de gaz et la température-optimisé (ALLIGATOR)

Cette technologie nouvellement développée basés sur la fluorescence permet une surveillance à long terme de la transcription des gènes de l’horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique (SCN) de se déplaçant librement les souris en temps réel et à une haute résolution temporelle.

In Vivo Suivi de l’Expression génique horloge circadienne dans le noyau suprachiasmatique de souris à l’aide de Reporters de Fluorescence

Nous présentons ici un protocole visant à analyser le transfert de cellule à cellule de renseignements oscillatoires par optogenetic contrôle et suivi de l’expression génique en direct. Cette approche constitue une plate-forme unique pour tester une importance fonctionnelle des programmes d’expression de gène dynamique dans les systèmes multicellulaires.

Une méthode Optogenetic pour contrôler et analyser les profils d’Expression génique dans les Interactions cellule-cellule

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Les rythmes circadiens, qui existent dans la plupart des organismes, régulent l’organisation temporelle des processus biologiques. Les organoïdes 3D sont récemment apparus comme un modèle in vitro physiologiquement pertinent. Ce protocole décrit l’utilisation de rapporteurs bioluminescents pour observer les rythmes circadiens dans les organoïdes, permettant ainsi d’étudier in vitro les rythmes circadiens dans les systèmes multicellulaires.

Surveillance des oscillations circadiennes à l’aide d’un rapporteur de bioluminescence dans les organoïdes

Ce rapport décrit une méthode impliquant un script R dans le logiciel open source RStudio pour analyser des ensembles de données à grande échelle obtenus à partir d’expériences de séries chronologiques.

Une analyse R conviviale et puissante des ensembles de données à grande échelle

Analyse bactérienne expression génique par puces à ADN

Découvrez la surveillance des rythmes circadiens cellulaires par bioluminescence luciférase. Cette méthode utilise des vecteurs lentiviraux pour créer des lignées rapporteuses stables et non invasives.

Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l'expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

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