Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l'expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Ce protocole décrit la génération de lignées cellulaires rapporteuses exprimant la luciférase et la surveillance subséquente des rythmes circadiens autonomes au niveau cellulaire par détection de l'expression de bioluminescence. Commencez par construire des rapporteurs viraux lentiviraux exprimant la luciférase, puis produisez des particules lentivirales afin d'infecter les cellules d'intérêt et d'amplifier les cultures sélectionnées. Ensuite, surveillez l'expression de bioluminescence dans les cellules rapporteuses synchronisées à l'aide d'un dispositif d'enregistrement approprié.

En fin de compte, l'enregistrement de la bioluminescence est utilisé pour démontrer les rythmes circadiens cellulaires autonomes. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la transfection transitoire et la protection de la lignée germinale, est que l'intégration est médiée par un virus. Le gène assure une intégration stable dans le génome des cellules, ainsi qu'une efficacité et une polyvalence accrues.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur l'horloge circadienne. Par exemple, existe-t-il des horloges circadiennes spécifiques aux tissus ? Si oui, quelles sont les propriétés des horloges circadiennes spécifiques aux tissus ?

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mécanismes d'horloge, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes tels que la dynamique du cycle cellulaire, la tumorigenèse, etc. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons décidé d'étudier les horloges biologiques spécifiques aux tissus ou aux types cellulaires.

La procédure sera démontrée par le Dr Chita Norm Napkin, chercheuse postdoctorante, et Sandra, étudiante diplômée de mon laboratoire Atory. En général, un vecteur rapporteur circadien de mammifère contient une cassette d'expression dans laquelle un promoteur circadien est fusionné au gène de la luciférase. Dans ce vecteur rétroviral, la luciférase instable est placée sous le contrôle du promoteur murin per deux.

Pour des instructions détaillées sur la construction de vecteurs rapporteurs par réaction de recombinaison, consulter le manuscrit associé pour une transfection efficace. Commencer avec une culture de cellules rénales embryonnaires humaines de bas numéro de passage, présentant une confluence de 90 à 100 %. Ensuite, revêtir des plaques de culture à six puits.

Pour la transfection, ajouter un millilitre de poly-L-lysine à 0,001 % dans chaque puits, incuber 20 minutes à température ambiante, puis rincer une fois avec du PBS. Ensuite, récolter les cellules à l’aide de trypsine et semer les cellules dans chaque puits des plaques pré-enrobées. Agiter doucement les plaques afin d’obtenir une répartition uniforme des cellules.

Vérifiez que les cellules ensemencées ont atteint une confluence de 80 à 90 % dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Préparez le mélange de transfection plasmidique composé d'un plasmide rapporteur lentiviral, d'ADN et des trois vecteurs d'emballage comme témoin pour la transfection et l'infection ultérieure. Incluez un puits supplémentaire contenant un vecteur d'expression lentiviral de GFP qui porte la protéine fluorescente verte améliorée sous le contrôle du promoteur CMV.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de chlorure de calcium 0,25 molaire aux plasmides et mélangez soigneusement. Puis ajoutez 100 microlitres de solution deux XBBS et mélangez délicatement mais complètement. Incubez le mélange d'ADN à température ambiante pendant 15 minutes.

En attendant, remplacez le milieu des cellules 293T par deux millilitres de milieu frais. Replacez la plaque dans l'incubateur pendant au moins 10 minutes afin d'équilibrer le pH du milieu. Ensuite, ajoutez goutte à goutte le mélange de transfection aux cellules, agitez doucement la plaque, observez la formation de particules au microscope, puis placez les cellules dans l'incubateur pendant la nuit.

Environ 16 heures après la transfection, renouveler le milieu avec deux millilitres de DMEM frais et poursuivre la culture pendant la nuit. Ensuite, pour évaluer l'efficacité de la transfection, analyser l'expression de l'EGFP dans les cellules témoins de transfection. Une efficacité de transfection comprise entre 90 et 100 %, accompagnée d'une forte expression d'EGFP, constitue un indicateur fiable d'une bonne préparation virale.

Récupérez le milieu contenant les particules virales infectieuses sécrétées, centrifugez-le pour éliminer les cellules 293T résiduelles et recueillez le surnageant contenant le virus. Le troisième jour, semez environ 12 000 cellules 293T par puits dans une plaque de 12 puits, faites-les cultiver toute la nuit jusqu'à une confluence de 20 à 30 % et observez les cellules le jour quatre. Toujours le jour quatre, ajoutez de la polybrene au milieu recueilli contenant les particules virales et mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette.

Aspirez maintenant le milieu des trois puits T trois et ajoutez un millilitre de mélange viral par puits. Après avoir lavé les cellules une fois avec du PBS, incubez à 37 degrés Celsius pendant la nuit, puis renouvelez le milieu et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour favoriser la récupération et la croissance. Lorsque les cellules sont confluentes, divisez-les et cultivez-les pendant la nuit le jour suivant.

Pour commencer la sélection des cellules infectées, ajoutez du milieu frais contenant 10 microgrammes par millilitre. L'acide blastique devant être utilisé dans le kill car doit être déterminé empiriquement pour chaque lignée cellulaire. Renouvelez le milieu contenant de la blastine toutes les deux à trois semaines afin d'assurer une sélection continue des cellules résistantes à l'antibiotique.

Expression des capteurs d'horloge. Après avoir cultivé les cellules capteurs résistantes à la blastine dans des boîtes de culture de 35 millimètres jusqu'à confluence, nous préparons généralement trois boîtes ou plus pour chaque lignée cellulaire capteur sous chaque condition pour le phénotype sarcy. Après un lavage avec du PBS, ajouter le DMEM contenant 10 micromolaire de forline ou 200 nanomolaire de dexaméthasone et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure afin de synchroniser les cellules.

Maintenant, placez les cellules dans un milieu d'enregistrement fraîchement préparé. Recouvrez les boîtes de culture avec des lamelles stériles de 40 millimètres et scellez-les avec de la graisse à vide pour éviter l'évaporation. Placez les boîtes sur le luminomètre à cycle lumineux et démarrez l'enregistrement en temps réel de la bioluminescence.

Enregistrement pour l'enregistrement d'une plaque ancienne de 96 puits. Avec le GSR, deux dispositifs d'enregistrement, voir le manuscrit accompagnant. Nous enregistrons facilement le rythme pendant cinq à sept jours dans le programme d'analyse du cycle lumineux.

Ajustez d'abord une ligne de base aux données brutes. Ensuite, utilisez les données corrigées de la ligne de base pour les ajuster à une onde sinusoïdale et déterminer les paramètres requis pour les échantillons présentant des rythmes persistants. Une qualité d'ajustement aux données supérieure à 90 % est facilement atteinte grâce à une luminosité transitoire élevée.

Sens de montage vers le haut et changement du milieu. Nous excluons généralement le premier cycle de données de notre analyse pour la présentation des résultats. Représentez les données brutes en fonction du temps lorsque cela est nécessaire.

Tracer les données corrigées du bruit de fond afin de comparer l'amplitude et la phase, tant lors de la transfection transitoire de cellules 293T que lors de l'infection de lignées cellulaires. Les images fluorescentes des cellules exprimant la GFP après transfection et transduction indiquent que le système de transfert génique médié par un lentivirus est hautement efficace. La boucle de rétroaction centrale d'une horloge circadienne est constituée de facteurs transcriptionnels qui agissent sur les éléments enhanceurs circadiens afin de produire une expression génique rythmique.

Ici, quatre constructions rapporteuses différentes dans des cellules T trois produisent des phases distinctes d'expression du rapporteur. De nouvelles phases intermédiaires peuvent être générées par une régulation combinatoire impliquant plusieurs éléments circadiens, en utilisant une inhibition génique par ARNi et des composés pharmacologiquement actifs. Cet essai a utilisé le luminomètre lum cycle pour l'enregistrement de la bioluminescence des cellules placées dans des boîtes de 35 millimètres, avec des cellules U2 OS.

Un ARNi a été utilisé pour analyser les effets d'extinction des gènes cry1 et cry2. Ici, un luminomètre de synergie a été utilisé pour l'enregistrement de la bioluminescence des cellules, dans une plaque de 96 puits contenant trois types de cellules rapporteuses T3.

Des ARN ont été utilisés pour évaluer les effets de l'extinction triple sur les rythmes cellulaires. Dans cet exemple, le système UX et un luminomètre TECAN ont été utilisés pour l'enregistrement de la bioluminescence des cellules dans 3 plaques de 84. Alors que les plaques indiquées ont été sélectionnées, des petites molécules peuvent cibler pharmacologiquement et perturber la fonction protéique dans les rythmes cellulaires des cellules rapporteuses U2 OS.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la biologie circadienne afin d'explorer les mécanismes de l'horloge biologique et la physiologie dans différents types cellulaires et tissulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer des lignées cellulaires rapporteuses de luciférase et surveiller les rythmes d'expression.

Et n'oubliez pas que travailler avec le VIR peut présenter des risques extrêmement élevés, et que les précautions, telles que les protections individuelles et la décontamination virale, doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.