Surveillance de cellules autonomes Rythmes horloge circadienne de l'expression génique par Reporters Bioluminescence luciférase

Ce protocole détaille la génération de lignées cellulaires rapporteures de la luciférase et le suivi ultérieur des rythmes circadiens autonomes cellulaires de l’expression de la bioluminescence. Tout d’abord, construire des rapporteurs d’expression de la luciférase lentivirale et produire des particules lentivirales, infecter les cellules d’intérêt et amplifier les cultures sélectionnées. Ensuite, surveillez l’expression de la bioluminescence dans des cellules rapporteures synchronisées à l’aide d’un appareil d’enregistrement approprié.

En fin de compte, l’enregistrement de la bioluminescence est utilisé pour mettre en évidence les rythmes circadiens autonomes des cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transfection transitoire et la protection germinale est que la VIR est médiée. Le gène offre une intégration stable dans le génome des cellules, ainsi qu’une efficacité et une polyvalence accrues.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la recherche sur les horloges. Par exemple, existe-t-il des horloges circadiennes spécifiques aux tissus ? Si oui, quelles sont les propriétés des horloges circadiennes spécifiques aux tissus ?

Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les mécanismes d’horloge. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes tels que la dynamique du cycle cellulaire, la tumorgenèse, etc. Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons décidé d’étudier des horloges de sécurisation spécifiques à des tissus ou à des types de cellules.

La Dre Chita Norm Napkin, boursière postdoctorale, et Sandra, étudiante diplômée de mon laboratoire Atory, feront la démonstration de la procédure. Typiquement, une construction rapporteuse circadienne de mammifère contient une cassette d’expression dans laquelle un promoteur circadien est fusionné avec le gène luciférase. Chez ce rapporteur lentiviral, la luciférase déstabilisée est sous le contrôle de la souris par deux promoteurs.

Pour des instructions détaillées sur la construction de vecteurs rapporteurs par réaction de recombinaison, consultez le manuscrit ci-joint pour une transfection efficace. Commencez par une culture de cellules rénales embryonnaires humaines à faible nombre de passages qui sont confluentes à 90 à 100 %. Maintenant, pour enrober six plaques de culture.

Pour la transfection, ajoutez un millilitre de lycine à 0,001 % de poly L à chacun, incubez-le bien à température ambiante pendant 20 minutes et rincez une fois avec du PBS. Ensuite, récoltez les cellules à l’aide de trypsine et ensemencez les cellules dans chaque puits des plaques pré-enrobées. Faites tourner les plaques pour obtenir une répartition uniforme des cellules.

Vérifiez que les cellules ensemencées ont atteint une confluence de 80 à 90 % dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre. Préparez le mélange de transfection plasmidique composé d’un plasmide rapporteur lentiviral, d’ADN et des trois vecteurs d’emballage comme contrôle pour la transfection et l’infection subséquente. Inclure un puits supplémentaire pour un vecteur d’expression de la GFP lentivirale qui héberge la protéine fluorescente verte améliorée sous le contrôle du promoteur du CMV.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de chlorure de calcium à 0,25 molaire dans les plasmides et mélangez soigneusement. Ajoutez ensuite 100 microlitres de deux solutions XBBS et mélangez doucement mais soigneusement. Incuber le mélange d’ADN à température ambiante pendant 15 minutes.

Pendant ce temps, remplacez le milieu des 2 9 3 cellules T par deux millilitres de milieu frais. Remettez la plaque dans l’incubateur pendant au moins 10 minutes pour équilibrer le pH moyen. Ensuite, de manière goutte à goutte, ajoutez le mélange de transfection aux cellules, faites tourner doucement la plaque pour observer la formation des particules au microscope, puis placez les cellules dans un incubateur pendant la nuit.

Environ 16 heures après la transfection, réapprovisionnez le milieu avec deux millilitres de DMEM frais et cultivez pendant la nuit. Ensuite, pour évaluer l’efficacité de la transfection, évaluez l’expression de l’EGFP dans les cellules de contrôle de la transfection. Une efficacité de transfection de 90 à 100 % avec une expression élevée de l’EGFP est un prédicteur fiable d’une bonne préparation virale.

Récoltez le milieu contenant les particules virales infectieuses sécrétées, centrifugez pour éliminer les cellules T résiduelles 2, 9, 3 et collectez le virus contenant du supernat. Le troisième jour, ensemencez environ 12 003 T trois cellules sur une culture sur plaque de 12 puits pendant la nuit jusqu’à 20 à 30 % de fluidité et observez les cellules le quatrième jour. Toujours le quatrième jour, ajoutez du poly brain au milieu collecté contenant des particules virales et mélangez bien par pipetage.

Maintenant, aspirez le milieu des trois cellules T et ajoutez un millilitre de mélange viral par puits. Incubé à 37 degrés Celsius pendant la nuit après avoir lavé les cellules une fois avec du PBS, reconstituez le milieu et incubez les cellules à 37 degrés Celsius pendant la nuit pour la récupération et la croissance. Lorsqu’elles sont confluentes, les cellules sont divisées et cultivées pendant la nuit du lendemain.

Pour commencer la sélection des cellules infectées, ajoutez un milieu frais contenant 10 microgrammes par millilitre. Blastique mis à part, l’acide de blaste dans la voiture de destruction doit être déterminé empiriquement pour chaque lignée cellulaire. Réapprovisionnez le milieu contenant de la blastine tous les deux à trois jours pour une sélection continue des cellules résistantes aux antibiotiques.

Reporters d’horloge d’expression. Après avoir propagé la culture de cellules rapporteures résistantes aux blastines dans des boîtes de culture de 35 millimètres jusqu’à confluent, nous préparons généralement trois boîtes ou plus pour chaque lignée cellulaire rapporteure dans chaque condition de phénotype sarcy. Après un lavage avec du PBS, ajoutez du DMEM contenant 10 micromolaires de dexaméthasone incubée à 37 degrés Celsius pendant une heure pour synchroniser les cellules.

Placez maintenant les cellules dans un support d’enregistrement fraîchement préparé. Couvrez les boîtes de culture avec des lamelles stériles de 40 millimètres et scellez-les en place avec de la graisse sous vide pour éviter l’évaporation. Chargez les paraboles sur le luminomètre à cycle lumineux et démarrez la bioluminescence en temps réel.

Enregistrement Pour l’enregistrement de 96 vieille plaque. Avec le GSR deux appareils d’enregistrement, voir le manuscrit accomp. Nous enregistrons facilement le rythme pendant cinq à sept jours dans le programme d’analyse du cycle lum

La première référence correspond aux données brutes. Utilisez ensuite les données de base soustraites pour les ajuster à une onde sinusoïdale et déterminez les paramètres requis pour les échantillons qui présentent des rythmes persistants. Une qualité de pieds en l’air de données supérieure à 90 % est facilement obtenue en raison de la luminosité transitoire élevée.

Sens vers le haut et changement de moyen. Nous excluons généralement le premier cycle de données de notre analyse Pour la présentation des données. Tracez les données brutes en fonction du temps si nécessaire.

Tracez graphiquement les données de référence soustraites pour comparer l’amplitude et la phase dans la transfection transitoire de 2, 9 et 3 lymphocytes T et dans l’infection des lignées cellulaires. Des images fluorescentes des cellules exprimant la GFP transfectées et transduites indiquent que le système de distribution de gènes médié par le lentiviral est très efficace. La boucle de rétroaction centrale d’une horloge circadienne se compose de facteurs transcriptionnels qui agissent sur les éléments amplificateurs circadiens pour produire l’expression rythmique des gènes.

Ici, quatre constructions rapporteures différentes dans trois cellules T trois produisent des phases distinctes d’expression du rapporteur. De nouvelles phases intermédiaires peuvent être générées avec une régulation combinatoire par plusieurs éléments circadiens en utilisant l’inactivation de gènes via l’ARNi et des composés pharmacologiquement actifs. Cette expérience a utilisé le luminomètre à cycle lumique pour l’enregistrement de la bioluminescence de cellules dans des paraboles de 35 millimètres dans des cellules U2 OS.

Irna a été utilisé pour éclairer les effets de renversement des gènes cry one et cry two. Ici, un luminomètre de synergie a été utilisé pour l’enregistrement de la bioluminescence des cellules. Dans une plaque de 96 puits dans trois cellules rapporteures en T.

Les ARN ont été utilisés pour évaluer les effets de l’inactivation trine sur les rythmes cellulaires. Dans cet exemple, le système UX et un luminomètre tecan ont été utilisés pour l’enregistrement de la bioluminescence des cellules dans 3 84. Alors que les plaques indiquées sélectionnent, les petites molécules peuvent cibler pharmacologiquement et perturber la fonction des protéines dans les rythmes cellulaires des cellules rapporteures U2 OS.

Après son développement. Cette technique a ouvert la voie à la recherche dans le domaine de la biologie circadienne pour explorer les mécanismes de l’horloge et la physiologie de différents types de cellules et de tissus. Après avoir regardé cette vidéo, il devrait avoir une bonne compréhension de la façon de générer Lucifer, de rapporter les lignées cellulaires et de surveiller les volumes.

Et n’oubliez pas que travailler avec le VIR peut être extrêmement dangereux, et que les précautions, telles que les protections personnelles et la décontamination virale, doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.