Génération de l'homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Le protocole décrit comment générer efficacement des cellules souches pluripotentes induites humaines à partir de quatre millilitres de sang périphérique. Au jour zéro, isolez et mettez en culture les cellules mononucléées à partir de l'échantillon de sang périphérique. Transduisez les cellules primaires avec le vecteur de reprogrammation stem co.

Le neuvième jour, procéder à la mise en culture des cellules transduites sur des fibroblastes embryonnaires de souris inactivés, et cultiver pendant environ trois semaines. Sélectionner les colonies de type HESC pour l'expansion et la caractérisation. Résultats de la coloration par immunofluorescence pour l'expression de marqueurs de pluripotence tels que SS EEA quatre, trial one 60 et trial 180 1.

Démontrer la génération efficace de cellules souches pluripotentes induites humaines. L'utilisation du vecteur antiviral de cellules souches pour produire des cellules souches pluripotentes induites humaines présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes existantes. Le plus attrayant est sans doute la simplicité globale de l'approche, qui nécessite un accès facile à un tissu donneur, et par là, j'entends des échantillons facilement obtenus de sang périphérique.

Les attributs les plus importants de cette méthode sont l'efficacité de la reprogrammation et la qualité des clones de cellules IPS obtenus. La procédure sera démontrée par Andrea January Summer, chercheuse postdoctorale dans mon laboratoire, et Sarah Rozelle, étudiante diplômée dans le laboratoire de George Murphy. Tout cela le jour zéro.

Prélevez quatre millilitres de sang périphérique dans un tube vacutainer pour la préparation cellulaire contenant du citrate de sodium. Inversez le tube de huit à dix fois dans les deux heures suivant le prélèvement. Centrifugez l'échantillon à 1 800 G pendant 30 minutes à température ambiante afin de recueillir les cellules mononucléées.

Aspirez le plasma et prélèvez la couche de leucocytes située entre la barrière de gel et le plasma. Transférez la couche de leucocytes dans un tube conique stérile de 15 millilitres et complétez le volume à 10 millilitres avec du PBS stérile. Retournez les tubes plusieurs fois, puis centrifugez à 300 ×g pendant 15 minutes.

Resuspendre le culot cellulaire dans 10 millilitres de PBS stérile, effectuer un dénombrement cellulaire, puis transférer un à deux fois 10⁶ cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres. Récupérer les cellules par centrifugation et resuspendre le culot dans 2 millilitres de milieu d'expansion. Ensuite, ensemencer les cellules mononucléées isolées dans un puits d'une plaque de 12 puits et cultiver à 37 °C et 5 % de dioxyde de carbone.

Récupérez les cellules restantes par centrifugation et congelez des stocks d’environ deux fois 10 à la puissance six cellules par flacon dans du FBS contenant 10 % de DMSO aux jours trois et six. Transférez les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres et lavez la cavité une fois avec un millilitre de milieu pour cellules souches QBSF 60. Pour collecter les cellules adhérentes.

Récupérez les cellules par centrifugation, resuspendez le culot cellulaire dans deux millilitres de milieu EM. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un puits d'une plaque 12 puits et remettez la culture à l'incubateur au jour 9. Transférez les cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres et lavez le puits une fois avec un millilitre de milieu de cellules souches QB SF 60 afin de récupérer les cellules adhérentes. Centrifugez la culture à 300 ×g pendant 10 minutes.

Ensuite, resuspendre le culot cellulaire dans un millilitre de milieu d'électroporation (EM) frais contenant cinq microgrammes par millilitre de polybrène et de lentivirus STEM pour un MOI compris entre un et 10. Transférer ensuite la suspension dans un puits d'une plaque de 12 puits et centrifuger à 2 250 tr/min pendant 90 minutes à 25 degrés Celsius. Ajouter un millilitre supplémentaire de milieu EM frais contenant cinq microgrammes par millilitre de polybrène, pour un volume total de deux millilitres de milieu EM, puis placer la plaque dans l'incubateur de culture cellulaire au jour 10.

Après avoir récolté les cellules comme indiqué précédemment, resuspendre le culot cellulaire dans deux millilitres de milieu de culture EM. Les cellules transduites d'un puits d'une plaque de 12 puits au jour 11 recouvrent les puits d'une plaque de 6 puits avec de la gélatine à 0,1 %, puis ensemencer des fibroblastes embryonnaires de souris inactivés à deux fois 10 à la puissance 5 cellules par puits dans un milieu meth. Préparer trois puits par infection.

Le lendemain, récolter les cellules mononucléées transduites comme indiqué précédemment. Après centrifugation, resuspendre le culot cellulaire dans trois millilitres de milieu méthylcellulose contenant le BFGF, l'acide ascorbique et les facteurs de croissance.

Aspirez maintenant le milieu du plateau MES, un millilitre des CM par puits de OFM. Ajoutez ensuite 1,5 millilitre de milieu de méthylcellulose complet et centrifugez le plateau à 500 tr/min à 25 degrés Celsius pendant 30 minutes. Incubez ensuite à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours à partir du jour 14.

Renouvelez le milieu tous les deux jours avec 2,5 millilitres de milieu méthylcellulose contenant 10 nanogrammes par millilitre de BFGF et 50 microgrammes par millilitre d'acide ascorbique, mais sans facteurs de croissance. Vers le jour 20, une fois que de petites colonies apparaissent, nourrissez les cellules quotidiennement avec deux millilitres de milieu pour cellules souches embryonnaires humaines entre les jours 30 et 40. Prélèvez chaque colonie et transférez-la dans des puits individuels d'une plaque de 12 puits préalablement ensemencée avec des cellules nourricières inactivées, contenant un millilitre de milieu HESC supplémenté d'un inhibiteur de ROCK ; nourrissez les cellules quotidiennement.

Par la suite, avec un millilitre de milieu HESC sans l'inhibiteur ROCK, les cellules souches pluripotentes dérivées des monocytes humains sont désormais prêtes pour la coloration immunofluorescente des marqueurs de pluripotence, ainsi que pour l'excision de la cassette d'induction intégrée. Au cours de ce protocole, les cellules subissent plusieurs changements morphologiques, allant des P BMCs à la génération des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC). Au jour zéro, les cellules mononucléées isolées du sang périphérique sont cultivées en milieu d'expansion après neuf jours.

Des grappes de raisin, semblables à des agrégats de cellules, sont observées, suggérant que les cellules sont saines et en prolifération avant la transduction. Vers le jour 21, une semaine après que les cellules ont été ensemencées sur les matrices d'adhérence, des colonies se forment. Au jour 30, les colonies de CIP montrent une morphologie typique de cellules souches embryonnaires humaines.

Cette analyse d'immunofluorescence d'IPCs générées à partir de PBMC montre l'expression des marqueurs de pluripotence SSEA-4, TRA-1-60 et TRA-1-81. Les iPSC présentent également une coloration positive pour la phosphatase alcaline. Ces images illustrent les étapes de génération d'IPCs sans transgène par transfection avec un plasmide coexprimant la recombinase CRE et un gène de résistance à la puromycine, comme décrit par Summers et al. en 2010. Par rapport aux IPCs avant transfection, une mort cellulaire est observée.

Après deux jours de sélection à la purmycine, de nouvelles colonies émergent des cellules résistantes environ 10 jours après la transfection. Des analyses Southern sur sang des colonies sélectionnées confirment l'excision du transgène. Les bandes 1, 3, 5 et 7 montrent la présence du transgène dans les clones d'iPS avant excision. Ces bandes sont absentes sur les bandes 2, 4, 6 et 8 après l'excision du transgène. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de générer de manière reproductible et robuste des cellules iPS humaines de haute qualité, normales ou spécifiques à une maladie, à partir de faibles quantités de sang périphérique provenant de n'importe quel individu.

Cette approche simplifie le processus de reprogrammation des cellules souches, le rendant largement accessible à la communauté des cellules souches. En même temps, elle fournit une base pour la génération de populations de lignées de cellules souches plus homogènes.